一种人正常前列腺上皮神经内分泌亚型细胞系的建立方法
【专利摘要】本发明公开了一种人正常前列腺上皮神经内分泌亚型细胞系的建立方法，包括NHPrE1细胞系的培养、神经内分泌亚型细胞NTU2分离和纯化、NTU2细胞的扩增、NTU2细胞克隆化、NTU2细胞体外鉴定、NTU2细胞体内鉴定等步骤。本发明本细胞系(NTU2)的建立为前列腺神经内分泌细胞(NEC)的功能研究；神经内分泌细胞在前列腺癌发生和发展中肿瘤生物学作用及其与肿瘤细胞相互分子作用的研究；以及激素非依赖型前列腺癌(CRPC)的新药筛选开发研究提供基础实验材料。
【专利说明】
一种人正常前列腺上皮神经内分泌亚型细胞系的建立方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种人正常前列腺上皮神经内分泌亚型细胞系的建立方法。【背景技术】
[0002]神经内分泌细胞(NEC)是目前公认的终末分化细胞，是肺癌、胃肠道癌和前列腺癌等肿瘤中常见的细胞类型。具有抗放、化疗的特征。其终末分化特性制约了其在体外的基础研究及新药筛选等应用研究的开展。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于为前列腺癌去激素治疗后前列腺癌组织内细胞的神经内分泌化导致的前列腺癌抗放、化疗的研究，以及相关新药的筛选、开发等研究，提供基础实验材料的人正常前列腺上皮神经内分泌亚型细胞系的建立方法。
[0004]本发明的技术解决方案是:一种人正常前列腺上皮神经内分泌亚型细胞系(本细胞系是
【申请人】建立的细胞系，缩写为NTU2)的建立方法，其特征是:包括下列步骤:(1)NHPrEl细胞系的培养:1:1 DMEM/F12,加5% FBS液，1% ITS，5ng/mL EGF，50ng/mL BPE;于5% C02，37 °C培养;2 — 3天换液一次，1:3-4传代；(2)神经内分泌亚型细胞NTU2分离:将NHPrEl细胞培养物用胰蛋白酶消化后，1000 RPM 离心收集细胞，IX PBS洗涤三次后，用3% BSA于4°C封闭20分钟;加入1:50鼠抗人ChG A抗体 (sigma)，4°C孵育30分钟后，用IX PBS洗涤三次;加入羊抗鼠磁珠抗体，4°C孵育30分钟后， 用mini MACS ? Separator进行细胞分离；(3)NTU2细胞的扩增:将分离所得阳性细胞用1:1 DMEM/F12培养液，加5% FBS，1% ITS， 5ng/mL EGF，50ng/mL BPE;于5% C02,37°C培养;每3天换液一次；(4)NTU2细胞克隆化:将扩增NTU2细胞用1:1 DMEM/F12培养液，加5% FBS，1% ITS，5ng/ mL EGF，50ng/mL BPE;按0.5个细胞/孔接种至96孔板;每3天换液一次，生长成单细胞克隆后转入培养瓶用上述培养基进行扩增；(5)NTU2细胞体外鉴定:14mm圆型盖玻片用多聚赖氨酸包被后放入24孔板，接种NTU2细胞，生长至60 —70%密度后，多聚甲醛固定，PBS充分洗涤后，分别用神经内分泌细胞标志分子抗体ChG A和Syn进行细胞免疫化学分析；(6)NTU2细胞体内鉴定:NTU2细胞按20%比例分别与PC-3和DU145细胞混合后，应用组织重组方法分别种植至裸鼠肾包膜下；成瘤后取出瘤体，多聚甲醛固定，石腊包埋切片，用神经内分泌标志分子进行免疫荧光组织化学分析。
[0005]本发明NTU2细胞系用于前列腺神经内分泌细胞(NEC)的功能研究。用于神经内分泌细胞在前列腺癌发生和发展中肿瘤生物学作用及其与肿瘤细胞相互分子作用的研究。用于激素非依赖型前列腺癌(CRPC)的新药筛选开发研究。
[0006]本发明本细胞系(NTU2)的建立为前列腺神经内分泌细胞(NEC)的功能研究、神经内分泌细胞在前列腺癌发生和发展中肿瘤生物学作用及其与肿瘤细胞相互分子作用的研究、以及激素非依赖型前列腺癌(CRPC)的新药筛选开发研究提供基础实验材料。
[0007]下面结合实施例对本发明作进一步说明。【具体实施方式】
[0008]一种人正常前列腺上皮神经内分泌亚型细胞系(NTU2)的建立方法，包括下列步骤:(1)NHPrEl细胞系的培养:1:1 DMEM/F12,加5% FBS液，1% ITS，5ng/mL EGF，50ng/mL BPE;于5% C02，37 °C培养;2 — 3天换液一次，1:3-4传代；(2)神经内分泌亚型细胞NTU2分离:将NHPrEl细胞培养物用胰蛋白酶消化后，1000 RPM 离心收集细胞，IX PBS洗涤三次后，用3% BSA于4°C封闭20分钟;加入1:50鼠抗人ChG A抗体 sigma，4°C孵育30分钟后，用IX PBS洗涤三次;加入羊抗鼠磁珠抗体，4°C孵育30分钟后，用 miniMACS ? Separator进行细胞分离；(3)NTU2细胞的扩增:将分离所得阳性细胞用1:1 DMEM/F12培养液，加5% FBS，1% ITS， 5ng/mL EGF，50ng/mL BPE;于5% C02,37°C培养;每3天换液一次；(4)NTU2细胞克隆化:将扩增NTU2细胞用1:1 DMEM/F12培养液，加5% FBS，1% ITS，5ng/ mL EGF，50ng/mL BPE;按0.5个细胞/孔接种至96孔板;每3天换液一次，生长成单细胞克隆后转入培养瓶用上述培养基进行扩增；(5)NTU2细胞体外鉴定:a.培养细胞经戊二醛固定，2%琼脂糖包埋后，戊二醛再固定后进行电镜制样观察。
[0009]b.14mm圆型盖玻片用多聚赖氨酸包被后放入24孔板，接种NTU2细胞，生长至60 — 70%密度后，多聚甲醛固定，IX PBS充分洗涤后，分别用神经内分泌细胞标志分子抗体ChG A 和Syn进行细胞免疫化学分析；(6)NTU2细胞体内鉴定:NTU2细胞按20%比例分别与PC-3和DU145细胞混合后，应用组织重组方法分别种植至裸鼠肾包膜下；成瘤后取出瘤体，多聚甲醛固定，石腊包埋切片，用神经内分泌标志分子进行免疫组织化学分析。[0〇1〇]细胞建系材料来源:永生化人正常前列腺上皮祖细胞系(NHPrEl)。该细胞系由江明教授建系。并已转入GFP作为分子标志。
【主权项】
1.一种人正常前列腺上皮神经内分泌亚型细胞系的建立方法，其特征是:包括下列步 骤:(1)人正常前列腺上皮祖细胞系NHPrEl细胞系的培养:1:1 DMEM/F12,加5% FBS，1% ITS，5ng/mL EGF，50ng/mL BPE;于5% C02,37°C培养;2 — 3天换液一次，1:3-4传代；(2)人正常前列腺上皮神经内分泌亚型细胞系NTU2的分离和纯化:将NHPrEl培养细胞 用胰蛋白酶酶消化后，1000 RPM离心收集细胞，IX PBS洗涤三次后，用3% BSA于4°C封闭20 分钟；加入1:50鼠抗人ChG A抗体，4°C孵育30分钟后，用1 X PBS洗涤三次;加入羊抗鼠磁珠 抗体，4°C孵育30分钟后，用mini MACS? Separator进行细胞分离；(3)NTU2细胞的扩增:将分离所得阳性细胞用1:1 DMEM/F12培养液，加5% FBS，1% ITS， 5ng/mL EGF，50ng/mL BPE;于5% C02,37°C 培养;每3天换液一次；(4)NTU2细胞克隆化:将扩增NTU2细胞用1:1 DMEM/F12培养液，加5% FBS，1% ITS，5ng/ mL EGF，50ng/mL BPE;按0.5个细胞/孔接种至96孔板;每3天换液一次，生长成单细胞克隆 后转入培养瓶用上述培养基进行扩增。2.根据权利要求1所述的人正常前列腺上皮神经内分泌亚型细胞系的建立方法，其特 征是:步骤(4)后还进行NTU2细胞体外鉴定:14 mm圆型盖玻片用多聚赖氨酸包被后放入24 孔板，接种NTU2细胞，生长至60 — 70%密度后，多聚甲醛固定，1 X PBS充分洗涤后，分别用神 经内分泌细胞标志分子抗体Chromogranin A和Synapsin进行细胞免疫化学分析。3.根据权利要求1所述的人正常前列腺上皮神经内分泌亚型细胞系的建立方法，其特 征是:步骤(4)后还进行NTU2细胞体内鉴定:NTU2细胞按20%比例分别与人进展期前列腺癌 PC-3和DU145细胞混合后，应用组织重组方法分别种植至裸鼠肾包膜下；成瘤后取出瘤体， 多聚甲醛固定，石腊包埋切片，用神经内分泌标志分子进行免疫组织化学分析。
【文档编号】C12N5/079GK106011064SQ201610385303
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月3日
【发明人】江明, 张冲, 张永辉, 陈苗苗, 鄂群, 曹靖晨, 王海燕
【申请人】南通大学