一种还原酶及其编码基因与应用
【专利摘要】本发明公开了一种还原酶及其编码基因与应用，所述还原酶是由序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；将序列表中SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有(E)?4?羟基?3?甲基?2?丁烯基二磷酸酯还原酶活性的衍生的蛋白质。本发明获得了新基因RSispH。将RSispH基因克隆到原核表达载体pSB1s质粒上。本发明所获得的重组(E)?4?羟基?3?甲基?2?丁烯基二磷酸酯还原酶蛋白可以催化HMBPP生成IPP和DMAPP，具有较高的酶活性，具有较高的应用前景及开发价值。
【专利说明】
-种还原酶及其编码基因与应用
技术领域
[0001] 本发明属于还原酶技术领域，尤其设及一种还原酶及其编码基因与应用。
【背景技术】
[0002] 自然界中已知的W异戊二締（isoprene)为骨架的祗类化合物（Terpenoid)超过 65000种，其中具有极高的经济价值和药用价值的祗类化合物有番茄红素化ycopene)、辅酶 Q10(Coenzyme Q10)、邮青素(Astaxanthin)、胡萝h素（Carotene)、紫杉醇（Taxol)和人参皂 巧(Ginsenoside)等。祗类化合物由于具有显著的抗氧化特性，被广泛应用在预防癌症、增 强免疫力、改善视力等方面。祗类化合物青葛素(Ademisinine)是治疗追疾的唯一特效药 物。异戊二締单体聚合后成为异戊二締橡胶，此类生物基的橡胶产品比石油为原料的的合 成橡胶产品橡胶性能更优，可用于制备轮胎、模压制品。祗类化合物可W通过W下可从W下 几种途径获得:天然产物提取、化学合成、酶法合成等。比如青葛素、紫杉醇和人参皂巧可分 别从青葛、红豆杉和丹参中提取。但是植物生长缓慢，化合物含量较低，运种提取方法完全 满足不了市场需求。化学合成法合成祗类化合物，由于产物结构的复杂性，需要繁多的氧化 还原反应步骤W及保护和去保护步骤，反应条件苛刻，得率低。因此利用代谢工程的手段， 在细胞工厂中生产得到特定的某类祗类化合物成为首选方法。祗类化合物都是从基本的五 碳化合物二甲基締丙基焦憐酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP)和异戊締焦憐酸 (isopenten^ di地os地ate，IPP)两个化合物衍生得到的。五碳化合物的生物合成有两条 途径：甲径戊酸（the mevalonate pathway,MVA)途径和2-C-甲基-D-赤薛糖醇-4-憐酸（20 methy 1 -D-e;rythrito 1 4-phosphate pa1:hway，MEP)途径。在MVA途径中是 W 乙酷辅酶A为前 体，而MEP是W丙酬酸和3-憐酸甘油醒为前体的;MVA途径主要存在于古生菌、真菌、植物的 细胞液或内质网上，MEP途径主要存在于细菌和植物质体中；MEP途径的理论转化率 (30.2 % )高于MVA途径的理论转化率(25.2 % )。W大肠杆菌为生产菌株，MEP途径由于其具 有更高的理论转化率，不会引入过多的外源酶的优势被广泛用于生产中。MEP途径W糖代谢 的中间代谢物丙酬酸和3-憐酸甘油醒为前体，在焦憐酸硫胺素依赖性1-脱氧-D-木酬糖-5- 憐酸合成酶（1-deo巧-D-deo巧-D-xylulose-5-地ps地ate synthase,DXS)的作用下，生成 1-脱氧-D-木酬糖-5-憐酸（1-deo巧-D-巧lulose-5-phosphate ,DXP); 1-脱氧-D-木酬糖-5- 憐酸还原异构酶(DXP reductase，DXR)通过分子内重排和还原反应将DXP转变为MEP;MEP在 辅酶存在的情况下依次由不同的酶催化得到MEP途径的代谢中间产物，分别是4-二憐酸胞 巧基-2-甲基-D-赤藻糖醇合成酶（4-(巧 tidine-5-diphospho)-2-C-methyl-D-e;rytbitol synthase，IspD)、4-二憐酸胞巧基-2-甲基-D-赤藻糖醇-2-憐酸合成酶（4-((：ytidine-5- 山地〇3地〇)-2-〇11161:1171-〇-6巧1:111'；[1:011^]1日36,13祀）、2-甲基-〇-赤藻糖醇-2,4-环二憐 酸合成酶（2-C-methyl-D-e;ryth;ritol 2,4-cyclodi地OS地ate synthase, IspF) W及化）- 4-径基-3-甲基-2-下締基二憐酸醋合成酶（化）-4-hyd;roxy-3-methyl-but-2-enyl diphosphatesynthase , IspG)，转化生成化）-4-?基-3-甲基-2-下締基二憐酸醋（化）-4- hyh〇w-3-methyl-but-2-enyl diphosphate ,ΗΜΒΡΡ);最后一步是ΗΜΒΡΡ还原酶（ΗΜΒΡΡ reductase，IspH)催化还原底物脱径基生成自然界构成所有祗类化合物的最基本单位IPP 和DMAPP。研究显示替换不同来源的i spH基因能够促进IPP和DMAPP及下游祗类化合物的积 累，是MEP代谢途径中最重要的遗传操作祀位点。因此如何获得酶活性质优良的化)-4-径 基-3-甲基-2-下締基二憐酸醋还原酶(IspH)对异戊二締及祗类化合物的生产有重要意义。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种还原酶及其编码基因与应用，旨在解决现有的异戊二 締类化合物的产率很低的技术问题。
[0004] 本发明是运样实现的，一种还原酶，所述还原酶为：
[0005] 由SEQ ID N0:2的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0006] 将SEQ ID NO:2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加且具有巧)-4-径基-3-甲基-2-下締基二憐酸醋还原酶活性的由SEQ ID N0:2的氨基酸 序列组成的蛋白质衍生的蛋白质。
[0007] 进一步，所述蛋白质的编码基因。
[000引进一步，所述编码基因为：
[0009] 核巧酸序列是沈Q ID NO: 1的DNA分子；
[0010] 与SEQ ID N0:1的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
[0011] 与DNA分子或DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子具有90 % W上的同源性且 编码所述蛋白质的DNA分子。
[0012] 本发明的另一目的在于提供一种包含所述编码基因的表达盒。
[0013] 本发明的另一目的在于提供一种包含所述编码基因的重组表达载体。
[0014] 进一步，所述重组表达载体为在载体pSBls的多克隆位点插入所述编码基因得到 的重组表达载体。
[0015] 本发明的另一目的在于提供一种所述编码基因的转基因细胞系或重组菌。
[0016] 进一步，所述重组菌为编码基因导入宿主菌得到的重组菌；编码基因是重组表达 载体导入宿主菌中的。
[0017] 本发明的另一目的在于提供一种所述蛋白和编码基因在制备祗类化合物中的应 用。
[0018] 本发明的另一目的在于提供一种所述重组表达载体、重组菌、表达盒或转基因细 胞系在制备祗类化合物中的应用。
[0019]本发明提供的还原酶及其编码基因与应用，W类球红细菌总DNA为模板，用PCR扩 增获得一个编码化)-4-径基-3-甲基-2-下締基二憐酸醋还原酶的新基因 Rsis抑。将Rsis抑 基因克隆到原核表达载体pSBls质粒上，在大肠杆菌中进行化)-4-径基-3-甲基-2-下締基 二憐酸醋还原酶(RSIspH)的高效表达;获得的重组巧)-4-径基-3-甲基-2-下締基二憐酸醋 蛋白可W催化化)-4-径基-3-甲基-2-下締基二憐酸醋生成二甲基締丙基焦憐酸和异戊締 焦憐酸，具有较高的酶活性，具有较高的应用前景及开发价值;从图5中可W看出，重组表达 的pSBls-Rsis抑036/PXIDF的链抱红素产量比重组表达的pSBls-Ecis抑036/PXIDF的产量 高。由于检测的是Is抑产物转化为链抱红素的产量，因此增强通路中的Is抑的同时，增强表 达了is抑下游基因的idi的表达;从图6中可W看出，可W看出pSBls-Rsisp册36/PXDF的链 抱红素产量为pSBls036/PXDF的4倍，pSBls-Ecidi-RsispH 036/PXDF的链抱红素产量为 pSBls-Ecidi 036/PXDF的5倍，也即RsIs抑蛋白具有较EcIspH更强的酶活性，与Idi蛋白共 同表达能够增强大肠杆菌链抱红素的产量。
【附图说明】
[0020] 图1是本发明实施例提供的Rsis抑的PCR扩增结果示意图。
[0021] 图2是本发明实施例提供的重组质粒pSBls-Rsis抑的PCR鉴定结果示意图。
[0022] 图3是本发明实施例提供的PCR扩增出lOSObp左右的片段扩增结果示意图。
[0023] 图4是本发明实施例提供的PCR扩增出llSObp左右的片段鉴定结果示意图。
[0024] 图5是本发明实施例提供的基因工程菌pSBls036/PXIDF，pSBls-Rsisp册36/PXIDF 和pSBls-Ecisp册36/PXIDF的链抱红素产物的特征吸收峰442nm峰值分析示意图；
[00巧]图中：l、pSBls036/PXIDF;2、pSBls-EcispH036/PXIDF;3、pSBls-RsispH036/ PXIDFo
[00%] 图6是本发明实施例提供的基因工程菌pSBl S036/PXDF，pSBl s-Rs i sp册36/PXDF， pSBIs-Ecidi 036/PXDF和pSBls-Ecidi-RsispH 036/PXDF的链抱红素产物的特征吸收峰 442nm峰值分析示意图；
[0027] 图中：1、pSBls-Ecidi 036/PXDF; 2、pSBlS036/PXDF; 3、pSBls-Rsisp册36/PXDF;4、 pSBls-Ecidi-RsispH 036/PXDF。
【具体实施方式】
[0028] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，W下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用W解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0029] 下面结合具体实施例对本发明的应用原理作详细的描述。
[0030] 实施例1、化)-4-径基-3-甲基-2-下締基二憐酸醋还原酶的制备及功能验证
[0031] 一、类球红细菌基因组DNA的提取和RsispH基因的PCR扩增
[0032] 类球红细菌（属名Rhodobacter，种加名sphaeroides，拉下命名全名Rhodobacter S地aeroides)(购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中屯、(保藏单位），CGMCC 1.2174(中 屯、的分类编号）），采用细菌基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司，产品目录为DP302) 提取类球红细菌基因组DNA。W提取类球红细菌基因组总DNA作为模板，WRsispH-F和 Rsis抑-R为引物，用高保真化ansStad Fas巧化DNA聚合酶（北京全式金生物技术有限公 司，产品目录为AP221)PCR扩增RsispH基因。引物序列如下：
[0033] RsispH-F:5'cc邑acat邑tacctcc邑邑C邑ca邑acct邑C邑C邑 3'
[0034] Κ8?8ρ!1_Κ:5,〇Β邑邑tc邑acc邑邑邑邑tctc邑邑ca邑邑ttc邑C邑ca邑3，
[0035] PCR 程序为：
[0036]
IT'C imin
[0037] 72°C 5min
[0038] PCR扩增出lOSObp左右的片段，扩增结果如图1所示（图1中，泳道M为DNA Marker， 泳道1-5道均为RsispH的PCR扩增产物），回收后经过化il/Sall双酶切后连接到克隆载体 上，筛选鉴定阳性克隆，并进行序列测定。
[0039] 二、含有pSBl s-Rs i spH的重组表达载体的构建
[0040] 将上述步骤一得到的PCR扩增片段用化Π 和Sail酶切，回收目的片段；同时用化〇1 和趾〇1酶切载体pSBls(pSBls载体为本实验室所构建，其特性为：pSC101origin，araBAD promoter,St/。回收载体大片段;将回收的目的片段与回收的载体大片段16°C连接，得到 目的质粒。将目的质粒用化C12法转化大肠杆菌D册α感受态细胞(购自化kara，产品目录号 为D9057A)。将其均匀涂布于含链霉素的LB平板上，37Γ培养16小时。单菌落振荡培养过夜， 提取质粒用进行PCR鉴定，使用RsispH-F序列和pBAD-R序列为引物，用高保真TransStad 化stPfu DM聚合酶(北京全式金生物技术有限公司，产品目录为AP221)PCR扩增基因。引物 序列如下：
[0041 ] pBAD-R：aattctgttttatcagaccgcttct
[0042] PCR 程序为：
[0043]
[0044] PCR扩增出llSObp左右的片段，鉴定结果如图2所示（图2中，泳道Μ为DNA Marker, 泳道1-2道均为Rsis抑的PCR扩增产物），从图2中可见，获得了 llSObp左右的PCR条带，大小 正确。对上述两个单克隆的菌株进行质粒提取进行测序。测序结果表明，克隆得到的DNA序 列如序列表中的SEQ ID N0:1所示，序列表中的SEQ ID N0:1由1080个核巧酸组成，编码序 列表中SEQ ID N0:2所示的蛋白质。序列表中序列2由359个氨基酸残基组成。将该基因命名 为Rsis抑，将其编码的蛋白命名为RsIs抑。将重组载体命名为pSBls-RsispH。
[0045] S、RsispH 基因的 PCR 扩增
[0046] 采用细菌质粒提取试剂盒（天根生化科技有限公司，产品目录为DP105-03)提取 pSBls-RsispH质粒。W提取的质粒作为模板，WRsisp血-F和Rsisp化-R为引物，用高保真 TransStad Fas巧化DNA聚合酶(北京全式金生物技术有限公司，产品目录为AP221)PCR扩 增RsispH基因。引物序列如下：
[0047] RsispHm-F:5'ct c邑c邑c邑c邑at邑ctcc邑邑c邑ca邑acct邑c邑c邑 3'
[0048] RsispHa-R：5'cat邑邑c邑c邑cctcac邑邑邑邑tctc邑邑ca邑邑ttc邑c邑3'
[0049] PCR 程序为：
[(Κ)加 ]
[0化1 ] PCR扩增出lOSObp左右的片段，扩增结果如图3所示（图3中，泳道Μ为DNA Marker， 泳道1-5道均为RsispH的PCR扩增产物），回收后经过mauBI/AscI双酶切后连接到克隆载体 上，筛选鉴定阳性克隆，并进行序列测定。
[0化2] 四、含有pSBls-Ecidi-RsispH的重组表达载体的构建
[0053] 将上述步骤一得到的PCR扩增片段用mauBI和AscI酶切，回收目的片段；同时用 mauBI和AscI酶切载体pSBls-Ecidi (载体为本实验室所构建，其特性为：pSClOlorigin， araBAD promoter,St/。质粒上有大肠杆菌的idi基因），回收载体大片段；将回收的目的片 段与回收的载体大片段16°C连接，得到目的质粒。将目的质粒用化C12法转化大肠杆菌D册α 感受态细胞(购自化kara，产品目录号为D9057A)。将其均匀涂布于含链霉素的LB平板上，37 °C培养16小时。单菌落振荡培养过夜，提取质粒用进行PCR鉴定，使用Rsis抑-F序列和地AD- R序列为引物，用高保真化ansS^d Fas巧化DNA聚合酶（北京全式金生物技术有限公司， 产品目录为AP221 )PCR扩增基因。引物序列如下：
[0054] pBAD-R：aattctgttttatcagaccgcttct [0055] PCR 程序为：
[0化6]
[0化7] PCR扩增出llSObp左右的片段，鉴定结果如图4所示（图4中，泳道Μ为DNA Marker, 泳道1-2道均为RsispH的PCR扩增产物），从图中可见，获得了 1180bp左右的PCR条带，大小正 确。对上述两个单克隆的菌株进行质粒提取进行测序。测序结果表明，克隆得到的DNA序列 如序列表中的SEQ ID NO: 1所示，序列表中的SEQ ID NO: 1由1080个核巧酸组成，编码序列 表中沈Q ID N0:2所示的蛋白质。将重组载体命名为pSBls-Ecidi-RsispH。
[0化引五、重组表达RsispH蛋白的基因工程菌的构建
[0059]将重组质粒 pSBls、pSBls-Rsis 抑、pSBls-Ecidi 和 pSBls-Ecidi-RSispH 用氯化巧 法转化含有piLY〇36报告质粒（pl5A origin,tac promoter,CmR,Anabaena sp.crtEB, lihodobacter s曲aeroides c;rtI,E.coli idi)，可将前体IPP&DMAPP转化为链抱红素）的大 肠杆菌PXDF(BW25113 ApgiPT5-dxsPT5-ispDF，实验室保存菌株），得到基因工程菌 pSBls036/PXDF，pSBls-RsispH036/PXDF，pSBls-Ecidi036/PXDF和pSBls-Ecidi-RsispH 036/PXDF。将重组质粒pSBls、pSBls-EcispH(载体为本实验室所构建，其特性为： pSClOlorigin,araBAD promoter ,StrR。质粒上有大肠杆菌的is抑基因）pSBls-RsispH用氯 化巧法转化含有pLY〇36报告质粒的大肠杆菌PXIDF(BW25113 Δ pgiPT日-dxsPT日-idiPTs- ispDF，实验室保存菌株），得到基因工程菌pSBls036/PXIDF，pSBls-Rsisp朋36/PXIDF和 pSBls-EcispH036/PXIDF。链霉素和氯霉素双抗性筛选培养，挑取单菌落37°C振荡培养过夜 W获得饱和培养，1 %接种于含链霉素（50g/ml)和氯霉素（17g/ml)双抗性的ZYM-5052自诱 导培养基（含终浓度0.2 %的阿拉伯糖）中，37 °C培养到OD600为0.6-0.8时，加入终浓度为 0.2mM的IPTG诱导16小时后，离屯、收集菌体。
[0060] 含有链霉素和氯霉素双抗性的自诱导培养基ZYM-5052配方如下：lOOmL A+2mL B+ 2mL C+200L D+IOOL化lmL(W下均为质量百分比浓度）；
[0061] A.ZY:!%膜蛋白腺，0.5%酵母粉；
[0062] B.50XM:1.25M Na抽P04，1.25M K出P04,2.5MNH4C1 和0.25M Na2S〇4;
[0063] C. 50X5052:25%甘油，2.5% 葡萄糖，10%乳糖；
[0064] D.lMMgS〇4;
[00化]E.1000X 微量元素：50mM FeCl3,20mM CaCl2，10mM MnCl2，10mM ZnS〇4，CoCl2、 NiCl2、Na2M〇4、Na2Se〇3 和出 B03 各 2mM;
[0066] F. 20%阿拉伯糖。
[0067] 四、RsIs抑蛋白的酶活性与大肠杆菌Eels抑蛋白的酶活性比较
[0068] 对类球红细菌RsIs抑蛋白的酶活性与大肠杆菌Eels抑蛋白的酶活性进行比较。将 过夜培养的工程菌株pSBls036/PXDF，pSBls-Rsisp朋36/PXDF，pSBls-Ecidi 036/PXDF和 pSBls-Ecidi-RsispH 036/PXDF按1%接种量接种于含5ml ZYM-5052自诱导培养基的试管 中，37°C培养到OD600为0.6-0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG诱导16小时后，取出ImL培养 液留待测试。在剩余的4mL培养液中加入50化的40%葡萄糖和50化的10XPBS进行生物转 化，37°C继续培养24小时。分别测定转化0小时和24小时的ODsqq，并取含1 X 108c化细胞的培 养液离屯、收集菌体，用双蒸水洗涂一次，于菌体中加入1ml丙酬，于冰上萃取化，12000rpm/ min离屯、lOmin，取上清液得到待测样品，进行扫描340-550波长扫描，读取特征吸收峰442nm 的峰值。实验设Ξ次重复，结果取平均值。比较结果如图5图6所示，从图5中可W看出，重组 表达的pSBls-Rsisp册36/PXIDF的链抱红素产量比重组表达的pSBls-Ecisp朋36/PXIDF的 产量高。由于检测的是IspH产物转化为链抱红素的产量，因此增强通路中的IspH的同时，增 强表达了ispH下游基因的idi的表达。从图6中可W看出，可W看出pSBls-Rsis抑036/PXDF 的链抱红素产量为pSBls036/PXDF的4倍，pSBls-Ecidi-RsispH 036/PXDF的链抱红素产量 为pSBls-Ecidi 036/PXDF的5倍，也即RsIs抑蛋白具有较Eels抑更强的酶活性，与Idi蛋白 共同表达能够增强大肠杆菌链抱红素的产量。
[0069] 10XPBS(pH7.4)的配方如下：
[0070] 憐酸二氨钢(化此P〇4): 14.4g;憐酸氨二钟化2册〇4): 2.4g;氯化钢(化C1): 80g;氯 化钟化Cl):2g。溶于800mL蒸馈水中，用肥1调节溶液的抑值至7.4，最后加蒸馈水定容至化。
[0071] W上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用W限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种还原酶，其特征在于，所述还原酶为： 由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的蛋白质； 将SEQ ID NO:2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加 且具有(E)-4-羟基-3-甲基-2-丁烯基二磷酸酯还原酶活性的由SEQID NO:2的氨基酸序列 组成的蛋白质衍生的蛋白质。2. 如权利要求1所述的还原酶，其特征在于，所述蛋白质的编码基因。3. 如权利要求2所述的还原酶，其特征在于，所述编码基因为： 核苷酸序列是SEQ ID N0:1的DNA分子； 与SEQ ID N0:1的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子； 与DNA分子或DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子具有90%以上的同源性且编码 所述蛋白质的DNA分子。4. 一种包含权利要求2或3所述编码基因的表达盒。5. -种包含权利要求2或3所述编码基因的重组表达载体。6. 根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为在载体 pSBls的多克隆位点插入所述编码基因得到的重组表达载体。7. -种包含权利要求2或3所述编码基因的转基因细胞系或重组菌。8. 根据权利要求7所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌为编码基因导入宿主菌得到 的重组菌;编码基因是重组表达载体导入宿主菌中的。9. 一种如权利要求1-3任意一项所述蛋白和编码基因在制备萜类化合物中的应用。10. -种如权利要求4-8任意一项所述重组表达载体、重组菌、表达盒或转基因细胞系 在制备萜类化合物中的应用。
【文档编号】C12N9/02GK106011090SQ201610423000
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月13日
【发明人】徐欣怡
【申请人】西安电子科技大学