一种利用中长脂肪链槐糖脂衍生物共价修饰的溶菌酶及其修饰方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种利用中长脂肪链槐糖脂衍生物共价修饰的溶菌酶及其修饰方法与应用，该修饰方法包括以下步骤：(1)将槐糖脂衍生物的活性酯溶解在DMSO，然后加入溶菌酶的NaHCO3水溶液，搅拌条件下进行缩合反应，反应结束后得到反应混合物；所述的槐糖脂衍生物为羧酸型中长脂肪链槐糖脂；(2)依次采用去离子水和磷酸盐缓冲液对步骤(1)得到的缓冲液体系进行透析，得到的透析物经过离心分离得到修饰后的溶菌酶。经过修饰的溶菌酶不仅能有效抑制革兰氏阳性菌活性，同时也能显著抑制革兰氏阴性菌活性，从而扩展天然溶菌酶的抑菌谱，可作为多功能食品保鲜剂。
【专利说明】
-种利用中长脂肪链槐糖脂衍生物共价修饰的溶菌酶及其修 饰方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及利用生物表面活性剂槐糖脂共价修饰蛋清溶 菌酶，从而扩展天然溶菌酶的抗菌谱，进一步拓宽溶菌酶的应用范围，特别是在食品保鲜领 域的应用。
【背景技术】
[0002] 溶菌酶是一种碱性酶，可W水解黏多糖。溶菌酶主要通过破坏细胞壁中的N-乙酷 胞壁酸和N-乙酷氨基葡糖间的β-1，4糖巧键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肤，导 致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。存在于动植物体内和人的外分泌液中，目前可W 从牛、羊、马等乳汁中分离出溶菌酶，其中蛋清溶菌酶含量最丰富，约为0.3%~0.4%。从鸡 蛋清中提取分离的溶菌酶是由18种，129个氨基酸残基构成的单一肤链。它富含碱性氨基 酸，有4对二硫键维持酶构型，其Ν端为赖氨酸，C端为亮氨酸。可分解溶壁微球菌、巨大芽抱 杆菌、黄色八叠球菌等革兰阳性菌。化学性质非常稳定，对热也极为稳定。溶菌酶的最适溫 度为5(TC，最适pH为6，溶菌酶具有热稳定性，100摄氏度保持十分钟仍具有活性。它作为一 种小分子蛋白质，具有对组织无刺激无毒性等优点。在《关于批准溶菌酶等物质为食品添加 剂及部分食品添加剂和营养强化剂扩大使用范围、用量的公告(2010年第23号）中》，溶菌酶 已经可W在干酪和发酵酒中作为防腐剂使用。
[0003] 溶菌酶的应用过程中的优点：（1)溶菌酶是很稳定的蛋白质，有较强的抗热性。蛋 清溶菌酶是C型，是已知的最耐热的酶；（2)溶菌酶不会因为有机溶剂的处理而失活，当转移 到水溶液中时，溶菌酶的活力可全部恢复；（3)溶菌酶可被冷冻或干燥处理，且活力稳定；
[4] 溶菌酶适宜抑5.3-6.4,可用于低酸性食品防腐；（5)溶菌酶生产成本较低；（6)溶菌酶作 为防腐剂安全性高。溶菌酶是一种天然蛋白质，1992年FA0/WT0的食品添加剂协会已经认定 溶菌酶在食品中应用是安全的。
[0004] 但由于革兰氏阴性菌的细胞膜外壁存在一层脂多糖LPS，天然的溶菌酶很难溶解 该膜层，所W无法有效抑制该类菌的活性，限制了溶菌酶的应用范围。目前，为了提高溶菌 酶对大肠杆菌等革兰氏阴性细菌的抑菌效果，国内外已经做了一些相关研究，可W通过热 处理、利用还原剂还原溶菌酶的二硫键添加其它化学物质与溶菌酶协同作用等改变酶的构 象。溶菌酶的化学修饰研究主要集中在：利用化学小分子（small molecule)或多糖 (poly saccharides)与溶菌酶结合（conjugation)进而修饰溶菌酶，或利用蛋白水解酶 (proteol^ic enzymes)修饰的溶菌酶。
[0005] 此外，槐糖脂（sophorolipids)是一类无毒、可生物降解的生物表面活性剂。槐糖 脂亦可用作食品乳化剂和发泡剂。近年来，研究者们还发现一些槐糖脂还表现出良好的抑 菌活性，可用作多功能食品保鲜剂。我们利用中长脂肪链槐糖脂衍生物(P化-C12)共价修饰 天然蛋清溶菌酶，改善其对革兰氏阴性菌的抑菌效果，从而扩增溶菌酶的抗菌谱，进一步拓 宽溶菌酶的应用范围，特别是在食品保鲜领域的应用。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种利用中长脂肪链槐糖脂衍生物(P化-C12)共价修饰的天然蛋清 溶菌酶及其修饰方法，改善溶菌酶对革兰氏阴性菌的抑菌效果，从而扩展溶菌酶的抗菌谱， 进一步拓宽溶菌酶的应用范围。
[0007] -种利用中长脂肪链槐糖脂衍生物共价修饰的溶菌酶，由中长脂肪链槐糖脂衍生 物与天然溶菌酶通过共价结合得到，其中，所述的中长脂肪链槐糖脂衍生物的簇基与天然 溶菌酶的氨基酸残基形成酷胺键；
[0008] 所述的中长脂肪链槐糖脂衍生物为簇酸型中长脂肪链槐糖脂，结构下式所示：
[0009]
[0010] 本发明中，使簇酸型中长脂肪链槐糖脂衍生物与溶菌酶的氨基酸残基通过共价结 合得到修饰后的溶菌酶，从而将槐糖脂结构引入到溶菌酶的表面，经过活性测试，发现其对 革兰氏阴性菌具有更好的抑菌效果，同时，对其抗菌谱也有较大的扩展。
[0011] 本发明还提供了一种溶菌酶的修饰方法，包括W下步骤：
[0012] (1)将槐糖脂衍生物的活性醋溶解在DMS0,然后加入溶菌酶的化肥化水溶液，揽拌 条件下进行缩合反应，反应结束后，加入甘氨酸溶液得到反应混合物；
[0013] (2)依次采用去离子水和憐酸盐缓冲液对步骤(1)得到的缓冲液进行透析，得到的 透析物经过离屯、分离得到修饰后的溶菌酶。
[0014] 形成活性醋的目的是为了活化簇基，使得槐糖脂衍生物能够与溶菌酶的氨基成 键，完成修饰过程，作为优选，所述的活性醋为N-径基班巧酷亚胺醋。
[0015] 作为优选，所述的溶菌酶为蛋清溶菌酶。采用盐提法制备的蛋清溶菌酶的成本较 低。
[0016] 作为优选，所述的中长脂肪链槐糖脂衍生物的添加量为1.0-2.Og/L。所述的溶菌 酶的添加量为1.5-2.0肖/1。溶菌酶与长脂肪链槐糖脂衍生物的混合溫度为30°(>35°(：。通过 上述方法可将中长脂肪链槐糖脂衍生物的活性幾基与溶菌酶的氨基酸残基通过共价结合 得到修饰后的溶菌酶，从而将槐糖脂结构引入到溶菌酶的表面。
[0017] 修饰的具体步骤如下：
[0018] 将中长脂肪链槐糖脂衍生物的N-径基班巧酷亚胺醋溶解在5mL DMS0形成溶液的 最终浓度为0.7mM，揽拌情况下，逐滴滴加入25mL 1 %化肥化的蛋清溶菌酶溶液(0.2mM)，继 续缓慢揽拌30°C下反应化。反应结束后，向体系内加入25mL lOOmM的甘氨酸溶液(glycine solution)，30°C恒溫lOmin。反应体系室溫下利用去离子水透析，再利用抑7.0 20mM憐酸 盐缓冲液4°C透析1天。
[0019] 本发明还提供了一种所述的中长脂肪链槐糖脂衍生物(P化-C12)的制备方法，包 括W下步骤：
[0020] (1)在隔绝水分的条件下，向中长脂肪链槐糖脂中加入绝干甲醇和甲醇钢，加热回 流进行反应，经过后处理得到水解中间体；
[0021] (2)在DMAP的作用下，步骤(1)得到的水解中间体与乙酸酢在THF中进行醋化反应， 得到醋化中间体；
[0022] (3)在憐酸盐缓冲液存在的条件下，步骤(2)得到的醋化中间体在脂肪酶的作用下 进行选择性水解反应，得到所述的簇酸型中长脂肪链槐糖脂。
[0023] 作为优选，步骤（1)中所述槐糖脂与甲醇钢的初始添加量之摩尔比为1:0.15:-1: 0.2。且反应回流时间控制在3-化。所用的酸的浓度无特别严格的要求。
[0024] 步骤(2)中，步骤(1)产物与乙酸酢的初始添加量摩尔比为1:6-1:10,步骤(1)产物 与DMAP的初始添加量摩尔比为1:0.3-1:0.6。所述反应溫度为25-30°C，反应时间为1-化。
[0025] 步骤(3)中，所述的脂肪酶用于选择性地水解侧链的醋基并保留其他的醋基，所述 脂肪酶可选择W下所述，PS-30(f;rom P.cepacia),P化（from porcine pancreas)和AYS (from C.rugosa)和Novozym-435(f;rom C.an1:a;rctica)。反应溫度为25-30°C，反应时间为 24-7 化。
[0026] 本发明还提供了一种所述的槐糖脂的发酵法制备方法，包括如下步骤：
[0027] (1)将购置的冻干假丝酵母菌C.bombicola ATCC 22214均匀分散至ImL灭菌后的 YM培养基中（YM培养基组成包括，单位1 L酵母粉3. Og，麦芽粉3. Og，蛋白腺5 . Og，葡萄糖 10.Og，用蒸馈水定容至1 L)。随后将其画线接种到YM琼脂培养基斜面上(YM琼脂培养基组 成包括:酵母粉3. Og/L，麦芽粉3. Og/L，蛋白腺5. Og/L，葡萄糖10.0 g/L，琼脂20.0 g/L)，于25 °C恒溫2天后，挑取培养基斜面上的单菌落接种至灭菌后的液体培养基中，25°C，200巧m培 养24h (液体培养基组成包括，单位比:酵母粉3. Og，麦芽粉3. Og，蛋白腺5. Og，葡萄糖10.0 g， 用蒸馈水定容至1L)，并分装于甘油管中，-8(TC保存备用。
[0028] (2)将上述步骤(1)菌悬液按照体积百分比5%的接种量将菌悬液接入上述冷却的 液体种子培养基中，2500-mL规格的摇瓶，装液量为500mL，摇瓶于25°C、转速为20化pm的摇 床上培养2地，得到液体种子；
[0029] (3)将上述步骤(2)液体种子培养基接种至灭菌后的装配有电子数控与揽拌装置 的10-L发酵罐培养基中，发酵溫度25°C，转速不超过1200rpm，溶氧控制在30%，利用6M氨氧 化钢溶液调控体系抑3.5。当细胞生长进入静止期时，将葡萄糖(50%，v/v)及月桂酸W适 宜的速率添加入发酵罐中，发酵过程中每隔化监测发酵液中的葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度 低于150mM时，补加葡萄糖。
[0030] (4)发酵72h结束后，将发酵液于8000巧m下离屯、lOmin，离屯、后，发酵液体系呈Ξ 相，最上层为培养基液体层，中间层主要含槐糖脂产物，而最下层固体相为细胞层。回收最 底层细胞W备循环复用。同时利用等体积乙酸乙脂洗涂Ξ次底层，用与等体积的有机溶剂 正己烧回收发酵液中未反应的油脂(洗3次）。合并乙酸乙醋，减压除溶剂得槐糖脂粗产品， 得到产物产量为160-180g/L。
[0031] (5)向lOOmL的圆底烧瓶中顺序加入步骤(4)产物，绝干甲醇和甲醇钢，CaCb保护， 加热回流化，降至室溫，再加入适量K0H水溶液，继续回流化，减压除溶剂，溶解于去离子水 溶，利用肥1调抑至苯酪呈红色，置于冰浴中至有沉淀析出，通过硅胶层析柱分离得到产物。
[0032] 作为优选，步骤(5)中所述无酷基槐糖脂衍生物与甲醇钢的添加量之摩尔比为1: 015: -1: ο. 2。且反应回流时间控制在3-化。所用的酸的浓度无特别严格的要求。
[0033] 同现有技术相比，本发明的有益效果：
[0034] (1)本发明利用生物表面活性剂槐糖脂衍生物对天然蛋清溶菌酶实施了有效化学 修饰，酶在修饰过程中的酶活损失小，调整酶活性中屯、的空间结构，强化了溶菌酶的抑菌效 果，开发了一种新颖的溶菌酶修饰剂与修饰方法，方式简单灵活，是一种颇具实用价值的生 物工程技术。
[0035] (2)本发明提供的一种扩展溶菌酶抗菌谱的方法，较之天然溶菌酶，不仅对革兰氏 阳性菌具有抑菌活性，而且对革兰氏阴性菌的抑菌活性大幅提高，有效拓展了溶菌酶的抑 菌谱。
【附图说明】
[0036] 图1是中长脂肪链槐糖脂衍生物的核磁碳谱图；
[0037] 图2是天然溶菌酶与中长脂肪链槐糖脂衍生物共价修饰溶菌酶的酶活力对比；
[0038] 图3是中长脂肪链槐糖脂衍生物共价修饰溶菌酶对常见食源性致病菌的抑菌圈直 径。
【具体实施方式】
[0039] 实施例1
[0040] 中长脂肪链槐糖脂衍生物(P化-C12)的制备方法：
[0041 ] 向lOOmL的圆底烧瓶中顺序加入假丝酵母菌C.bombicola ATCC 22214发酵产物 27.01g(43.27mmol，leq)，50mL 绝干甲醇和 1.621^(6.49111111〇1，0.1569)甲醇钢，〔曰(：12保护， 加热回流化，降至室溫，酸调抑至中性，减压除溶剂后溶解在去离子水中，并置于〇°C冰浴至 粉末沉淀析出，过滤，水洗，减压干燥，得产物20.5g(81 % )。
[0042] (2)向lOOmL的圆底烧瓶中顺序加入28.42邑(51.61111111〇1，169)步骤（1)产物，50血绝 干有机溶剂 了册，38.721^(412.88111111〇1，869)乙酸酢和2.52旨（20.64111111〇1，0.469)014?，室溫 下揽拌化，化C12保护，减压除溶剂后溶解于乙酸乙醋，并利用饱和化肥化溶液洗涂混合物3 次，回收有机相，MgS〇4干燥，过滤，减压干燥，得无色油状物27.4g。
[0043] (3)分别向装有20血，抑二7.4，0.2M憐酸盐缓冲液的50血锥形瓶中顺序加入，0.8g 步骤(2)产物(溶解在5mL丙酬中），0.4g脂肪酶Novozyme 435。室溫下置于恒溫震荡水浴中 维持72h，反应结束后，用乙酸乙醋萃取反应液，回收有机相，无水硫酸钢干燥，减压除溶剂， 产物产率87.5%，产物C谱见图1。
[0044] 实施例2
[0045] 利用簇酸型中长脂肪链槐糖脂衍生物(P化-C12)共价修饰天然蛋清溶菌酶：
[0046] 1)将中长脂肪链槐糖脂衍生物的N-径基班巧酷亚胺醋溶解在5mL DMS0形成溶液 的最终浓度为0.7mM，揽拌情况下，逐滴滴加入25mL，0.2mM，1 %化肥化的蛋清溶菌酶溶液， 继续缓慢揽拌30°C下反应化。反应结束后，向体系内加入25mL lOOmM的甘氨酸溶液，30°C恒 溫lOmin，室溫下利用去离子水透析，再20mM憐酸盐缓冲液透析，pH 7.0,4°C维持1天左右。 为了除去未反应的酸型全乙酷基槐糖脂，透析物在5°C120(K)rpm离屯、lOmin，做种收集悬浮 物。
[0047] 2)溶菌酶酶活测定：
[004引将待测酶液和底物悬液分别置于25°C水浴中保溫20min，吸取底物悬液2.8mL，置 于1 cm比色皿中比色测定450nm下的0D值，此为零时读数，然后加入酶液0.2mL，迅速摇均，从 加入酶液起计时，每隔Imin测定1次450nm下的0D值，共测定3次。本实验的酶活力单位定义 为:每分钟0D值下降0.001为1个活力单位(25°C、pH值6.2)，即每毫克活力单位化/111旨）=^ 0D45/min)X10シ样品的质量(mg)。槐糖脂衍生物修饰溶菌酶酶活是天然酶活93.2%。
[0049] 实施例3
[0050] 抑菌圈的测定：采用杯碟法。取20mL溶化的固体培养基于培养皿中，凝固后，取 0.2mL浓度为106-107C即/血的各菌悬液均匀涂布于固体培养基中，lOmin后，将牛津杯放置 于培养皿表面，加入样品液，盖好培养基，置于37Γ恒溫培养2地，测抑菌圈直径。每个样品 液实验重复3次，取平均值。
【主权项】
1. 一种利用中长脂肪链槐糖脂衍生物共价修饰的溶菌酶，其特征在于，由中长脂肪链 槐糖脂衍生物与天然溶菌酶通过共价结合得到，其中，所述的中长脂肪链槐糖脂衍生物的 羧基与天然溶菌酶的氨基酸残基形成酰胺键； 所述的中长脂卩枯连地?日旨析A物I %酿?由长·日旨卩枯连地*唐日旨结拔!下式所示：2. -种如权利要求1所述的溶菌酶的修饰方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 将所述的中长脂肪链槐糖脂衍生物的活性酯溶解在DMSO，然后加入溶菌酶的NaHCO3 水溶液，搅拌条件下进行缩合反应，反应结束后得到反应混合物； (2) 依次采用去离子水和磷酸盐缓冲液对步骤（1)得到的缓冲液体系进行透析，得到的 透析物经过离心分离得到修饰后的溶菌酶。3. 根据权利要求2所述的溶菌酶的修饰方法，其特征在于，所述的活性酯为N-羟基琥珀 酰亚胺酯。4. 根据权利要求2所述的溶菌酶的修饰方法，其特征在于，所述的溶菌酶为蛋清溶菌 酶。5. 根据权利要求2所述的溶菌酶的修饰方法，其特征在于，所述的羧酸型中长脂肪链槐 糖脂衍生物的制备步骤如下： (1) 在无水条件下，向中长脂肪链槐糖脂中加入绝干甲醇和甲醇钠，加热回流进行反 应，经过后处理得到水解中间体； (2) 将步骤（1)得到的水解中间体与乙酸酐在THF中经DMAP催化进行酯化反应，得到酯 化中间体； (3) 将步骤(2)得到的酯化中间体置于磷酸盐缓冲液中，经脂肪酶的选择性催化水解作 用，得到所述的羧酸型中长脂肪链槐糖脂。6. 根据权利要求5所述的溶菌酶的修饰方法，其特征在于，步骤（1)中，所述的槐糖脂与 甲醇钠的起始摩尔比为1:0.15-1:0.2,回流时间为3-6h; 步骤(2)中，水解中间体、乙酸酐和DMAP的起始摩尔比为1:8~10:0.4~0.6,反应温度 为25-30°(：，反应时间为1-311; 步骤(3)中，所述脂肪酶为PS-30、PPL、AYS或Novozym-435，反应温度为25-30°C，反应时 间为 24-76h。7. 根据权利要求6所述的溶菌酶的修饰方法，其特征在于，所述的槐糖脂制备步骤如 下： (1) 将冻干假丝酵母菌C.bombicola ATCC 22214均匀分散至ImL灭菌后的YM培养基中， 随后将其画线接种到YM琼脂培养基斜面上，25°C恒温2天后，挑取单菌落接种至灭菌后的液 体培养基中，25 °C，200rpm培养24h; (2) 将步骤（I)的菌悬液接种至灭菌后的种子培养基中，25°C，200rpm培养24h; (3) 将步骤(2)种子培养基接种至灭菌后的装配有电子数控与搅拌装置的发酵罐培养 基中，25°C，转速不超过1200rpm，溶氧控制在30%，利用氢氧化钠溶液调控体系pH 3.5，当 细胞生长进入静止期后，将葡萄糖及月桂酸添加入发酵罐中，每隔3h监测发酵液中葡萄糖 浓度，浓度低于150mM时补加葡萄糖； (4) 将步骤(3)发酵液于SOOOrpm下离心10min，离心后，发酵液体系呈三相，中间层含槐 糖脂产物，利用等体积乙酸乙酯洗涤，合并有机相，减压除溶剂得槐糖脂。8. -种如权利要求1所述的溶菌酶的应用，其特征在于，所述的溶菌酶用于制备多功能 食品保鲜剂或者抑菌剂。
【文档编号】C12N9/36GK106011109SQ201610484733
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月23日
【发明人】石玉刚, 王贺, 任月萍, 卞立晴, 吴煜, 蔡文强, 余頔
【申请人】浙江工商大学