串联hcv多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒制备和应用
【专利摘要】本发明公开一种串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒及其制备方法和应用，属于分子生物学和细胞生物学领域。本发明方法采用将目的基因嵌合于HBV S的氨基端胞外区而不改变其穿膜结构域(TMD)的方式，将HCV中和抗原表位串联后嵌合于HBV S抗原氨基端，构建丙型肝炎病毒串联多中和抗原表位与乙型肝炎病毒S抗原嵌合基因真核表达质粒，观察其在293T细胞的表达，制备嵌合HCV串联多中和抗原表位的HBV S抗原的VLPs。该病毒样颗粒免疫血清对体外模拟HCV感染具有一定的保护作用，为设计HCV中和抗体疫苗提供了新的技术方法，也为设计双价疫苗提供了思路。
【专利说明】
串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒制备和应用
技术领域
[0001 ]本发明属于分子生物学和细胞生物学领域，具体设及一种串联HCV多中和抗原表 位嵌合病毒样颗粒及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 肥V感染导致的慢性肝病是全球性的公共卫生问题，全世界每年因肥V感染导致的 死亡人数达到45万。由于长期缺乏合适的体外病毒培养系统、小动物模型和准确的中和抗 体评价方法，使肥V预防疫苗的研制至今未能获得成功。研究表明，HCV包膜蛋白E1/E2区存 在多个保守的中和性抗原表位，针对运些表位的单克隆抗体具有广谱的交叉中和活性，运 也为设计诱导中和抗体的预防性表位疫苗提供了新的思路。
[0003] 近年来报道较多的具交叉中和活性的单克隆抗体AP33,其抗原决定簇是E2的一个 保守的线性中和表位(412-423)，该单克隆抗体能显著降低所有基因型HC化P的感染性。从 感染化型肥V患者得到的单抗A8(523-535)，其对应表位是E2-CD81相互作用中起关键作用 的表位。针对E1区的中和表位(313-327)的单抗能强烈中和la，化，4a，5a，和6a型肥V包膜糖 蛋白制备的HCVpp。为克服HCV E2区高变异，可采用HVR1的模拟表位，其抗原性更强、更广 谱。如报道的氨基酸序列为:ETYVSGGSAARNAYGLT化FTVGPAQK的模拟表位，可与80 %的肥V感 染患者血清反应。将具有广谱作用的表位串联，制备多表位疫苗，可有效预防多种基因型和 准种的病毒感染。
[0004] 皿V小包膜蛋白S抗原化BV S)长度为226个氨基酸，是目前商品化皿V疫苗的主要 成分。S基因可在无核屯、蛋白和基因组参与下自我装配成病毒样颗粒，运种特殊的亚病毒颗 粒，能产生大小为22nm的丝状或球状颗粒。在哺乳动物细胞中形成与野生型病毒相似的病 毒颗粒，分泌到细胞培养上清中，所形成的病毒颗粒是非传染性的。用皿V S作为表达载体 表达外源蛋白，具有易制备、易纯化等特点，而且外源抗原与之嵌合后，可增强外源蛋白的 免疫原性。因此皿V S是一种较好的载体系统。皿V S抗原亲水区，可插入表位，嵌和表达病 原体保守的表位，但研究发现，亲水区插入表位长度超过36个氨基酸就影响病毒颗粒的包 装。而皿V S得氨基端可插入较大片段(如GFP)，可形成嵌合的病毒样颗粒。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒及其制备方 法和应用。
[0006] 本发明是通过W下技术方案来实现：
[0007] -种串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒，该病毒样颗粒是将串联的HCV多中 和抗原表位嵌合于皿V S抗原氨基端构建得到真核表达载体，再经哺乳动物细胞体外装配 制得；
[000引其中，所述串联的肥V多中和抗原表位的核巧酸序列如SEQ. ID. NO: 1所示。
[0009] 所述串联的HCV多中和抗原表位是由氨基酸序列如SEQ.ID.no. 2、SEQ. ID.NO. 3、 SEQ. ID. NO. 4及沈Q. ID. NO. 5所示的表位串联得到。
[0010] 氨基酸序列如SEQ.ID.no. 2所示的表位为HCV El区线性中和表位;氨基酸序列如 SEQ.ID.N0.3和SEQ.ID.N0.4所示的表位为HCVE2区线性中和表位；氨基酸序列如 869.10.^.5所示的表位为肥￥62高变区模拟表位。
[0011] 串联的HCV多中和抗原表位的碱基序列全长25加 P，各个表位间WAAY为间隔进行 连接。
[0012] 本发明还公开了一种串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒的制备方法，包括 W下步骤：
[OOU] 1)利用DM W0服S设计合成，并扩增得到串联的肥V多中和抗原表位基因序列； [0014] 2)设计引物扩增得到去除胞外区的皿V S基因；
[0015] 3)将串联的肥V多中和抗原表位基因和去除胞外区的皿VS基因克隆入真核表达载 体；
[0016] 4)经哺乳动物细胞体外装配，制备得到串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒。
[0017] 串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒的制备方法，包括W下步骤：
[001引步骤1)，根据DNA W0服S设计合成表位基因序列Mixl~Mix6, WMixl~Mix6混合物 为模板，Mixl和Mix6为上下游引物，扩增得到串联多中和抗原表位序列MEp，克隆至T-easy 载体，经化0 I、EcoR I双酶切鉴定正确后，命名为Τ-ΜΕρ;
[0019] 步骤2)，W含有完整皿V S基因的质粒地V皿S为模板，设计引物，扩增6-226位氨基 酸的碱基序列，得到S，两端分别引入EcoR I和Not I酶切位点，克隆至T-easy载体，Eco RI 和Not I双酶切鉴定正确后，命名为T-HBVS;
[0020] 步骤3)，将T-HBVS用Eco R I/Not I双酶切，将Τ-ΜΕρ用化〇 I/EcoR I双酶切后，与 化0 I/Not I酶切的pCI-neoS片段连接，串联多中和抗原表位与截去胞外区的皿V S嵌合 的重组真核表达载体pCI-MEpS，然后将该重组真核表达载体pCI-MEpS转化大肠杆菌D册口， 筛选阳性克隆，提取pCI-MEpS质粒；
[0021] 步骤4)，将pCI-MEpS质粒转染哺乳动物细胞，转染4她后收集培养上清，浓缩纯化 后制得串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒。
[0022] 本发明还公开了上述的串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒在制备用于预防 HCV感染疫苗中的应用。
[0023] 所述的疫苗为嵌合病毒样颗粒疫苗，用于HCV预防性疫苗的设计。由串联HCV多中 和抗原表位嵌合病毒样颗粒免疫动物后产生保护性抗体，能够抑制HCVpp感染化h7.5细胞。
[0024] 与现有技术相比，本发明具有W下有益的技术效果：
[0025] 本发明公开的串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒，采用将目的基因嵌合于 皿V S的氨基端胞外区而不改变其穿膜结构域(TMD)的方式，将HCV中和抗原表位串联后嵌 合于皿V S抗原氨基端，构建丙型肝炎病毒串联多中和抗原表位与乙型肝炎病毒S抗原嵌合 基因真核表达质粒，在293T细胞表达，制备嵌合HCV串联多中和抗原表位的皿V S抗原的 VLPs。该病毒样颗粒对体外模拟HCV感染具有一定的保护作用，可W为制备双价表位疫苗提 供借鉴，为进一步设计中和抗体疫苗提供了新的技术方法。
[0026] 本发明的串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒制备简单，易于浓缩纯化，制备 的病毒样颗粒免疫新西兰兔后，免疫抗血清具有一定的保护作用。
【附图说明】
[0027] 图1为HCV多表位抗原与皿V S抗原嵌合示意图；
[0028] 图2为串联HCV多中和表位的合成扩增及皿V S基因的扩增结果；
[0029] 图3为串联HCV多中和表位及皿V S基因胞基因 T载体的酶切鉴定结果；
[0030] 图4为串联HCV多中和表位及皿V S基因克隆入真核载体的酶切鉴定结果；
[0031] 图5为重组真核表达载体在293T细胞中的表达分析；
[0032] 图6为嵌合串联HCV多中和抗原表位在真核细胞中表达分析Western blot结果；
[0033] 图7为纯化嵌合病毒样颗粒电镜分析结果;其中，A为分段测定皿sAg含量结果;B为 乙肝疫苗作为阳性对照的皿sAg含量测定结果;C为电镜下观察病毒样颗粒；
[0034] 图8病毒样颗粒免疫新西兰兔后血清抗体分析;其中，A为化Ps-MEpS组抗血清抗体 水平与VLPs-HBS，化ccine及佐剂对照组抗体的水平;B为检测皿V S抗原载体的免疫性；
[0035] 图9免疫血清对HCVpp感染化h7.5抑制作用分析;其中，A为各组中和率比较结果;B 为免疫后42天和免疫前0天中和率比较结果。
【具体实施方式】
[0036] 下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而 不是限定。
[0037] 采用将目的基因嵌合于皿V S的氨基端胞外区而不改变其穿膜结构域(TMD)的方 式，将HCV中和抗原表位串联后嵌合于皿V S抗原氨基端，构建丙型肝炎病毒串联多中和抗 原表位与乙型肝炎病毒S抗原嵌合基因真核表达质粒，观察其在293T细胞的表达，制备嵌合 HCV串联多中和抗原表位的皿V S抗原的VLPs。
[0038] 1、串联丙型肝炎病毒多中和抗原表位基因选择及合成
[0039] 1.1表位选择包括：
[0040] HCV E1 区线性中和表位:ITGHRMAWDMMMNWS;
[0041 ] HCV E2区线性中和表位:QLINTNGSWHIN;
[0042] HCV E2区线性中和表位:GVPTYSWGE肥T;
[0043] HCV E2高变区化VR)模拟表位：
[0044] ETYVSGGSAARNAYGLTSLFTVGPAQK。
[0045] 具体参见下表1:
[0046] 表1.表位选择及在HCV中的氨基酸位置
[0047]
[004引 1.2DNA wo服S设计合成串联的多表位基因
[0049]表位间WAAY为间隔进行连接，表位碱基序列全长25化P，根据DNA W0服S设计合成 表位基因序列Mixl-Mix6(参见表2):
[(X)加]表2.DNA W0服S设计合成串联多表位基因 Μ邱序列
[0化1 ]
[0化2] WMixl-6混合物为模板，Mixl和Mix6为上下游引物，扩增得到串联表位序列ΜΕρ， 两端分别带有化0 I、EcoR I酶切位点和HIS，扩增后得到带有HIS标签的串联表位序列ΜΕρ， 参见图2。克隆至T-easy载体，化0 I、EcoR I双酶切鉴定正确后，参见图3,送测序。测序正确 后。命名为THVtep。
[0化3] 2、皿V S基因胞外区扩增
[0054] W含有完整皿V S基因的质粒pBV皿S为模板，设计引物，扩增6-226位氨基酸的碱 基序列，得到S，两端分别引入EcoR I和Not I酶切位点，参见图2。克隆至T-easy载体，Eco RI和Not I双酶切鉴定正确，参见图3，送测序，测序正确后，命名为T-HBVS。
[0055] 从图2中可W看出，扩增出66化p和25化p大小的目的片段，与去除胞外区的皿V S 基因和串联多表位基因（MEp)大小相符。从图3中可W看出，琼脂糖凝胶电泳分析，分别用 EcoR I/Not 1(截短皿V S)和)(hoI/EcoRI(MEp)酶切得到大小分别为666bp、25化P的预期片 段，测序结果表明所扩增序列正确。
[0056] 3、将串联HCV多中和抗原表位基因和皿V S胞外区克隆入真核表达载体
[0057] 将T-HBVS用Eco R I/Not I双酶切、Τ-ΜΕρ用化〇 I/EcoR I双酶切后，与趾0 I/Not I酶切的pCI-neoS片段连接，串联多中和抗原表位与截去胞外区的皿V S嵌合的重组真核 表达载体pCI-M化S，设计方式见图1。转化大肠杆菌DH5a，筛选阳性克隆，提取质粒，用趾0 I/Not I双酶切鉴定，结果参见图4,重组克隆质粒pCI-MEpS经趾0 I/Not I双酶切后，琼脂 糖凝胶电泳分析，可见92化P，大小与预期一致。不含Μ巧的真核表达载体为对照(pCI-HBS)。 [005引 4、串联HCV多中和抗原表位基因与皿V S嵌合基因表达分析
[0059] 4.1嵌合基因真核表达载体在哺乳动物细胞293T中的表达分析(IFA)
[0060] 将5 X 105HEK293T细胞接种放入盖玻片的6孔板中，培养24h。将7 . 5ul Lipof ectamine 2000用12加1稀释，放置5min，将2.加 g的pCI-MEpS质粒用12加1稀释，5min 后将二者混合解育20min，缓慢加入6孔板中。37°C，5%C02解育化后，更换为完全培养 基。细胞转染24h后，取出盖玻片，PBS洗2遍;加入500ul 4%多聚甲醒固定10min;PBS漂洗3 次，3min/次;0.2 % 的PBST漂洗1次，lOmin; PBS漂洗3次，5min/次；3 % 的BSA封闭化；1 %BSA 稀释的一抗化IS单抗，l:1000;HbsAb阳性血清l:200)，37°C解育化；PBST漂洗3次，每次 5min; 1 %BSA稀释的二抗（1:2000)，37°C避光封闭化;PBS漂洗3次，每次5min，洗完后，中性 树脂封片，巧光显微镜下观察，结果参见图5，重组真核表达载体在293T细胞中的表达分析。 HIS单抗作为一抗:pCI-MEpS转染的293T细胞胞浆内可见较强的绿色巧光，而对照pCI-HBS、 pCI-neo未见绿色巧光。皿V抗血清作为一抗:pCI-MEpS和pCI-HBS可见绿色巧光，pCI-neo未 见绿色巧光。
[0061 ] 4.2嵌合基因真核表达载体在哺乳动物细胞293T中的表达分析(Western)
[0062] 将5X105皿K293T细胞接种6孔板中，培养2地。将7.5ul Lipofectamine 2000用 125ul稀释，放置5min，将2.5ug的pCI-MEpS质粒用125ul稀释，5min后将二者混合解育 20min，缓慢加入6孔板中。37 °C，5 % C02解育化后，更换为完全DMEM培养基，继续培养24- 4她。取部分转染24-4化的细胞，RIPA裂解，在冰上作用30-40min后，刮取裂解液，12000巧m 离屯、lOmin留取上清。经SDS-PAGE分离蛋白，转移至硝酸纤维素膜;5%脱脂奶粉封闭1-化； 加入相应一抗化IS单抗，1:2000;皿sAg单克隆抗体1:1000)4°C振荡解育过夜;TBST洗3次， 15min/次;加入HRP标记的羊抗人IgG( 1:5000稀释)或羊抗鼠 IgG( 1:8000稀释），室溫振荡解 育1-化;TBST洗3次，15min/次，E化发光。WpCI-neo，pCI-HBVS作为对照，结果参见图6，从图 中可W看出，HIS单抗作为一抗:检测结果显示pCI-MEpS转染的293T细胞在相对分子质量约 38KD处可见蛋白条带，而pCI-皿S和空载体pCI-neo未见条带；HBsAg单抗作为一抗：pCI- MEpS和pCI-HBS转染的293T细胞在相对分子质量约27KD处可见蛋白条带，而pCI-neo未见条 带。
[0063] 5、病毒样颗粒的制备及纯化
[0064] 5.1培养细胞
[0(?日]将lX10?EK29：3T细胞接种75ml培养瓶中，培养24h，待细胞长至95%密度时，按4 中方法进行转染，脂质体和载体浓度按转染试剂说明书进行，4化后收集培养上清，上清中 即含有自我装配的嵌合的病毒样颗粒化Ps-MEpS。罗氏E601电化学发光分析仪上对皿sAg进 行定量，测定皿sAg含量。
[0066] 5.2嵌合￥1?3浓缩和纯化
[0067] 将收集的各个细胞培养上清（约15ml)，用Amicon嚴叫1：racell-l5 100k离屯、过 滤器4000g离屯、15min，浓缩的化Ps (约800μ1)分别铺于60%-20%密度梯度的薦糖上， Beckman超速离屯、机(rotor SW41 )28000rpm超速离屯、16h;从管低依次收集不同片段（1ml/ 片段），用商品化乙肝表面抗原测定试剂在罗氏E601电化学发光分析仪上对皿sAg进行定 量，结果参见图7A，合并阳性片段进行透析（20mMTris-HCl)并用离屯、过滤器浓缩，得到约 300μ1纯化浓缩的化Ps，结果参见图7B。取20μ1进行电镜分析，结果参见图7C，剩余-80°C冻 存。纯化嵌合病毒样颗粒电镜分析结果。真核表达载体转染肥K293细胞48小时后，收集培养 上清，浓缩离屯、，薦糖滴度密度离屯、，分段检测皿sAg含量。结果第6和第7片段皿sAg含量最 高（图7A)。取两片段混合透析，浓缩后测定皿sAg含量，结果pCI-MEpS转染组皿sAg含量可达 3 X 103ng/ml，pCI-MEpS转染组皿sAg含量可达8 X 103ng/ml。乙肝疫苗作为阳性对照（图7B， 皿sAg标准含量为20X 103ng/ml)。取20ul浓缩的病毒样颗粒，1%钢酸锭负染电镜下观察， 可见大量病毒样颗粒(图7C，放大倍数15万倍）。
[0068] 6纯化病毒样颗粒免疫新西兰兔抗血清测定及保护力评价
[0069] 6.1病毒样颗粒免疫新西兰兔方法
[0070] 将15只新西兰兔分为5组，每组3只，分别命名为化Ps-MEpS、VLPs-HBS、化ccine(乙 肝疫苗）、佐剂组、PBS组。分别取lOyg的纯化化Ps和lOyg的Vaccine与同体积的MF59佐剂混 合成油包水状后皮下多点免疫新西兰兔，佐剂组用PB巧h齐。从第0天开始免疫，每隔两周免 疫一次，共免疫Ξ次;不同的时间点采集免疫兔静脉血，0、14、28、42、56和70天分别采血一 次。离屯、留取血清，分装后-20°C保存备用。
[0071] 6.沈LISA法检测免疫抗血清中抗体的水平
[0072] 四种合成肤分别用0.3%戊二醒和BSA交联，包被交联肤（四种交联肤混合物)浓度 为16μg/ml，W每孔100μΙ包被，4°C过夜;PBST重复清洗3次，每孔加入PBST配制2%BSA封闭 液15化l，37°Clh;PBST重复清洗3次，加入免疫血清（1:200稀释），每孔10化1，阴性对照不加 一抗，37 °C化;PBST重复清洗3次，加入二抗化RP标记的羊抗兔IgG，1:4000稀释），37 °C化； PBST重复清洗3次，每孔加入TMB显色液10化1，37 °C显色5-lOmin;加入终止液5化1; 30分钟 内酶标仪450nm测定0D值。同样方法用皿sAg阳性血清（1:500稀释)血清包被96孔板，测定免 疫血清中化sAb水平。抗体检测结果见图8, W收取血清的不同时间点为横坐标，ELISA检测 结果0D值为纵坐标作图，分析不同组别中抗体的水平。图8A中可见化Ps-MEpS组抗血清抗体 水平与化Ps-皿S，化ccine及佐剂对照组相比0D值有明显增高，有统计学差异(P<0.01)。图 8B是W皿V表面抗原强阳性血清包被抗原，检测皿V S抗原载体的免疫性，可见化Ps-MEpS， 化Ps-HBS，Vaccine组均产生较高水平的皿sAb，与佐剂和PBS对照组相比有统计学差异(P< 0.01)。
[0073] 6.3免疫抗血清对HCVpp感染化h7.5细胞的抑制性分析
[0074] 2X105/孔的化h7.5细胞接种于24孔板，37°C，5%C02条件下过夜培养。将不同分 组的免疫抗血清(预先56°C、30min灭活)从1:10开始进行倍比稀释，分别与含有2000TU(感 染后非抑制对照组GFP阳性率达到50 %左右）的HCVpp (化型）等体积混合均匀，室溫Ih ;DMEM 清洗24孔板，将假病毒与抗血清混合物加到24孔板中，每孔约20化1。37°(：吸附1化后，更换 DMEM完全培养液;48~7化后流式细胞仪计数表达EGFP的阳性细胞的比率。PBS组为非抑制 对照，计算免疫血清中和率。计算方法:计算中和抗体中和率(抑制率），计算方法：中和率 (% ) = ( % GFP础深且-% GFP纖且)/ % GFP础深且。
[00巧]血清抗体中和作用见图9,实验结果显示，VLPs-MEpS组抗血清对lb型HCV卵感染 化h7.5的抑制作用，与对照组相比中和率明显增高，有统计学差异(P<0.01),42天时最高中 和率可达61.5% (图9A);免疫后(42天)与免疫前(0天）比较化Ps-MEpS组中和率明显增高， 有统计学差异(P<0.01)(图9B)。
【主权项】
1. 一种串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒，其特征在于，该病毒样颗粒是将串联 的HCV多中和抗原表位嵌合于HBV S抗原氨基端构建得到真核表达载体，再经哺乳动物细胞 体外装配制得； 其中，所述串联的HCV多中和抗原表位的核苷酸序列如SEQ. ID. NO: 1所示。2. 如权利要求1所述的串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒，其特征在于，所述串 联的HCV多中和抗原表位是由氨基酸序列如SEQ. ID. NO. 2、SEQ. ID. NO. 3、SEQ. ID. NO. 4及 SEQ. ID. NO. 5所示的表位串联得到。3. 如权利要求1所述的串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒，其特征在于，氨基酸 序列如SEQ.ID.N0.2所示的表位为HCV E1区线性中和表位;氨基酸序列如SEQ.ID.N0.3和 SEQ. ID. N0.4所示的表位为HCV E2区线性中和表位;氨基酸序列如SEQ. ID. N0.5所示的表位 为HCV E2高变区模拟表位。4. 如权利要求1所述的串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒，其特征在于，串联的 HCV多中和抗原表位的碱基序列全长255bp，各个表位间以AAY为间隔进行连接。5. -种串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步 骤： 1) 利用DNA WORKS设计合成，并扩增得到串联的HCV多中和抗原表位基因序列； 2) 设计引物扩增得到去除胞外区的HBV S基因； 3) 将串联的HCV多中和抗原表位基因和去除胞外区的HBVS基因克隆入真核表达载体； 4) 经哺乳动物细胞体外装配，制备得到串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒。6. 如权利要求5所述的串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒的制备方法，其特征在 于，包括以下步骤： 步骤1)，根据DNA WORKS设计合成表位基因序列Mixl~Mix6,以Mixl~Mix6混合物为模 板，Mixl和Mix6为上下游引物，扩增得到串联多中和抗原表位序列MEp，克隆至T-easy载体， 测序和经Xho I、EcoR I双酶切鉴定正确后，命名为Τ-ΜΕρ; 步骤2)，以含有完整HBV S基因的质粒pBVHBs为模板，设计引物，扩增6-226位氨基酸的 碱基序列，得到S，两端分别引入EcoR I和Not I酶切位点，克隆至T-easy载体，测序和经Eco RI和Not I双酶切鉴定正确后，命名为T-HBVS; 步骤3)，将T-HBVS用Eco R I/Not I双酶切，将Τ-ΜΕρ用Xho I/EcoR I双酶切后，与Xho I/Not頂每切的pCI-neo三片段连接，串联多中和抗原表位与截去胞外区的HBV S嵌合的重 组真核表达载体pCI-MEpS，然后将该重组真核表达载体pCI-MEpS转化大肠杆菌DH5a，筛选 阳性克隆，提取pCI-MEpS质粒； 步骤4)，将pCI-MEpS质粒转染哺乳动物细胞，转染48h后收集培养上清，制得串联HCV多 中和抗原表位嵌合病毒样颗粒。7. 权利要求1所述的串联HCV多中和抗原表位嵌合病毒样颗粒在制备用于预防HCV感染 的疫苗中的应用。8. 如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的疫苗为预防性疫苗，由串联HCV多中和 抗原表位嵌合病毒样颗粒免疫动物后产生保护性抗体，能够抑制HCVpp感染Huh7.5细胞。
【文档编号】C07K14/18GK106011089SQ201610332980
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月18日
【发明人】韦三华, 王晓岩, 张海, 雷迎峰, 林芳, 崔颖, 李斌, 张惠中
【申请人】中国人民解放军第四军医大学