工程化酮还原酶多肽及使用其制备依替米贝中间体的方法
【专利摘要】本发明公开了一种工程化酮还原酶多肽及使用其制备依替米贝中间体的方法，在制备依替米贝中间体的过程中，采用本发明的工程化酮还原酶多肽，与现有技术相比，酶用量低、反应时间短、底物浓度高，更加适合产业化应用。
【专利说明】
工程化酬还原酶多化及使用其制备依替米贝中间体的方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物制药和生物转化领域，具体设及一种工程化酬还原酶多肤及使用 其制备依替米贝中间体的方法。
【背景技术】
[0002] 依替米贝化zetimibe)是一种新型选择性胆固醇吸收抑制剂，由于与现有的他汀 类降血脂药物有不同的作用机制，因此具有稳定的市场份额。制备其中间体(S)-3-((S)-5- (4-氣苯基)-5-?基戊酷基)-4-苯基-2-酬基-嗯挫烧(2)的方法有重要的应用价值。可W通 过由还原(S)-1-(4-氣苯基)-5-(2-酬-4苯基嗯挫烧-3-基)-1,5-二酬戊烧(1)的反应获得：
[0003]
[0004] 化学法还原如专利CN 103965089、CN 104402790和文献Journal of Labelled Compounds&Radio地armaceuticals,45(2), 145-155;2002等报道，采用棚烧等高危试剂和 极端反应条件，存在应用风险。生物法如专利W0 2010025085和文献化em. Commun .，2015， 51,12328-12331报道，采用醇脱氨酶和酬还原酶催化反应。目前生物法中存在的问题是方 法存在酶量较高(2.3%)，反应时间长（1化），底物浓度低（13%)和有机溶剂用量(25%)较 局等问题。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种工程化酬还原酶多肤及使用其制 备依替米贝中间体的方法。
[0006] 为达到上述目的，本发明采用的技术方案是:一种能够将底物(S)-1-(4-氣苯基)- 5-(2-酬-4苯基嗯挫烧-3-基)-1,5-二酬戊烧转化为产物(S)-3-((S)-5-(4-氣苯基)-5-径 基戊酷基)-4-苯基-2-酬基-嗯挫烧的工程化酬还原酶多肤，所述的酬还原酶多肤的氨基酸 序列与序列2、4、6、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46中的 任一序列具有至少90%的同源性。其中，序列2为来自化11山(13 1]1曰旨]1〇11曰6的野生型酬还原 酶，其他的序列通过易错PCR等随机突变和活性位点盒式突变(CASTing)等定点突变方法获 得，突变体获得增强的活性和稳定性，可W通过高通量筛选化TS)等方法探知，上述的改变 氨基酸序列和筛选突变体库方法，均为本领域内的常规技术。
[0007] 本发明提供了一种编码多肤的多核巧酸。优选地，所述的多核巧酸，其选自序列1、 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45中的任一序列。
[000引本发明提供了一种表达载体所述表达载体包含与适合指导在宿主细胞中表达的 控制序列可操作地连接的多核巧酸。优选地，该多核巧酸的序列为SEQ ID NO:45。该表达载 体为祀T30a。
[0009] 本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含上述表达载体，如大肠杆菌、枯 草芽抱杆菌、地衣芽抱杆、黑曲霉、酿酒酵母和毕赤酵母等。优选地，该宿主细胞为大肠杆 困。
[0010] 本发明的另一个目的是提供一种所述的酬还原酶多肤生物催化制备依替米贝中 间体的方法，所述方法W化合物1为底物，在适于将其还原为化合物2的反应条件下与上述 的酬还原酶多肤接触，其中：
[0011] 所述化合物1的结构式为：
[0012]
[0013] 所述化合物2的结构式为：
[0014]
〇
[0015] 优选地，所述反应在辅酶和辅酶再生系统的存在下，在抑为6.0~8.0、溫度为25°C ~30°C的缓冲溶液中进行，其中，所述的辅酶为NADP，所述的辅酶再生系统为葡萄糖和葡萄 糖脱氨酶。常见的辅因子再生系统包括但不限于葡萄糖和葡萄糖脱氨酶、甲酸和甲酸脱氨 酶、葡萄糖-6-憐酸和葡萄糖-6-憐酸脱氨酶、仲醇(如异丙醇)和仲醇脱氨酶、亚憐酸和亚憐 酸脱氨酶、分子氨和氨化酶W及电化学等方法。
[0016] 进一步优选地，所述的葡萄糖脱氨酶为购自苏州汉酶生物技术有限公司生产的牌 号为EW002的葡萄糖脱氨酶。
[0017] 优选地，所述的还原反应在助溶剂条件下进行，所述的助溶剂为甲苯。
[0018] 由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：在制备依替米 贝中间体的过程中，采用了工程化酬还原酶，克服了现有技术中采用化学法制备中所存在 的应用风险;采用生物法制备过程中存在的酶用量高、反应时间长、底物浓度低、有机溶剂 用量高的问题，本发明采用了工程化酬还原酶作为生物催化剂，使得整个制备过程中，酶用 量低（1 % )、反应时间短（1化），底物浓度高，可达15 %，更加适合产业化应用。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于W下实施 例。实施例中采用的实施条件可W根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施 条件为常规实验中的条件。
[0020] 实施例1(酬还原酶的制备）：
[0021] 采用常规方法制备获得了酬还原酶催化剂:序列表中1、3、5、7、9、11、13、15、17、 19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45的基因片段是由苏州金唯智生物科技有限 公司合成，与祀T30a(Novagen)质粒的酶切产物连接，转入感受态E.coli BL2UDE3)菌株， 筛选得到阳性克隆子，接种到含有抗性的液体LB培养基中，于37°C培养至0D600至0.8,加入 诱导剂IPTG，继续培养16小时，离屯、收集沉淀，加入憐酸盐缓冲液悬浮，冰水浴中超声波破 碎10分钟，离屯、取上清，冷冻得到酬还原酶酶粉。
[0022] 实施例2(酬还原酶的筛选）
[0023] 由序列1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45 分别在大肠杆菌中表达获得的酬还原酶2mg，葡萄糖脱氨酶(采购自苏州汉酶生物技术有限 公司，牌号EW002)2mg，NADP Img，底物(S)-1-(4-氣苯基)-5-(2-酬-4苯基嗯挫烧-3-基)-1， 5-二酬戊烧50mg、葡萄糖50mg加至装有2mL 0.05ΜΞ乙醇胺缓冲液的5mL反应器中，30°C lOOOrpm揽拌，比后取样，HPLC检测，序列45的转化率和ee均为>99%。因此，采用序列45作为 进一步研究对象。
[0024] 实施例3(酶催化反应）：
[0025] 向50mL反应Ξ口瓶中依次加入50mg酬还原酶（由序列45在大肠杆菌中表达获得）， lOmg葡萄糖脱氨酶(采购自苏州汉酶生物技术有限公司，牌号EW002)和4mg NADP的Ξ乙醇 胺缓冲液，5g底物(S)-1-(4-氣苯基)-5-(2-酬-4苯基嗯挫烧-3-基)-1,5-二酬戊烧，3.5g葡 萄糖，27mL0.05MpH7.0Ξ乙醇胺缓冲液，6mL甲苯，溫度调节至3(rC，900r/min揽拌，15% 化2〇)3溶液维持抑至7.0，反应12h，HPLC检测转化率99%，等体积乙酸乙醋萃取3次，合并有 机相，旋蒸得到产品4.8g，含量98%。
[0026] 上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人 ±能够了解本发明的内容并据W实施，并不能W此限制本发明的保护范围。凡根据本发明 精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种能够将底物(S)-1-(4-氟苯基)-5-(2-酮-4苯基噁唑烷-3-基)-1，5_二酮戊烷转 化为产物(S)-3-((S)-5-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基)-4-苯基-2-酮基-噁唑烷的工程化酮 还原酶多肽，以其特征在于，所述的酮还原酶多肽的氨基酸序列与序列2、4、6、10、12、14、 16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46 中的任一序列具有至少 90% 的同源 性。2. -种编码如权利要求1所述的多肽的多核苷酸。3. 根据权利要求2所述的多核苷酸，其选自序列1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、 25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45中的任一序列。4. 一种表达载体，所述表达载体包含与适合指导在宿主细胞中表达的控制序列可操作 地连接的权利要求3所述的多核苷酸。5. -种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求4所述的表达载体。6. 根据权利要求5所述的宿主细胞，其为大肠杆菌。7. -种使用权利要求1中所述的酮还原酶多肽生物催化制备依替米贝中间体的方法， 其特征在于，所述方法以化合物1为底物，在适于将其还原为化合物2的反应条件下与权利 要求1所述的酮还原酶多肽接触，其中： 所述化合物1的结构式为： 所述化合物2的结构式38. 根据权利要求7所述的制备依替米贝中间体的方法，其特征在于，所述反应在辅酶和 辅酶再生系统的存在下，在PH为6.0~8.0、温度为25°C~30°C的缓冲溶液中进行，其中，所 述的辅酶为NADP，所述的辅酶再生系统为葡萄糖和葡萄糖脱氢酶。9. 根据权利要求8所述的制备依替米贝中间体的方法，其特征在于，所述的葡萄糖脱氢 酶为购自苏州汉酶生物技术有限公司生产的牌号为EW002的葡萄糖脱氢酶。10. 根据权利要求7所述的制备依替米贝中间体的方法，其特征在于，所述的还原反应 在助溶剂条件下进行，所述的助溶剂为甲苯。
【文档编号】C12N15/53GK106011095SQ201610596717
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月27日
【发明人】付敏杰, 魏喜换
【申请人】苏州汉酶生物技术有限公司