一种酶活性提高的葡萄糖氧化酶突变体god-m01及其表达载体和应用

文档序号:10645124阅读:314来源:国知局
一种酶活性提高的葡萄糖氧化酶突变体god-m01及其表达载体和应用
【专利摘要】本发明提供了一种酶活性提高的葡萄糖氧化酶突变体GOD?M01及其表达载体和应用。本发明以根据巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的密码子偏好性进行过优化的葡萄糖氧化酶为基础,使用易错PCR 方法对该酶基因进行突变,再通过高通量筛选方法挑选出正突变,获得了酶活提高的葡萄糖氧化酶突变体GOD?M01,与原始基因产生的酶活相比,其酶活提高了47%,从而有利于实现其在工业化生产中降低生产成本的目的,本发明所提供的葡萄糖氧化酶突变体GOD?M01具有良好的市场应用前景和工业价值。
【专利说明】
-种酶活性提高的葡萄糖氧化酶突变体G0D-M01及其表达载 体和应用
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程和酶工程领域,具体内容设及一种酶活性提高的葡萄糖氧化 酶突变体G0D-M01及其表达载体和应用。
【背景技术】
[0002] 葡萄糖氧化酶(glucose oxidase, E.C.1.1.3.4, GOD)有氧条件下能专一性地 催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氨,在工业领域具有重要的应用价值,目前已经在 食品工业、畜牧养殖和医疗检测等领域中得到广泛应用。葡萄糖氧化酶广泛分布于动植物 和微生物体内,微生物是其主要来源,主要生产菌株为黑曲霉和青霉。产自特异青霉和黑曲 霉的葡萄糖氧化酶已被列入农业部《饲料添加剂品种目录(2013)》第4大类酶制剂。随着葡 萄糖氧化酶越来越多的被应用于各个领域,工业上尤其是饲料工业对其现有性能有了越来 越高的要求,其中葡萄糖氧化酶的催化效率决定了其应用成本,只有具有较高的酶活的葡 萄糖氧化酶才能有效控制成本,从而适应大规模工业化生产的要求,实现产品市场化和商 业化。筛选高酶活的天然葡萄糖氧化酶是一条重要途径,而使用蛋白质工程手段对天然葡 萄糖氧化酶的人工改造也越来越广泛地被应用。
[0003] 易错PCR(e;r;ro;r-p;rone PCR)技术是在利用化q酶进行PCR扩增目的基因时,通过调 整反应条件(如提高酶离子浓度,改变体系中4种dNTP的浓度等),改变化q酶的突变频率,从 而向目的基因中W-定频率引入突变,构建突变库,然后选择或筛选需要的突变体。为了获 得更好的突变效果,可W使用连续易错PCR (sequential error prone PCR)策略,即将一 次PCR扩增得到的正突变基因作为下一次PCR扩增的模板,连续反复地进行随机诱变,使每 一次扩增得到的正向突变累积而产生重要的有益突变。

【发明内容】

[0004] 本发明的目的是提供了一种酶活性提高的葡萄糖氧化酶突变体G0D-M01及其表达 载体和应用。本发明通过对来源于黑曲霉Uwer扣7扣S nigwO的葡萄糖氧化酶进行蛋白 质工程改造,使用易错PCR方法对葡萄糖氧化酶糖酶G0D-1基因进行突变,再通过高通量筛 选方法将正突变检出,获得了突变体蛋白,与野生型相比,突变体G0D-M01的酶活性得到显 著提高。
[0005] 为实现上述发明目的,本发明采用W下技术方案予W实现: 本发明提供了一种酶活性提高的葡萄糖氧化酶突变体G0D-M01,所述的葡萄糖氧化酶 突变体G0D-M01的氨基酸序列如SEQ ID ^):3所示,所述的突变体600-101由氨基酸序列为 SEQ ID NO: 1的葡萄糖氧化酶的第173位氨基酸由苏氨酸变为鄉氨酸获得。
[0006] 本发明还提供了所述的葡萄糖氧化酶突变体G0D-M01的葡萄糖氧化酶编码基因。
[0007] 进一步的,所述的葡萄糖氧化酶编码基因具有如SEQ ID N0:4所示的核巧酸序列。 [000引本发明还提供了含有所述的葡萄糖氧化酶编码基因的重组表达载体。
[0009] 进一步的,所述重组表达载体为重组酵母表达质粒PPIC9K- GOD-MOl。
[0010] 本发明还提供了含有所述的重组表达载体的重组菌株。
[0011] 进一步的,所述重组菌株为重组毕赤酵母。
[0012] 本发明还提供了所述的葡萄糖氧化酶突变体G0D-M01在用于制备动物饲料添加剂 中的应用。
[0013] 进一步的:将所述的葡萄糖氧化酶编码基因与表达载体连接构建重组表达载体, 将重组表达载体转化到宿主细胞中,获得重组宿主菌株,培养重组宿主菌株并诱导重组葡 萄糖氧化酶的表达,获得葡萄糖氧化酶。
[0014] 进一步的:所述宿主细胞为毕赤酵母。
[0015] 本发明的优点和技术效果是:本发明首先合成了葡萄糖氧化酶G0D-1全基因序 列,同时根据己斯德毕赤酵母密码子偏好性对其DNA序列进行优化获得优化的基因,并采 用易错PCR方法对其进行随机突变,W祀T 28a( + )载体构建高效突变库,再将含有突变基 因的质粒转入表达宿主中,挑选单克隆表达蛋白,同时每个孔板接种野生型基因表达菌株 作为对照。离屯、重悬后,取部分菌液测定酶活性。活性高于对照的菌株转接到新的培养板 中,进行重复筛选。将筛选得到的酶活性高于对照的菌株,送基因测序公司测序,获得突变 体G0D-M01的DNA序列。获得的酶活提高的突变体G0D-M01,与原始基因产生的酶活相比,其 酶活提高了47%,从而有利于实现其在工业化生产中降低生产成本的目的,本发明所提供的 葡萄糖氧化酶突变体G0D-M01具有良好的市场应用前景和工业价值。
【附图说明】
[0016] 图1为葡萄糖氧化酶突变体G0D-M01与野生型氨基酸序列比较结果; 图2为葡萄糖氧化酶突变体G0D-M01与野生型的酶活比较测定结果。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。W下结合 实施实例对本发明做进一步说明,需要指出的是,本实施例仅用于解释本发明,而非对本发 明范围的限制。
[0018] 实施例1:易错PCR(error-prone PCR)方法构建葡萄糖氧化酶G0D-1突变文库 来源于黑曲霉的葡萄糖氧化酶G0D-1由589个氨基酸组成(见SEQ ID NO: 1)。为迅速得 至化0D-1全基因序列W利于对G0D-1酶分子的改造,根据已报道的G0D-1基因序列信息, 采用全基因合成方法合成了葡萄糖氧化酶G0D-1全基因序列(如Genbank ID KJ774107.1 所示),合成的基因两端还带有EcoR I和Not I酶切位点。同时根据己斯德毕赤酵母密码子 偏好性对其DNA序列进行优化获得优化后的葡萄糖氧化酶基因 G0D-1 (见SEQ ID N0:2), 采用W优化后的GOD-1为模板扩增葡萄糖氧化酶糖酶GOD-1基因,使用GeneMorph II随机 突变PCR试剂盒(Stratagene)随机引入突变。
[0019]所用引物为: 5^-GCGCGAATTCTTGCCACATTACATTAGATCCAACGGTAT -3^(沈Q ID No:5), 5'-TAAAGCGGCCGCTTATTGCATAGAAGCGTAATCTTCCAAAATAGC-3^(沈Q ID No:6); 下划线处分别为EcoR I和Not I酶切位点。
[0020] 反应条件为:94° C预变性lOmin,94° C变性60s,58° C退火60s和72。C延伸 2min,共30个循环,1%琼脂糖电泳,试剂盒回收目的基因片段。
[0021] 将目的片段用EcoR I和Not I双酶切消化后,与经过相同酶切的pET 21a( + )载 体(氨节抗性基因)用Ligase进行连接反应。将连接好的片段转化至大肠杆菌化21-DE3,涂 布含有氨节青霉素的LB平板,37Γ倒置培养,待平板上出现转化子后,挑取单克隆至96孔 板,每孔中含有150uL LB培养基(含有ImM IPTG,50ng/mL氨节青霉素),同时每个孔板接种 野生型基因表达菌株作为对照,30°C 22化pm震荡培养12h,将孔板置于-20°C,反复冻融破 壁,获得含有葡萄糖氧化酶的粗酶液。取出5uL粗酶液至新的96孔板,加入含有邻联茵香胺 甲醇缓冲液、葡萄糖缓冲液、辣根过氧化物酶溶液的显色液共14加 L,37°C反应3min后加入 100uL2M硫酸终止反应,根据显色反应测定酶活。
[0022] 取酶活力比野生型G0D-1高的菌株到新的96孔培养板中,进行重复筛选。筛选到 其中一个突变体为G0D-M01,酶活力是野生型对照的1-2倍,挑取单克隆送基因测序公司测 序。
[0023] 巧崎结果显示,如图1所示,本轮易错PCR获得了一个含T173V单点突变的突变体 G0D-M01(其氨基酸序列为SEQ ID N0:3),编码产生突变体G0D-M01的葡萄糖氧化酶基因序 列如SEQ ID No:4所示。
[0024] 600-]\?)1:]\1111曰^〇11:1731'一¥(569 10齡:4与沈9 10齡:2相比,其0魁序列中第 173为氨基酸对应的核巧酸序列由ACT变为GTT,其余碱基序列相同)。
[0025] 实施例2:毕赤酵母工程菌株的构建 使用实施例1中所述引物,W实施例1获得的突变体作为模板进行PCR扩增,得到了3条 两端带有EcoR I和Not I酶切位点的葡萄糖氧化酶突变体基因。PCR反应条件为:94°C变性 5min;94°C 变性 30s,56°C 复性 30s,72°C 延伸 2min,30 个循环,72°C 延伸 lOmin。
[0026] 将上述克隆得到的葡萄糖氧化酶突变体基因片段和原始葡萄糖氧化酶GOD-1的基 因片段,通过EcoR I和Not I位点与表达载体PPIC9K相连接,构建表达载体PPIC9K- G0D- M01和PPIC9K- G0D-1。
[0027] 将W上表达载体用Sail进行线性化,线性化片段用片段纯化试剂盒(TaKaRa Mini邸ST DNA Fragment Purifibation Kit)纯化收集后,通过电转化方法转化毕赤酵母 GS115,涂布MD平板。将在MD平板上生长出的菌落涂布到浓度依次逐渐升高(Img/mL,2mg/ mL,4mg/mL,8mg/mL)的遗传霉素的YTO平板上筛选多拷贝的阳性转化子,得到毕赤酵母重组 困株。
[002引获得的转化子命名为毕赤酵母G0D-M01 (仍cAia仍sioris G0D-M01)和毕赤酵母 G0D-1(仍cAia G0D-1),分别挑取两个基因的转化子转接于BMGY培养基中,30°C, 22化pm振荡培养1她后,离屯、获得菌体,将适量菌体转入BMMY培养基中,使菌体浓度达到 00600=1,30°C,220巧m继续振荡培养,每2地添加培养体积1%的甲醇。诱导表达4d后,将培养 液离屯、获得上清,将上清液进行葡萄糖氧化酶活力测定。 葡萄糖氧化酶酶活力检测方法: 取邻联茵香胺缓冲液2.5血(0.1 mLl%邻联茵香胺甲醇储备液加入到12血0.1M PH6.0 憐酸缓冲液配成),18%葡萄糖溶液0.3mL,0.03%过氧化物酶溶液0.1 mL,加入到比色管中37 。(:保溫5 min,再加入0.1 mL葡萄糖氧化酶酶液(空白管加入0.1血蒸馈水),反应3min后,加 入2M硫酸2mL,混匀W终止反应。W标准空白样为空白对照,在540 nm波长处测定空白(Ao) 和试样溶液(Ai)的吸光值。得出ΔΑ= A广Ao 试样酶活力计算: X=( AAXnX3)/(11.3XtX0.1) Τ-测定时间,min 0.1 -样品体积,血 11.3-消光系数 N-稀释倍数 3-反应液体积,mL 酶活单位与定义:在抑5.5、37°C的条件下,每分钟能把Ι.Ομ mol的β-D-葡萄糖氧化成葡 萄糖酸和出化的酶量为一个单位。
[0029] 酶活测定结果:如图2所示,按照上述方法测定得到毕赤酵母G0D-1发酵上清液的 酶活为53 U/mL,而毕赤酵母G0D-M01发酵上清液的酶活为78 U/mL,酶活水平提高了47%。
[0030] 实施例3:葡萄糖氧化酶的养殖应用实验 3.1实验设计 实验过程选择体况相似、健康无病的罗斯308肉维鸡160000只,分为对照组和实验组, 每组80000只,每组设置4个重复,每个重复20000只鸡,1、3、5、7栋鸡舍为实验组,2、4、6、8栋 鸡舍为对照组,其中实验组在日粮中添加本发明提供的葡萄糖氧化酶G0D-M01,饲养期40 天,具体分组见表1。
[0031] 表1:实验分组设计
3.2生产性能的测定 实验开始第1天和第21、40天清晨对各组鸡空腹称重,记录初始重和末重。饲养过程中, 观察记录各组鸡的健康状况(采食、饮水、精神状态等),并详细记录每周每笼采食量,统计 实验期内的平均日增重、平均日采食量和料重比。平均日采食量(g/d)=实验期每组采食量/ 实验天数?每组鸡数;平均日增重(g/d)=实验期每组增重/(实验天数?每组鸡数);料重比 =饲料消耗量/增重。
[0032] 3.3数据统计与分析 实验数据采用SPSS17.0统计软件进行AN0VA分析,并进行Duncan多重性比较,代0.05为 差异显著。数据W平均值±标准差(Mean±SE)表示。
[0033] 3.4实验结果与分析 3.4.1平均日增重 肉鸡各阶段平均日增重见表2,肉鸡的平均日增重在1-21日龄和22-40日龄实验组较之 对照组都有不同程度的改善,分别提高了 0.90%和6.29%。在1-40日龄整个饲养周期,实验组 可提高平均日增重3.8P/0。
[0034] 表2:肉鸡各阶段平均日增重(克)
3.4.2平均日采食量 肉鸡各阶段平均日采食量见表3,在整养殖过程,实验组与对照组肉鸡日采食量差异不 显著(A0.05),且对照组和实验组日采食量基本一致。
[00巧]表3:肉鸡各阶段平均日采食量(克)
3.4.3料重比 肉鸡各阶段料重比见表4,在1-21日龄和22-40日龄实验组较之对照组都有不同程度的 改善,分别降低了 7.90%和5.03%。从全期(1 -40日龄)来看,实验组FCR较对照组降低了 6.06% (A0.05)。
[0036] 表4:肉鸡各阶段料肉比(FCR) _^^
从W上实验结果可W看出,添加了葡萄糖氧化酶G0D-M01的实验组与对照组相比,在采 食量一致的情况下,平均日增重有所增加,而料重比有所下降,在日粮中添加葡萄糖氧化酶 的情况下,可W有效提高饲料转化率,增加养殖效益。
[0037] 本实施例3为了便于体现本发明所述的葡萄糖氧化酶的应用,并不限于肉鸡的应 用,因为所述的葡萄糖氧化酶可W添加到基础日粮中,可W用于其他畜禽类的饲喂。通常可 W在猪、兔和奶牛等养殖过程中在其配合饲料中添加。
[0038] W上实施例仅用W说明本发明的技术方案,而非对其进行限制;尽管参照前述实 施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的普通技术人员来说,依然可W对前述实施 例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而运些修改或替 换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
【主权项】
1. 一种酶活性提高的葡萄糖氧化酶突变体G0D-M01,其特征在于,所述的葡萄糖氧化酶 突变体G0D-M01的氨基酸序列如SEQ ID如:3所示,所述的突变体600-101由氨基酸序列为 SEQ ID NO: 1的葡萄糖氧化酶的第173位氨基酸由苏氨酸变为缬氨酸获得。2. 权利要求1所述的葡萄糖氧化酶突变体G0D-M01的葡萄糖氧化酶编码基因。3. 根据权利要求2所述的葡萄糖氧化酶编码基因,其特征在于其具有如SEQ ID N0:4所 示的核苷酸序列。4. 含有权利要求2所述的葡萄糖氧化酶编码基因的重组表达载体。5. 根据权利要求4所述的重组表达载体,其特征在于所述重组表达载体为重组酵母表 达质粒PPIC9K- G0D-M01。6. 含有权利要求4所述的重组表达载体的重组菌株。7. 根据权利要求6所述的重组菌株,其特征在于所述重组菌株为重组毕赤酵母。8. 权利要求1所述的葡萄糖氧化酶突变体G0D-M01在用于制备动物饲料添加剂中的应 用。9. 根据权利要求8所述的葡萄糖氧化酶突变体G0D-M01在用于制备动物饲料添加剂中 的应用,其特征在于:将所述的葡萄糖氧化酶编码基因与表达载体连接构建重组表达载体, 将重组表达载体转化到宿主细胞中,获得重组宿主菌株,培养重组宿主菌株并诱导重组葡 萄糖氧化酶的表达,获得葡萄糖氧化酶。10. 根据权利要求9所述的葡萄糖氧化酶突变体G0D-M01在用于制备动物饲料添加剂中 的应用,其特征在于:所述宿主细胞为毕赤酵母。
【文档编号】A23K20/189GK106011093SQ201610525903
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月6日
【发明人】肖志壮, 张稳
【申请人】青岛红樱桃生物技术有限公司
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