一种酶及其编码基因和它们的应用以及制备人参皂苷化合物k的方法

一种酶及其编码基因和它们的应用以及制备人参皂苷化合物k的方法
【专利摘要】本发明涉及生物领域，公开了一种酶及其编码基因和它们的应用以及制备人参皂苷化合物K的方法。具体地，本发明提供了一种酶及其编码基因，含有该基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，以及以该酶作为活性成分的组合物，及其在降解糖苷类化合物中的应用，并且提供了一种制备人参皂苷化合物K的方法。将本发明提供的酶用于降解三七叶总皂苷中的人参皂苷Rb3和绞股蓝皂苷IX时，其可能通过作用于人参皂苷Rb3和绞股蓝皂苷IX中C20位的木糖糖苷结构，同时也可将其C3位的葡萄糖水解下来，从而获得人参皂苷CK，并且人参皂苷CK的转化率在84％以上。
【专利说明】
-种酶及其编码基因和它们的应用从及制备人参皂昔化合物 K的方法
技术领域
[0001] 本发明设及基因工程领域，具体地，设及一种酶及其编码基因和它们的应用W及 一种制备人参皂巧化合物K的方法。
【背景技术】
[0002] 人参皂巧化合物K(人参皂巧Compound K，人参皂巧CK，结构式如下式I所示）是二 醇型人参皂巧（例如，人参皂巧肺3和绞股蓝皂巧IX，结构式分别如下式II和ΙΠ 所示)在人 体肠道内的主要代谢产物，属于稀有人参皂巧。研究发现人参皂巧CK在体内外都有良好的 抑制肿瘤细胞生长和转移的作用，是一种潜在抗肿瘤药物，并且在抗衰老、改善记忆、抗炎 等各方面都有一定的疗效。因此，如何获得大量的人参皂巧CK是目前药学研究的重点。
[0005]
[0006] 目前，人参皂巧CK主要通过生物转化法或生物合成法获得。其中，生物转化法是利 用有机体(细胞、细胞器)或酶作为催化剂实现化学转化的过程，是生物体系(包括细菌、真 菌和植物组织等)对外源性底物进行结构修饰的化学反应。其本质是利用生物本身所产生 的酶对外源底物进行的催化反应。生物转化具有反应条件溫和、不易破坏皂巧结构、副产物 少、后处理简单及对环境友好等优点。近年来，W人参皂巧为原料进行生物转化W获得人参 皂巧CK的研究越来越多，特别是利用微生物或酶对二醇型人参皂巧的C3和C20位的糖巧结 构进行修饰，使含量较高的人参皂巧的糖巧经过水解作用，定向转化为人参皂巧CK。根据构 成糖巧结构的糖基的不同，人参皂巧中常见的糖巧结构包括葡萄糖巧、木糖巧、乳糖巧、阿 拉伯糖巧等。但是，现有的用于人参皂巧生物转化的酶大部分具有高度专一性，即仅可W特 异性作用于某一种糖巧结构，而无法满足同时作用于一种W上糖巧结构的要求，从而导致 转化率较低。因此，急需研发可W同时作用于一种W上糖巧结构的酶，W提高生成人参皂巧 CK的生物转化率。

【发明内容】

[0007] 本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种新型的具有木糖巧酶和/或 葡萄糖巧酶双功能的酶及其编码基因和它们的应用W及制备人参皂巧化合物K的方法。
[0008] 为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种酶，其中，该酶为(a)或(b):
[0009] (a)由SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列组成的酶；
[0010] (b)SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且酶 活性不变的由（a)衍生的酶，或者，由在SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列的氨基末端和/或簇 基末端连接有标签的氨基酸序列组成的酶。
[0011] 第二方面，本发明提供了编码第一方面所述酶的基因。
[0012] 第Ξ方面，本发明提供了含有第二方面所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞 系或重组菌。
[0013] 第四方面，本发明提供了一种组合物，其中，该组合物含有第一方面所述的酶作为 活性成分。
[0014] 第五方面，本发明提供了第一方面所述的酶、第二方面所述的基因、第Ξ方面所述 的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，W及第四方面所述的组合物中的任意一项在 降解糖巧类化合物中的应用。
[0015] 第六方面，本发明提供了一种制备人参皂巧化合物Κ的方法，该方法包括:在酶解 条件下，将含有糖巧类化合物的原料与酶接触，其中，所述酶由第一方面所述的酶和/或由 第四方面所述的组合物提供。
[0016] 通过上述技术方案，将本发明提供的酶用于降解人参皂巧肺3、绞股蓝皂巧IX和Ξ 屯叶总皂巧时，其可能能够作用于人参皂巧肺3和绞股蓝皂巧IX中C20位的木糖糖巧结构， 同时也可将其C3位的两个葡萄糖水解下来，从而获得人参皂巧CK，并且人参皂巧CK的转化 率在84% W上。
[0017] 本发明的其它特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予W详细说明。
【附图说明】
[0018] 附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具 体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0019] 图1为本发明的实施例1获得的重组质粒的双酶切验证结果，其中，1为DNA标记物， 2-5为重组质粒；
[0020] 图2为本发明的实施例1获得的重组酶SDS-PAGE电泳图，其中，Μ为蛋白标记物，1为 粗酶液，2为纯化的酶液；
[0021] 图3为本发明的实施例1中酶活力测定的标准曲线图；
[0022] 图4为本发明的实施例2和3中经由实施例1获得的酶液水解的人参皂巧肺3和绞股 蓝皂巧IX反应结果的化C分析图，其中，1为人参皂巧CK纯品对照，2为人参皂巧肺3纯品对 照，3为绞股蓝皂巧IX纯品对照，4为经实施例1获得的酶液水解的人参皂巧肺3，5为经实施 例1获得的酶液水解的绞股蓝皂巧IX;
[0023] 图5为本发明的实施例2中人参皂巧CK的HPLC色谱图，其中，A为转化前的结果，Β为 转化后的结果；
[0024] 图6为本发明的实施例3中人参皂巧CK的HPLC色谱图，其中，A为转化前的结果，B为 转化后的结果；
[0025] 图7为本发明的实施例4中人参皂巧CK的HPLC色谱图，其中，A为转化前的结果，B为 转化后的结果。
【具体实施方式】
[0026] W下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0027] 在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，运些范围或 值应当理解为包含接近运些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各 个范围的端点值和单独的点值之间，W及单独的点值之间可W彼此组合而得到一个或多个 新的数值范围，运些数值范围应被视为在本文中具体公开。
[0028] 在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的术语"酶活力"的大小即酶含量的 多少，用酶活力单位化)表示，本发明中酶活力单位的定义是:在抑4.5和45°C的条件下，W 对硝基苯基-β-D-木糖巧为底物，每分钟水解产生ΙμL?ο?对硝基苯酪的酶量为一个酶活力单 位。
[0029] 第一方面，本发明提供了一种酶，其中，该酶为(a)或(b):
[0030] (a)由SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列组成的酶；
[0031] (b)SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且酶 活性不变的由（a)衍生的酶，或者，由在SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列的氨基末端和/或簇 基末端连接有标签的氨基酸序列组成的酶。其中，酶活性不变是指在相同的测定条件下，由 (a)衍生的蛋白质的底物转化率与(a)的底物转化率之间的百分比（相对活性)不低于95% (或96%，或97%，或98%，或99%，或 100% )。
[0032] 组成蛋白质的20种氨基酸残基，按照侧链极性可W分成四类：1、非极性的氨基酸： 丙氨酸（Ala)、鄉氨酸（Val)、亮氨酸化eu)、异亮氨酸（lie)、甲硫氨酸（Met)、苯丙氨酸 (Phe)、色氨酸（Trp)和脯氨酸（Pro); 2、极性不带电荷的氨基酸：甘氨酸（Gly)、丝氨酸 (Ser)、苏氨酸(Thr)、半脫氨酸(切S)、天冬氨酸(Asn)、谷氨酷胺(Gin)和酪氨酸(Tyr);3、带 正电荷的氨基酸:精氨酸(Arg)、赖氨酸化ys)和组氨酸化is) ;4、带负电荷的氨基酸:天冬氨 酸(Asp)和谷氨酸(Glu)(参见"生物化学"（第二版)上册，沈同、王镜岩，第82-83页，高等教 育出版社，1990年12月）。蛋白质中如果发生同属一个类别的氨基酸残基取代，例如由Arg取 代Lys或由Leu取代lie,所述残基在蛋白质结构域中所起的作用（比如提供正电荷或形成疏 水囊袋结构的作用)没有改变，因此对蛋白质的立体结构并不会产生影响，因此仍然可W实 现蛋白的功能。所述同属一个类别的氨基酸残基取代可W发生在上述酶的任意一个氨基酸 残基位置上。
[0033] 如前所述，本发明提供的酶还可W进行修饰或突变，得到衍生的蛋白质。本发明所 述"衍生的蛋白质"指与具有上述氨基酸序列的酶具有氨基酸序列上的差异，也可W有不影 响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。运些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。所述 诱导变异体可W通过各种技术得到，如福射或诱变剂等产生的随机突变，也可W通过如定 点突变法或其他已知分子生物学的技术。所述"衍生的蛋白质"还包括具有天然L型氨基酸 的残基的类似物(如D型氨基酸），W及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β-氨基酸、丫- 氨基酸等)的类似物。
[0034] 修饰(通常不改变一级结构，即不改变氨基酸序列）形式包括:体内或体外的蛋白 的化学衍生形式如乙酷化或簇基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白的合成和加工中或 进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白。运种修饰可W通过将蛋白暴露于进行糖 基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有憐酸化氨基 酸残基(如憐酸酪氨酸，憐酸丝氨酸，憐酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋 白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。
[0035] 为了方便纯化，还可W采用本领域常见的标签对(a)进行添加修饰，举例来说，（b) 可W通过在(a)的氨基末端和/或簇基末端连接下表1所示的标签(如Poly-Arg、Poly-化S、 化AG、Strep-tag Π 和c-myc中的至少一种）而获得。所述标签不会影响本发明提供的酶的 活性，在实际应用过程中，可W根据需求选择是否添加标签。
[0036] 表1
[0037]

[0038] 上述酶可W通过人工合成得到，也可W先合成其编码基因，再通过生物表达获得。
[0039] 第二方面，本发明提供了编码第一方面所述的酶的基因。相应地，所述基因可W为 如下的（1)或(2):
[0040] (1)核巧酸序列如SEQ ID ^:2所示的0臟分子；
[0041] (2)在严格条件下与（1)限定的DNA序列杂交且编码的酶的酶活性不变的DNA分子。 其中，所述严格条件可W为:在6 X SCC，0.5 % SDS的溶液中，在65 °C下杂交，然后用2 X SCC， 0.1 % SDS和1 X SCC，0.1 % SDS各洗膜一次。酶活性不变是指在相同的测定条件下，由（2)编 码的蛋白质的底物转化率与（1)编码的蛋白质的底物转化率之间的百分比（相对活性)不低 于95% (或96%，或97%，或98%，或99%，或 100% )。
[0042] 本领域公知，组成蛋白质的20种不同的氨基酸中，除Met(ATG)或化p(TGG)分别为 单一密码子编码外，其他18种氨基酸分别由2-6个密码子编码(Sambrook等，分子克隆，冷泉 港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989,见950页附录D)。即由于遗传密码子的简并性， 决定一个氨基酸的密码子大多不止一个，Ξ联体密码子中第Ξ个核巧酸的置换，往往不会 改变氨基酸的组成，因此编码相同蛋白的基因的核巧酸序列可W不同。本领域人员根据公 知的密码子表，从本发明公开的氨基酸序列，W及由所述氨基酸序列得到的酶活性不变的 氨基酸序列，完全可W推导出能够编码它们的基因的核巧酸序列，通过生物学方法(如PCR 方法、突变方法)或化学合成方法得到所述核巧酸序列，因此该部分核巧酸序列都应该包括 在本发明范围内。相反，利用本文公开的DNA序列，也可W通过本领域公知的方法，例如 Sambrook等的方法(分子克隆，冷泉港实验室出版社，纽约，美国，第二版，1989)进行，通过 修改本发明提供的核酸序列，得到与本发明所述酶的活性一致的氨基酸序列。
[0043] 优选地，所述基因的核巧酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0044] 如上所述，相应地，核巧酸序列的5'端和/或3'端还可W连接有上表1所示的标签 的编码序列。
[0045] 本发明提供的核巧酸序列通常可W用聚合酶链式反应(PCR)扩增法、重组法、或人 工合成的方法获得。例如，本领域技术人员根据本发明所提供的核巧酸序列，可W很容易得 到模板和引物，利用PCR进行扩增获得有关序列。
[0046] -旦获得了有关核巧酸序列，就可W用重组法大批量的获得有关氨基酸序列。通 常将所得核巧酸序列克隆入载体，再转入基因工程菌中，然后通过常规的方法从增殖后的 宿主细胞分离得到有关核巧酸序列。
[0047] 此外，还可用公知的人工化学合成的方法来合成有关核巧酸序列。
[0048] 第Ξ方面，本发明还提供了含有第二方面所述基因的重组载体、表达盒、转基因细 胞系或重组菌。
[0049] 在本发明中，所述重组载体可W含有本发明提供的基因。重组载体中使用的"载 体"可选用本领域已知的各种载体，如市售的各种质粒、粘粒、隧菌体及反转录病毒等，本发 明优选pPICZoA质粒。重组载体的构建可采用能够在载体多克隆位点具有切割位点的各种 核酸内切酶(如对于pUC18,可用Sal I、BamH I、EcoR I等;对于pPICZoA，可用Nde I、Mie I、 EcoRI、BamH、化ndm等)进行酶切获得线性质粒，与采用相同核酸内切酶切割的基因片段连 接，获得重组质粒。本发明优选采用EcoR I和Xba I双酶切pPICZoA及与其连接的基因片段， 经连接酶连接，构建得到重组载体。
[0050] 在本发明中，所述表达盒可W通过将本领域常用的报道基因与本发明所述基因相 连获得。优选地，所述表达盒还包括启动子和/或增强子。
[0051] 在本发明中，所述转基因细胞系可W为含有本发明的重组载体的细胞，例如，可W 通过将本发明的重组载体转入细胞中获得。
[0052] 本发明提供的重组菌可W含有本发明提供的重组载体。本发明提供的酶还可W通 过W下方法制得:培养本发明提供的重组菌，诱导编码所述酶的基因的表达;分离提纯所表 达的酶。
[0053] 在本发明中，可W通过本领域常规的方法将所述重组载体转化、转导或者转染到 宿主细胞(菌株）中W获得重组菌，如氯化巧法化学转化、高压电击转化，优选电击转化。所 述宿主细胞可W为原核细胞或真核细胞，优选为酵母，更优选为毕赤酵母。
[0054] 第四方面，本发明提供了一种组合物，其中，该组合物含有第一方面所述的酶作为 活性成分。
[0055] 在本发明中，W所述组合物的总重量为基准，所述酶的含量为10-90重量％。优选 地，所述组合物中还可W含有本领域技术人员公知的溶剂(如甘油、糖类和蛋白酶抑制剂等 蛋白保护剂）、激动剂等。
[0056] 第五方面，本发明提供了第一方面所述的酶、第二方面所述的基因、第Ξ方面所述 的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，W及第四方面所述的组合物中的任意一项在 降解糖巧类化合物中的应用。
[0057] 在本发明中，所述降解的过程可W是使糖巧类化合物中的糖巧键发生水解而断裂 的过程。
[0058] 在本发明中，优选情况下，所述糖巧类化合物选自含有β-木糖残基的化合物和/或 含有葡萄糖残基的化合物。更优选地，所述糖巧类化合物为人参皂巧类化合物，进一步优选 为二醇型人参皂巧，最优选为人参皂巧肺3和/或绞股蓝皂巧IX。
[0059] 第六方面，本发明提供了一种制备人参皂巧化合物Κ的方法，该方法包括:在酶解 条件下，将含有糖巧类化合物的原料与酶接触，其中，所述酶由第一方面所述的酶和/或由 第四方面所述的组合物提供。
[0060] 在本发明中，W所述原料的总重量为基准，所述酶的用量可W为1-lOU/mg，优选为 1-抓/mg。
[0061] 在本发明中，所述酶解条件可W包括:酶解的溫度为40-70°C，pH值为3-7,酶解的 时间为10-6化;优选为，酶解的溫度为40-50°C，pH值为4.5-5.5，酶解的时间为20-5化。
[0062] 在本发明中，所述糖巧类化合物可W为含有β-木糖残基的化合物和/或含有葡萄 糖残基的化合物，优选为人参皂巧类化合物，更优选为二醇型人参皂巧，最优选为人参皂巧 肺3和/或绞股蓝皂巧IX。
[0063] 在本发明中，所述含有糖巧类化合物的原料可W由人参、西洋参和Ξ屯中的至少 一种提供。
[0064] W下将通过实施例对本发明进行详细描述。W下实施例中，人参皂巧CK的转化率 =转化产物中CK的实际质量^原料转化为CK的理论质量X 100%。
[00化]实施例1
[0066] 本实施例用于说明本发明提供的酶的制备。
[0067] (1)基因的获得
[0068] 根据SEQ ID NO: 1所示的核巧酸序列通过人工化学合成法(委托昆明硕擎生物科 技有限公司)获得相应的基因。
[0069] (2)表达载体和重组菌株的构建
[0070] 对由步骤(1)获得的基因 W及毕赤酵母表达载体pPICZoA(购于美国Invitrogen公 司）均进行EcoR I和Xba I双酶切，然后使用T4连接酶(购于宝生物工程(大连)有限公司）将 上述两个经酶切后的产物连接，获得重组质粒，该重组质粒的双酶切验证结果如图1所示， 其中，1为DNA标记物，2-5为重组质粒。
[0071] 将获得的重组质粒转化毕赤酵母GS115(购自美国Invi化ogen，货号为C18100)获 得重组酵母。
[0072] (3)酶的制备
[0073] 将得到的重组酵母接种于培养基BMGY(将lOg酵母提取物、20g蛋白腺溶解到700mL dd出0中，121°C下灭菌20min。待冷却至室溫后加入Imol/L憐酸钟缓冲液(pH 6)100血，10 X YNB 100血、10XG 100血、500XB 2mL，混匀，4°C保存）中，28°C培养2-3d至ODsqqA值在2-6之 间，离屯、收集菌体用BMMY培养基(将lOg酵母提取物、20g蛋白腺溶解到700mL d地2〇中，121 °C下灭菌20min。待冷却至室溫后加入Imol/L憐酸钟缓冲液(pH 6)100mL，10XYNB lOOmL、 10 XΜ 1 OOmL、500 X B 2mL，混匀，4°C保存)稀释至ODsooA = 1.0，在30°C继续培养，每隔24h添 加0.5%甲醇诱导培养7d，离屯、收集上清，获得粗酶液。
[0074] 将粗酶液置于冰上，缓慢加入磨碎的硫酸锭粉末，边加边揽拌，添加到硫酸锭饱和 为止。在4°C静置2地左右，12000r/min离屯、50min，弃上清，用少量PBS溶解沉淀。将PBS溶解 的沉淀透析，除去硫酸锭，重悬于含lOmM咪挫的PBS缓冲液中。根据表达出的重组酶含有化S 标签，利用Ni柱进行亲和层析纯化:憐酸缓冲液(pH 7.4，50mM化C1，含lOmM咪挫），ImL/min 平衡Ni柱后，W流量0.5mL/min直接将重悬的粗酶液上样;继续使用含lOmM咪挫的憐酸缓冲 液ImL/min洗脱未吸附或吸附的非特异性杂蛋白；W憐酸缓冲液(pH 7.4,50mM NaCl，500mM 咪挫)洗脱收集目的蛋白，W获得纯化的酶液。纯化的酶液用10%SDS蛋白凝胶电泳检测，结 果如图2所示，其中，Μ为蛋白标记物，1为粗酶液，2为纯化的酶液。
[0075] (4)酶活力测定
[0076] 分别吸取0.1 mmol/L ρΝΡ溶液（对硝基苯酪，配制方法：准确称取对硝基苯酪 13.9mg，用蒸馈水定容至 1 OOOmL) 0.1血、0.5mL、ImL、1.5mL、2. OmL、2.5mL至 1 OmL容量瓶中， 用2mol/L碳酸钢溶液(配制方法:称取碳酸钢211.98g，定容至lOOOmL)定容后混匀。W蒸馈 水作为空白，于405nm处比色，测定其吸光值，W对硝基酪浓度为横坐标，吸光值为纵坐标， 绘制标准曲线，如图3所示。
[0077] 将10化上述纯化的酶液和90化0.2mol/L憐酸氨二钢-0.1mol/L巧樣酸缓冲液于 45°C水浴锅平衡5min，加入平衡后的5mmol/L的pNPX 10化L(4-硝基苯基β-D-化喃木糖巧溶 液:准确称取pNPX 0.1356g，溶于lOOmLO. 2mol/L憐酸氨二钢-0.1mol/L巧樣酸缓冲液），反 应lOmin后，加入10化L2mol/L碳酸钢溶液终止反应，测定405nm处的吸收值。经测定，纯化的 酶液的活力为抓/mL。
[007引实施例2
[0079] 本实施例用于说明本发明提供的酶在制备人参皂巧CK中的应用。
[0080] 取2mL由实施例1获得的纯化的酶液，加入人参皂巧肺3纯品（云南与诺生物工程有 限责任公司参照文献(李海舟，张颖君，杨崇仁.Ξ屯叶化学成分的进一步研究.天然产物研 究与开发，2006,18(4) :549-554)报道的方法从Ξ屯叶总皂巧中分离和纯化;含量:HPLC> 99%;分子量、iH及1? NMR的化学位移值与该文献报道的一致），使其终浓度为l.Omg/mL，于 45°C且pH为4.5条件下酶解4她，取处理好的样品进行化C分析，酶液能水解人参皂巧肺3为 人参皂巧CK(如图4中1、2和4所示，其中，1为人参皂巧CK纯品对照（购于上海源叶生物科技 有限公司），2为人参皂巧肺3纯品对照，4为经实施例1获得的酶液水解的人参皂巧肺3)。取处 理好的样品20化进高效液相色谱检测人参皂巧CK的生成量，检测方法为:采用汉邦C1細PLC 分析柱进行定量检测分析，分析流动相为甲醇:水=92:8;流动相流速为1. OmL/min;检测时 柱溫为3(TC;检测波长203nm，检测结果如图5所示，其中，A为转化前的结果，B为转化后的结 果。
[0081 ] 结果表明，人参皂巧CK的转化率为95.41 %。
[0082] 实施例3
[0083] 本实施例用于说明本发明提供的酶在制备人参皂巧CK中的应用。
[0084] 取2血由实施例1获得的纯化的酶液，加入绞股蓝皂巧IX(Gypenoside IX，Gyp IX) 纯品（云南与诺生物工程有限责任公司参照文献(李海舟，张颖君，杨崇仁.Ξ屯叶化学成分 的进一步研究.天然产物研究与开发，2006,18(4):549-554)报道的方法从Ξ屯叶总皂巧中 分离和纯化;含量:HPLC>99%;分子量、iH及1? NMR的化学位移值与该文献报道的一致）， 使其终浓度为l.Omg/mL，于45°C且pH为4.5条件下酶解4她，取处理好的样品进行化(：分析， 酶液能水解绞股蓝皂巧IX为人参皂巧CK(如图4中1、3和5所示，其中，1为人参皂巧CK纯品对 照，3为绞股蓝皂巧IX纯品对照，5为经实施例1获得的酶液水解的绞股蓝皂巧IX)。取处理好 的样品20化进高效液相色谱检测人参皂巧CK的生成量，检测方法同实施例2,检测结果如图 6所示，其中，A为转化前的结果，B为转化后的结果。
[00化]结果表明，人参皂巧CK的转化率为98.32%。
[00化]实施例4
[0087]本实施例用于说明本发明提供的酶在制备人参皂巧CK中的应用。
[008引取2mL由实施例1获得纯化的酶液，加入立屯叶总皂巧(购于昆明植物药业公司，人 参皂巧肺3含量为16.7重量％，绞股蓝皂巧IX含量为7.6重量％)，使其终浓度为6.Omg/mL， 于45°C且pH为4.5条件下酶解4她。酶解后的样品进行减压蒸干，用2mL甲醇溶解。取处理好 甲醇溶解样品20化进高效液相色谱检测人参皂巧CK的生成量，检测方法同实施例2,检测结 果如图7所示，其中，A为转化前的结果，B为转化后的结果。
[0089] 结果表明，W人参皂巧肺3和绞股蓝皂巧IX的总含量计，人参皂巧CK的转化率为 84.41%。
[0090] W上实施例的结果表明，将本发明提供的酶用于降解人参皂巧肺3、绞股蓝皂巧IX 和Ξ屯叶总皂巧时，其可能能够作用于人参皂巧肺3和绞股蓝皂巧IX中C20位的木糖糖巧结 构，同时也可将其C3位的两个葡萄糖水解下来，从而获得人参皂巧CK，并且人参皂巧CK的转 化率在84% W上。
[0091] W上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中 的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可W对本发明的技术方案进行多种简单变型，运 些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0092] 另外需要说明的是，在上述【具体实施方式】中所描述的各个具体技术特征，在不矛 盾的情况下，可W通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可 能的组合方式不再另行说明。
[0093] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可W进行任意组合，只要其不违背本 发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
【主权项】
1. 一种酶，其特征在于，该酶为(a)或(b): (a) 由SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列组成的酶； (b) SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且酶活性 不变的由（a)衍生的酶，或者，由在SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的氨基末端和/或羧基末 端连接有标签的氨基酸序列组成的酶。2. 编码权利要求1所述的酶的基因。3. 根据权利要求2所述的基因，其中，所述基因的序列如SEQ ID N0:2所示。4. 含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。5. -种组合物，其特征在于，该组合物含有权利要求1所述的酶作为活性成分。6. 权利要求1所述的酶、权利要求2或3所述的基因、权利要求4所述的重组载体、表达 盒、转基因细胞系或重组菌，以及权利要求5所述的组合物中的任意一项在降解糖苷类化合 物中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其中，所述糖苷类化合物选自含有β-木糖残基的化合物 和/或含有葡萄糖残基的化合物，优选为二醇型人参皂苷。8. -种制备人参皂苷化合物Κ的方法，该方法包括:在酶解条件下，将含有糖苷类化合 物的原料与酶接触，其特征在于，所述酶由权利要求1所述的酶和/或权利要求5所述的组合 物提供。9. 根据权利要求8所述的方法，其中，以所述原料的总重量为基准，所述酶的用量为1-101]/11^;所述酶解条件包括 :酶解的温度为40-70°(：，？!1值为3-7，酶解的时间为10-6011。10. 根据权利要求8或9所述的方法，其中，所述糖苷类化合物选自含有β-木糖残基的化 合物和/或含有葡萄糖残基的化合物，优选为二醇型人参皂苷。
【文档编号】C12R1/84GK106011106SQ201610440705
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月20日
【发明人】韩秀林, 李铭刚, 赵江源, 黄开心, 杨胜江, 马凤灵, 包崇卯, 林婷婷, 张孝龙, 文孟良, 艾黎
【申请人】云南与诺生物工程有限责任公司