一种自然杀伤细胞的体外大规模扩增方法
【专利摘要】本发明公开了一种自然杀伤细胞的体外大规模扩增方法，该方法包括以下步骤：采集、分离外周血单个核细胞；自然杀伤细胞分选；自然杀伤细胞的培养；自然杀伤细胞的收集。本发明利用免疫磁珠分选自然杀伤细胞，建立操作简单，综合效率更高，在体外扩增免疫磁珠法分选的NK细胞，是现有扩增方法效果的2?3倍，在自然杀伤细胞的体外大规模扩增领域具有巨大的应用价值。
【专利说明】
一种自然杀伤细胞的体外大规模扩増方法
技术领域
[0001]本发明涉及免疫细胞治疗技术领域，具体涉及一种人类细胞的培养方法。
【背景技术】
[0002]自然杀伤细胞(NK细胞)体外大规模扩增法是自体免疫细胞治疗领域中体外扩增满足临床需求的NK细胞的一种工艺，该方法主要通过采集供者外周血分离单个核细胞，在体外培养环境中利用无血清培养基进行培养，并添加多种所需的细胞因子，从而达到NK细胞大规模扩增的目的。
[0003]NK细胞大规模扩增法在免疫细胞治疗领域中已有大量的研究和应用，因为NK细胞的扩增效率、扩增后纯度及功效直接影响了 NK细胞治疗的效果，所以尽可能高的扩增效率和纯度是业内所追求的重要指标。因为NK细胞在体外很难大规模扩增，为得到满足临床需求的NK细胞数量(>2 X 19个)，现有技术主要分为两种:1.使用滋养层细胞(feedercells)与⑶34阳性的造血祖细胞一起培养，在细胞因子的诱导下最终分化为NK细胞。2.采用免疫磁珠对单个核细胞进行分选，分选后的细胞具有NK细胞的表型，再进行体外扩增。
[0004]现有技术中的NK细胞体外扩增方法中，若采用和滋养层细胞一起培养的方案，由于在培养过程中引入了其他种类的细胞(以肿瘤细胞为主)，虽经过致死剂量的γ -射线照射，但无疑在生产过程中引入了污染的风险;并且，如果发生存活的滋养层细胞随NK细胞一起进入人体，就会严重威胁生命安全;另外，这种工艺操作繁琐，成本较高。除此之外，现有技术还有采用免疫磁珠对单个核细胞进行NK细胞分选后再扩增的方法，这种方法分离出的NK细胞虽然纯度较高，但因为缺乏成熟的分选后体外培养工艺，所以很难在体外扩增，无法满足临床回输所需的细胞数量。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种自然杀伤细胞(NK细胞)在体外的大规模扩增方法，建立操作简单，综合效率更高的NK细胞体外扩增工艺。该方法可以用于在体外高效扩增免疫磁珠法分选的NK细胞。
[0006]本发明一种自然杀伤细胞的体外大规模扩增方法，其包括以下步骤:
[0007]一、采集、分离外周血单个核细胞(PBMC);
[0008]二、自然杀伤细胞的分选；
[0009]三、自然杀伤细胞的培养；
[0010]四、自然杀伤细胞的收集；
[0011 ]所述步骤三的自然杀伤细胞的培养包括以下步骤:
[0012]I)用注射用生理盐水配制抗⑶3(0ΚΤ_3)单抗，抗⑶28单抗，重组人纤维连接蛋白(Recombinant Human Fibronectin)，加至I个T175培养瓶中，在4°C下放置 12h;
[0013]2)将1\107?2\107个细胞接种至1175培养瓶，加入了551培养基401^，然后加入白细胞介素-2、白细胞介素-15、白细胞介素-21、L-谷氨酰胺和自体血清，置于二氧化碳浓度为5 %培养箱中37 °C条件下培养；
[0014]3)待细胞数目达到T175培养瓶容积的80%以上后，将细胞转移至3个T175培养瓶中培养，补充T551培养基至每瓶40mL，按照步骤2)中的终浓度加入白细胞介素_2、白细胞介素-15、白细胞介素-21、L-谷氨酰胺和自体血清；
[0015]4)待细胞数目达到T175培养瓶容积的80%以上后，将培养瓶中的细胞转移至细胞培养袋培养，补充T551培养基至500mL，按照步骤2)中的终浓度加入白细胞介素_2、白细胞介素-15、白细胞介素-21、L-谷氨酰胺和自体血清；
[0016]5)2?4天后，补充T551培养基至IL，按照步骤2)中的终浓度加入白细胞介素_2、白细胞介素-15、白细胞介素-21、L-谷氨酰胺和自体血清；
[0017]6)2?4天后，按照步骤2)中的终浓度加入白细胞介素-2、白细胞介素-15、白细胞介素-21、L-谷氨酰胺和自体血清；
[0018]7)继续培养2?4天(此时细胞数量大于2 X 19个)，即完成自然杀伤细胞的培养；
[0019]所述步骤三的步骤I)中抗⑶3单抗的浓度为5ug/mL;抗⑶28单抗的浓度为0.5ug/mL;重组人纤维连接蛋白的浓度为50ug/mL;
[0020]所述步骤三的步骤2)中T551培养基为康宁公司(Corning)产品；
[0021]所述步骤三的步骤2)中加入白细胞介素-2的终浓度为400IU/mL，白细胞介素-15的终浓度为40ng/mL，白细胞介素-21的终浓度为10ng/mL，L-谷氨酰胺的终浓度为2mM(lmM= lmmol/L)，自体血清的最终体积百分比为5% ；
[0022]所述步骤四的自然杀伤细胞的收集包括以下步骤:
[0023]I)对步骤三中培养获得的自然杀伤细胞进行无菌检测、内毒素检测和流式免疫表型检测；
[0024]2)将步骤I)中检测后的自然杀伤细胞连同培养液400g离心lOmin，弃上清；
[0025]3)用1mL无菌生理盐水重悬步骤2)离心得到的细胞，完全吹散细胞团块，混匀，细胞计数；
[0026]4)用40?50mL无菌生理盐水洗涤细胞，400g离心1min，重复2?3次后，用无菌生理盐水重悬细胞，使细胞含量为2 X 1MVmL ；
[0027]5)将步骤4)中的细胞悬液经细胞筛网过滤，转移至无菌输液袋或输液瓶中，并加人血白蛋白，混勾，即完成自然杀伤细胞的收集;加入人血白蛋白后人血白蛋白的最终体积百分比为5 %。
[0028]优选的，所述步骤一中采集外周血单个核细胞包括以下步骤:
[0029]I)抽取供者静脉血80?I OOmL，加入抗凝剂；
[°03°] 2)将步骤I)中加入抗凝剂的静脉血以2000rpm离心lOmin，吸取上层血楽层，56°C水浴灭活30min;以4000rpm离心…!^!!，吸取上清^^保存备用；
[0031]3)以无菌生理盐水按体积比为1:1稀释步骤2)中得到的上清，充分混匀;将稀释后的上清缓慢加入淋巴细胞分离液中，水平离心；所述水平离心的转速为2000rpm，时间为30min；
[0032]4)吸取血浆层转移至废液缸，向红细胞层之上液体中加入无菌生理盐水，混匀，水平离心;所述水平离心的转速为2000rpm，时间为12min，室温；
[0033]5)将步骤4)中离心所得沉淀用无菌生理盐水重悬后，水平离心；所述水平离心的转速为2000rpm，时间为12min;
[0034]6)将步骤5)中离心所得沉淀用2?4mL分选缓冲液重悬，进行细胞计数；
[0035]所述步骤3)中淋巴细胞分离液的体积与稀释后的上清的体积相同；
[0036]所述步骤4)中加入无菌生理盐水的体积与红细胞层之上所有液体的体积相同；
[0037]所述步骤6)中的分选缓冲液为PBS+2%自体血清+2mM EDTA。
[0038]优选的，所述采集外周血单个核细胞的步骤I)中抗凝剂为肝素或者枸橼酸钠。
[0039]优选的，所述采集外周血单个核细胞的步骤I)中抗凝剂为肝素。
[0040]优选的，所述步骤二中自然杀伤细胞(NK细胞)分选包括以下步骤:
[0041]I)调整外周血单个核细胞(PBMC)悬液的细胞浓度为5X 17?I X 18个/mL;
[0042]2)将步骤I)中的细胞悬液加入5mL的分选管中，加入Human NK CELL enrichmentkit，混合均匀后室温静置1min;
[0043]3)加入Stemcell EasySep Magnet particles，混合均勾后室温静置5min;
[0044]4)将分选管中液体补足至2.5mL，用移液枪轻柔的吹打2?3次，将分选管放入磁场中2.5min;
[0045]5)将分选管中液体一次性倒入新的管中；
[0046]6)细胞计数，流式细胞仪分析细胞表型，⑶3-，⑶56+细胞比例在90 %以上；
[0047]所述步骤2)中每毫升细胞悬液中加入50uL Human NK CELL enrichment kit；
[0048]所述步骤2)中每毫升细胞悬液中加入10uL Stemcel I EasySep Magnetparticles。
[0049]优选的，所述步骤二的步骤I)中PBMC悬液的量为250uL?2mL。
[0050]本发明方法具有如下优点:
[0051]1.本发明的方法主要解决了利用免疫磁珠分选自然杀伤细胞后体外扩增效率低下的问题，最终可得到至少2 X 19个细胞，扩增倍数大于200倍，相比于其他方法提高了2-3倍。
[0052]2.本发明的方法得到的NK细胞至少有95 % (94.86 ± 2.35% )以上具有NK细胞的表型(CD3-，⑶16+，⑶56+)，纯度高于其他扩增方法所得NK细胞(纯度在50 %-85 %之间)；并且在体外对白血病K562细胞的杀伤效率高于60%，具有良好的分泌γ-干扰素，穿孔素及颗粒酶的特性。
[0053]3.本发明的方法得到的NK细胞在体外对白血病细胞Κ562细胞株的杀伤率为91.2±3.44% (效靶比为10:1)和71.3±2.71% (效靶比为5:1)，杀伤效果优于其他细胞扩增方法所得NK细胞(杀伤率在40 % -60 %之间)；本发明方法得到的NK细胞对人胰腺癌细胞PANC-1细胞株的杀伤率为57.97±2.91% (效靶比为10:1)和41.33±2.23% (效靶比为5:1)，杀伤效果优于其他细胞扩增方法所得NK细胞(杀伤率在20%-30%之间)。
[0054]4.本发明的方法得到的NK细胞分泌γ -干扰素的水平为310±28pg/ml，优于其他细胞扩增方法所得NK细胞(T -干扰素分泌水平为100-250pg/ml之间)。
【附图说明】
[0055]图1为本发明方法制得的NK细胞表型鉴定结果图；
[0056]图2为本发明方法制得的NK细胞对K562细胞株的杀伤效果；
[0057]图3为本发明方法制得的NK细胞对人胰腺癌细胞PANC-1细胞株杀伤效果。
【具体实施方式】
[0058]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0059]实施例1
[0060]本实施例的自然杀伤细胞的体外大规模扩增方法，按以下步骤进行:
[0061 ] I采集供者的外周血单个核细胞(PBMC)。
[0062]直接抽取供者静脉血80?100mL，加入抗凝剂一一肝素；
[0063]2.分离 PBMC
[0064]2.1室温2000rpm离心十分钟，小心吸取上层血浆层，56度水浴锅灭活30min，4000rpm离心10111；[11，小心吸取上清4<€保存备用。
[0065]2.2以无菌生理盐水按1:1的比例稀释患者血标本，减少PBMC损失。充分混匀后，按1:1的比例将血标本缓慢加入预先盛入淋巴细胞分离液的50mL离心管中。
[0066]2.3 水平离心:转速2000rpm，30min。
[0067]2.4离心完毕，吸取血浆层转移至废液缸，直至距白膜层5mm处。小心将红细胞层之上的所有液体转移至50mL无菌离心管中，补充等体积的无菌生理盐水，混匀。
[0068]2.5 水平离心:转速2000rpm，12min，RT。
[0069]2.6吸取上清，无菌生理盐水重悬沉淀，水平离心，转速2000rpm，12min。
[0070]2.7尽量吸尽上清，用2-4mL分选缓冲液重悬，进行细胞计数(分选缓冲液为PBS+2%自体血清+2mM EDTA)。
[0071]3 NK细胞分选
[0072]3.1调整细胞浓度为5 X 17个/mL(总体积在250uL-2mL之间)，总共可分选不超过IX 18个；
[0073]3.2将细胞悬液加入511^的分选专用管中，加入50111711^ Human NK CELLenrichment kit，混合均勾后室温静置1min;
[0074]3.3加入Stemcell EasySep Magnet particles 100uL/mL，混合均勾后室温静置5min；Human NK CELL enrichment kit和Stemcell EasySep Magnet particles均为Stemcel I公司产品
[0075]3.4将管中液体补足至2.5mL，用移液枪轻柔的吹打2-3次，将分选管放入磁场中2.5min；
[0076]3.5将管中液体一次性倒入新的管中；
[0077]3.6细胞计数，流式细胞仪分析细胞表型，⑶3-，⑶56+细胞比例为94.86 % (如图1所示)。
[0078]4 NK细胞培养
[0079]4.1第-1天:用注射用生理盐水配制0)3(01(1'-3)单抗(51^/1^)<028单抗(0.51^/mL)，重组人纤维连接蛋白(Recombinant Human Fibronectin) (50ug/mL)，加至I个T175培养瓶中，4°C放置12h;
[0080]4.2第O天:将I X 107?2\107个细胞接种至1175培养瓶，加入了551培养基401^，白细胞介素_2(400IU/mL)，白细胞介素_15(40ng/mL)，白细胞介素-21 10ng/mL，L_谷氨酰胺2mM，5 %自体血清，置于二氧化碳浓度为5 %的培养箱中37 °C培养，并填写初次培养记录。其中，T551培养基为康宁公司(Corning)产品。
[0081 ] 4.3观察细胞:细胞开始培养后应该定期观察不同视野下的细胞，主要观察其形态、数目及其增殖情况、细胞碎片和杂质等，并填写观察记录。细胞数目达到80%以上进行下一步。
[0082]4.4第3天:将细胞转移至3个T175培养瓶中培养，补充培养液至每瓶40mL，全量补充所有细胞因子和血清。
[0083]4.5第7天:观察细胞生长状态，把瓶子中的细胞转移至细胞培养袋培养，补充培养液至500mL，全量补充所有细胞因子和血清。取样进行真菌检测并留样。
[0084]4.6第10天:观察细胞生长状态，补充培养液至1L，全量补充所有细胞因子和血清。
[0085]4.7第11天:观察细胞生长状态，取样进行细菌检测并留样。
[0086]4.8第13天:观察细胞生长状态，全量补充所有细胞因子和血清。
[0087]4.9第16天:观察细胞生长状态，收获全部细胞。
[0088]5.NK细胞的收集
[0089]5.1收集前对培养细胞进行无菌检测，内毒素检测和流式免疫表型检测。
[0090]5.2收集细胞:将收集的细胞转移入50mL离心管中离心400g，1min，弃上清；
[0091 ] 5.3用1mL无菌生理盐水重悬细胞，完全吹散细胞团块，混匀，细胞计数；
[0092]5.4用40?50mL无菌生理盐水洗涤细胞，离心400g，1min，重复2?3次，细胞悬液总体积为10mL，此时细胞总量不低于2 X 19;
[0093]10.5将细胞悬液经细胞筛网(100目)过滤一次，转移至无菌输液袋或输液瓶中，并加5%人血白蛋白，即制得自然杀伤细胞。
[0094]实施例2
[0095]本实施例的自然杀伤细胞的体外大规模扩增方法，与实施例1的不同之处在于:步骤I中采集的静脉血中加入的抗凝剂为枸橼酸钠;步骤2.4中使用的离心管为250mL的容量；步骤4.4在第4天进行;步骤4.5在第6天进行;步骤4.6在第9天进行;步骤4.8在第12天进行；步骤4.9在第15天进行。
[0096]对以上实施例中获得的自然杀伤细胞对白血病细胞K562细胞株和人胰腺癌细胞PANC-1细胞株的杀伤率进行测定，结果如图2、图3所示，可知，本发明方法得到的NK细胞在体外对白血病细胞K562细胞株的杀伤率为91.2 ±3.44% (效靶比为10:1)和71.3 ± 2.71 %(效靶比为5:1)，杀伤效果优于其他细胞扩增方法所得NK细胞(杀伤率在40%-60%之间)；本发明方法得到的NK细胞对人胰腺癌细胞PANC-1细胞株的杀伤率为57.97 ± 2.91 % (效靶比为10:1)和41.33 ± 2.23% (效靶比为5:1)，杀伤效果优于其他细胞扩增方法所得NK细胞(杀伤率在20%-30%之间)。
[0097]采用ELISA方法对本发明的方法得到的NK细胞分泌γ-干扰素的水平进行测定。本发明的方法得到的NK细胞分泌γ -干扰素的水平为310±28pg/ml，优于其他细胞扩增方法所得NK细胞(γ -干扰素分泌水平为100-250pg/ml之间)。
[0098]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1.一种自然杀伤细胞的体外大规模扩增方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤: 一、采集、分离外周血单个核细胞； 二、自然杀伤细胞分选； 三、自然杀伤细胞的培养； 四、自然杀伤细胞的收集； 所述步骤三的自然杀伤细胞的培养包括以下步骤: 1)用注射用生理盐水配制抗⑶3单抗，抗⑶28单抗，重组人纤维连接蛋白，加至I个T175培养瓶中，在4°C下放置12h; 2)将1\107?2\107个细胞接种至1175培养瓶，加入了551培养基401^，然后加入白细胞介素-2、白细胞介素-15、白细胞介素-21、L-谷氨酰胺和自体血清，置于二氧化碳浓度为5%培养箱中37 °C条件下培养； 3)待细胞数目达到T175培养瓶容积的80%以上后，将细胞转移至3个T175培养瓶中培养，补充T551培养基至每瓶40mL，按照步骤2)中的终浓度加入白细胞介素_2、白细胞介素-15、白细胞介素-21、L-谷氨酰胺和自体血清； 4)待细胞数目达到T175培养瓶容积的80%以上后，将培养瓶中的细胞转移至细胞培养袋培养，补充T551培养基至500mL，按照步骤2)中的终浓度加入白细胞介素_2、白细胞介素-15、白细胞介素-21、L-谷氨酰胺和自体血清； 5)2?4天后，补充T551培养基至1L，按照步骤2)中的终浓度加入白细胞介素-2、白细胞介素-15、白细胞介素-21、L-谷氨酰胺和自体血清； 6)2?4天后，按照步骤2)中的终浓度加入白细胞介素-2、白细胞介素-15、白细胞介素-21、L-谷氨酰胺和自体血清； 7)继续培养2?4天，即完成自然杀伤细胞的培养； 所述步骤三的步骤I)中抗⑶3单抗的浓度为5ug/mL;抗⑶28单抗的浓度为0.5ug/mL;重组人纤维连接蛋白的浓度为50ug/mL; 所述步骤三的步骤2)中加入白细胞介素-2的终浓度为400IU/mL，白细胞介素-15的终浓度为40ng/mL，白细胞介素_21的终浓度为10ng/mL，L-谷氨酰胺的终浓度为2mM，自体血清的最终体积百分比为5%; 所述步骤四的自然杀伤细胞的收集包括以下步骤: 1)对步骤三中培养获得的自然杀伤细胞进行无菌检测、内毒素检测和流式免疫表型检测； 2)将步骤I)中检测后的自然杀伤细胞连同培养基400g离心lOmin，弃上清； 3)用1mL无菌生理盐水重悬步骤2)离心得到的细胞，完全吹散细胞团块，混匀，细胞计数； 4)用40?50mL无菌生理盐水洗涤细胞，400g离心1min，重复2?3次后，用无菌生理盐水重悬细胞，使细胞含量为2 X I OMVmL; 5)将步骤4)中的细胞悬液经细胞筛网过滤，转移至无菌输液袋或输液瓶中，并加人血白蛋白，混勾，即完成自然杀伤细胞的收集;加入人血白蛋白后人血白蛋白的最终体积百分比为5%。2.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞的体外大规模扩增方法，其特征在于，所述步骤一中采集外周血单个核细胞包括以下步骤: 1)抽取供者静脉血80?10mL，加入抗凝剂； 2)将步骤I)中加入抗凝剂的静脉血以2000rpm离心1min，吸取上层血楽层，56°C水浴30min;以4000rpm离心…!^!!，吸取上清^^保存备用； 3)以无菌生理盐水按体积比为1:1稀释步骤2)中得到的上清，充分混匀；将稀释后的上清缓慢加入淋巴细胞分离液中，水平离心;所述水平离心的转速为2000rpm，时间为30min； 4)吸取血浆层转移至废液缸，向红细胞层之上的液体中加入无菌生理盐水，混匀，水平离心;所述水平离心的转速为2000rpm，时间为12min; 5)将步骤4)中离心所得沉淀用无菌生理盐水重悬后，水平离心;所述水平离心的转速为 2000rpm，时间为 12min; 6)将步骤5)中离心所得沉淀用2?4mL分选缓冲液重悬，进行细胞计数； 所述步骤3)中淋巴细胞分离液的体积与稀释后的上清的体积相同； 所述步骤4)中加入无菌生理盐水的体积与红细胞层之上所有液体的体积相同； 所述步骤6)中的分选缓冲液为加入自体血清和EDTA的PBS，其中自体血清的最终体积百分比为2%，EDTA的终浓度为2mM。3.根据权利要求2所述的自然杀伤细胞的体外大规模扩增方法，其特征在于:所述采集外周血单个核细胞的步骤I)中抗凝剂为肝素或者枸橼酸钠。4.根据权利要求2所述的自然杀伤细胞的体外大规模扩增方法，其特征在于:所述采集外周血单个核细胞的步骤I)中抗凝剂为肝素。5.根据权利要求1所述的自然杀伤细胞的体外大规模扩增方法，其特征在于，所述步骤二中自然杀伤细胞分选包括以下步骤: 1)调整外周血单个核细胞悬液的细胞浓度为5X 17?I X 18个/mL; 2)将步骤I)中的细胞悬液加入5mL的分选管中，加入HumanNK CELL enrichment kit，混合均匀后室温静置1min; 3)加入StemcellEasySep Magnet particles，混合均勾后静置5min;4)将分选管中液体补足至2.5mL，用移液枪吹打2?3次，将分选管放入磁场中2.5min; 5)将分选管中液体一次性倒入新的管中，新管中即为分选到的自然杀伤细胞； 所述步骤2)中每毫升细胞悬液中加入50uL Human NK CELL enrichment kit； 所述步骤2)中每毫升细胞悬液中加入10uL Stemcell EasySep Magnet particles。6.根据权利要求5所述的自然杀伤细胞的体外大规模扩增方法，其特征在于:所述步骤二的步骤I)中PBMC悬液的量为250uL?2mL。
【文档编号】C12N5/0783GK106011061SQ201610639438
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年8月4日
【发明人】刘爽, 张青
【申请人】广东省第二人民医院