一种海洋芽孢杆菌产生的β-葡聚糖酶及其制备方法
【专利摘要】一种海洋芽孢杆菌产生的β?葡聚糖酶及其制备方法，属于海洋微生物和酶制剂领域，所述β?葡聚糖酶由海洋芽孢杆菌N6?2产生，分子量为24kDa，本发明所述的β?葡聚糖酶具有较高的酶活力，且热稳定性和pH稳定性较好，在酿酒工业、工业废水处理、功能性食品的开发及饲料应用方面具有广阔的开发潜力和应用前景。CCTCC NO: M201458620141123
【专利说明】
-种海洋芽抱杆菌产生的β-葡聚糖酶及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于海洋微生物和酶制剂领域，具体设及一种海洋芽抱杆菌产生的β-葡聚 糖酶及其制备方法。
【背景技术】
[0002] β-葡聚糖酶是一类能降解谷物中β-葡聚糖的水解酶，可应用于啤酒生产中。大麦 胚乳细胞壁的主要成分是0-葡聚糖，该酶能降解0-葡聚糖分子中的0-1，3和β-1，4糖巧链， 使之降解为小分子，失去亲水性，降低粘性，从而疏松大麦胚乳细胞壁，提高大麦利用率，使 麦芽汁粘度降低，大大缩短麦芽汁和啤酒的过滤时间，增加啤酒产量，改善啤酒的质量。在 W大麦、小麦、黑麦、燕麦等谷物为畜禽的饲料中含有大量的β-葡聚糖，由于动物(少数反当 动物除外)体内没有消化β-葡聚糖的酶，β-葡聚糖作为一种非淀粉粘性多糖，在肠道内具有 较高的粘度，阻止营养物质的吸收，降低了饲料的营养价值。β-葡聚糖酶应用于饲料中，大 大提高了饲料的利用率。纤维寡糖具有调节肠道微生物菌群作用，是一种功能性寡糖，由于 它不易使血糖浓度升高，可作为糖尿病患者的甜昧剂等。目前制备功能性寡糖的方法有酶 水解法、酶合成转化法、酸水解法、碱转化法及化学合成法等。但酸水解法、化学合成法等工 艺操作复杂、耗能大，产率低，难于实现生产规模化;而采用0-葡聚糖酶水解小麦賴杆生产 功能性寡糖，操作工艺简便，可大大降低生产成本，提高小麦賴杆的利用率，减少生物质资 源的浪费，减少由于賴杆焚烧带来的空气污染问题，具有较大的社会经济价值和环境价值。 含有大量0-1,3-葡聚糖的酿酒酵母自溶性残渣多作为工业废物或W低廉的价格作为饲料 销售，造成了很大的资源浪费和环境污染。利用β-葡聚糖酶处理使葡聚糖水解为寡糖或还 原糖，可提高其水溶性，且反应条件溫和，无毒安全，避免了使用酸碱、机械等方法破壁带来 的污染、产物失活等问题。谷氨酸菌体是一种单细胞蛋白，味精厂的发酵废液中含有大量的 谷氨酸菌体，造成严重的环境污染且浪费了大量的蛋白质，利用蛋白酶和β-葡聚糖酶水解 蛋白质，反应条件溫和，能耗低，副反应少，可获得复合氨基酸水解液，又减少了化学法带来 的环境污染问题。真菌细胞壁多糖主要由几下质（甲壳质）、纤维素、葡聚糖、甘露聚糖等构 成，β-葡聚糖酶可W水解真菌细胞壁，可W在生物防治中对植物病原真菌产生括抗作用，在 生物防治中具有重要的意义。孙维国等利用李氏木霉作为菌种，W微晶纤维素、玉米浆、憐 酸二氨钟、硫酸锭和碳酸巧为原料，进行液体深层发酵生产0-葡聚糖酶，极大的降低了生产 成本，产品主原料成本降低83.3% (申请公布号:CN101993865A)。江正强等利用枯草芽抱杆 菌(83別11118 8油^113)1'1'-68(保藏编号为〔61〇：齡.3340)通过摇瓶发酵培养，产酶水平 为430-3000υ/ιΛ;进行化发酵罐扩大培养30h，酶活可达到2500-5000U/mL(申请公布号： CN101845423A)〇
【发明内容】
[0003] 本发明要解决的技术问题是提供一种海洋芽抱杆菌产生的β-葡聚糖酶及其制备 方法。
[0004] 本发明还提供一种β-葡聚糖酶，该β-葡聚糖酶由海洋芽抱杆菌N6-2产生，分子量 为24kDa;该海洋芽抱杆菌Ν6-2于2014年11月23日保藏于中国典型培养物保藏中屯、，保藏号 为CCTCC NO:M2014586，保藏地址为中国武汉市武昌塔挪山武汉大学，分类命名为Baci 1 lus SP.N6-2。
[0005] 进一步，所述海洋芽抱杆菌N6-2产生的β-葡聚糖酶的制备方法:海洋芽抱杆菌 Ν6-2菌株，接种于含有种子培养基的试管中，在15-36Γ的摇床中100-3(K)rpm，培养25-3化； 将上述培养后的菌株按2-6% (v/v)的接种量接种于盛有发酵培养基的摇瓶中，15-36Γ， 100-300rpm，发酵培养48-9化;取菌株发酵液，离屯、，除掉发酵液中的菌体和杂质，并调节其 pH在6.5-7.5，即为粗制发酵样品；超滤法粗提，获得10~30kDa组分，用硫酸锭沉淀法获得 硫酸锭饱和浓度在30 % -65 %的组分，将30 % -65 %的组分过Q离子交换层析柱，将穿透峰Q1 脱盐后真空冷冻干燥保存，将收集的穿透峰Q1，过CM离子交换柱，收集穿透峰C1，脱盐后真 空冷冻干燥保存，即为海洋芽抱杆菌N6-2所产生的β-葡聚糖酶。
[0006] 进一步，所述的种子培养基的成分及终浓度：牛肉膏0.2-0.8%，蛋白腺1-2%，氯 化钢0.3-1 %，ρ册.8-7.5。
[0007] 进一步，所述的发酵培养基的成分及终浓度:薦糖0.5-1%，牛肉膏0.2-0.8%，蛋 白腺1-2%，氯化钢0.3-1 %，矿物油0.5-1%〇，Ρ册.8-7.5。
[0008] 本发明还提供一种β-葡聚糖酶的制备方法，其具体步骤为：
[0009] (1)菌株的发酵：
[0010] 取海洋芽抱杆菌Ν6-2菌株，接种于含有种子培养基的试管中，在15-36Γ的摇床中 100-300巧m，培养25-30h;
[0011] 将上述培养后的菌株按4% (v/v)的接种量接种于盛有发酵培养基的摇瓶中，15- 36°C，100-300rpm，发酵培养48-9化;取菌株发酵液，离屯、，除掉发酵液中的菌体和杂质，并 调节其pH在6.5-7.5，即为粗制发酵样品。
[0012] (2)超滤截留
[0013] 取海洋芽抱杆菌N6-2发酵液，在SOOOrpm下离屯、，除掉菌体与部分杂质。依次用分 子量为5040曰、301^)曰、101^)曰、化化、340曰的滤膜，截留发酵液，获得10~3040曰的组分，调节 抑值至7.0;
[0014] 进一步，所述的种子培养基的成分及终浓度：牛肉膏0.2-0.8%，蛋白腺1-2%，氯 化钢0.3-1 %，p册.8-7.5。
[0015] 进一步，所述的发酵培养基的成分及终浓度:薦糖0.5-1%，牛肉膏0.2-0.8%，蛋 白腺1-2%，氯化钢0.3-1 %，矿物油0.5-1%〇，P册.8-7.5。
[0016] (3)硫酸锭沉淀法粗提
[0017] 取步骤(2)所述的10~30kDa组分，置于冰浴之中，缓慢向其中加入硫酸锭固体粉 末，使其水溶液浓度达到30%，4°C静置化，lOOOOrpm离屯、，沉淀作为杂蛋白，遗弃；取上清 液，向其中缓慢加入硫酸锭固体粉末，使其水溶液浓度达到65 %，4°C静置化，lOOOOrpm，离 屯、，弃上清，取沉淀;沉淀用50mmol/L的抑7.96^径甲基氨基甲烧盐酸盐(Tr i S-HC1)缓冲液 溶解，装入3W)a透析袋，置于相同缓冲液中透析，地、化、1化换一次缓冲液，既得到硫酸锭饱 和浓度在30 % -65 %的组分。
[0018] (4)Q离子交换层析
[0019] 取步骤(3)所述的硫酸锭饱和浓度30%-65%的组分，过Q离子交换层析柱，上样缓 冲液为20-60mmol/L的pH6.0-8.0Ξ径甲基氨基甲烧盐酸盐(Tris-肥1)缓冲液，每次上样量 为5-20mL，洗脱液为含Imol/L化C1的上样Tris-肥1缓冲液，洗脱液W100 %(v/v)的浓度进 行洗脱，流速为3mL/min，检测波长为280nm，收集穿透峰Q1，脱盐后真空冷冻干燥保存；
[0020] 进一步，上述步骤(4)中的上样缓冲液优选为50mmol/L，pH7.96。
[0021 ] 进一步，上述步骤(4)中每次上样量优选为5mL。
[0022] (5)CM离子交换层析
[0023] 取步骤(4)中收集的穿透峰Q1，过CM离子交换柱，上样缓冲液为20-60mmol/L的 P册.0-9.0氨氧化钢甘氨酸缓冲液(化OH-Glycine)，每次上样量为1-lOmL洗脱液为含Imol/ L化Cl的氨氧化钢甘氨酸上样缓冲液，洗脱液W100 %(v/v)的浓度进行洗脱，流速为3mL/ min,收集穿透峰Cl，脱盐后真空冷冻干燥保存，即为海洋芽抱杆菌N6-2所产生的β-葡聚糖 酶。
[0024] 进一步，上述步骤(5)中的上样缓冲液优选为25mmol/L，ρΗ9.0;
[0025] 进一步，上述步骤(5)中每次上样量优选为2mL。
[00%] 本发明还设及该酶在工业中的应用，如酿酒工业，工业废水处理等。本发明还设及 该酶在食品行业中的应用，如魔芋等饮品的制备。本发明还设及该酶在饲料方面的应用。
[0027] 本发明与现有技术相比的有益效果：
[0028] 本发明制取的β-葡聚糖酶纯度高，分子量明确，克服了 W往制备方法中纯度不高 的缺点，酶活力高，具有良好的热稳定性，在60°C水浴保溫比后酶活力保持在64.54%，在50 °C水浴中保溫化后相对酶活力保持在87.12%，30-50°C范围内酶活力保持在80% W上，溫 度适用范围广，易存储。最适PH为6.0属于酸性酶，PH稳定性较好，PH= 4时相对酶活力为 82.42%，PH= 11时相对酶活力为77.81 %。最适PH范围与动物肠道PH范围吻合，在饲料方面 具有广阔应用前景。MnCb对β-葡聚糖酶的活性具有明显的促进作用，相对酶活可W达到 155.45%。而CuCl2、CaCl2对β-葡聚糖酶的活性具有较弱的抑制作用相对酶活力分别为 85.99%和95.47%，运与一般β-葡聚糖酶特性明显不同，特别适用于处理工业废水，如Μη2+ 含量比较高的谷氨酸发酵废液等。
【附图说明】
[0029] 图1.海洋芽抱杆菌Ν6-2的系统发育树；
[0030] 图2. SDS-PAGE检测该β-葡聚糖酶的纯度；
[0031 ]图3.海洋芽抱杆菌Ν6-2产生的β-葡聚糖酶质谱图；
[0032] 图4.溫度对酶活力的影响；
[0033] 图5.溫度对酶稳定性的影响；
[0034] 图6.pH对酶活力的影响；
[0035] 图7. pH对酶稳定性的影响；
[0036] 图8.金属离子对酶活力的影响。
【具体实施方式】
[0037] 下面通过实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不受实施 例任何形式的限制。
[0038] 实施例1菌株N6-2的形态特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析
[0039] (1)形态特征
[0040] 革兰氏染色结果显示，菌株N6-2为革兰氏阴性菌，且具有明显的芽抱，菌体形态呈 现短杆棒状，多是有两个菌体相连。菌落特征为白色或者是乳黄白色，表面光滑，有突起。扫 描电镜图片显示，菌株N6-2呈现短杆棒状，菌体表面光滑，两端呈现突起，部分刚分裂的菌 体呈现大豆状，大部分菌体处于二分裂状态，两个菌体相连，且中间凹陷，连接处细长，菌体 间有粘膜产生。单个菌体的大小为宽:0.9-1.5皿，长:1-3.7皿。
[0041 ] (2)生理生化反应特征
[0042] 由于该菌为革兰氏阴性菌，故可W用API 20E细菌鉴定系统进行生理生化分析。结 果见表1。
[0043] 表1.菌株N6-2的生理生化鉴定结果
[0044]
[0046] 注：表阴性；V'表示阳性
[0047] API 20E结果显示阳性：巧樣酸钢利用、色氨酸水解、Kohn明胶水解、发酵利用阳 性:薦糖产酸，氧化酶反应。
[004引 （3)168 rDNA序列分析
[0049] 吸取1.5mL的处于对数生长期的N6-2菌液，4°C，10000巧m，离屯、lOmin。弃上清液， 加入4(Κ)化的TE缓冲液，用枪头将沉淀吹打均匀，加入10化的溶菌酶，混合均匀，置于37 °C水 浴中90min，4°C，10000巧m，离屯、1 Omin，保留上清即为DNA溶液。
[(K)加]采用16S rDM通用引物，由上海生工生物工程合成。正向引物：27F5'- AGAGTTTGATCCTGGTCAG-3'，反向引物：1492R 5'-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3' ； 16S rDNA序列 的 PCR 条件是:95°C 预变性 5min;95°C 变性 4〇3,55°(：退火1111111，72°(：延伸9〇3，循环30次，721： 延伸lOmin。PCR反应体系是:反应体系：2扣L，模板DNA: 0.5化，上游引物：2化，下游引物：2μ L，10X easy tap buffe;r:5yL，dNTP:4yL，Easy tap DNA polymerase:0.5yL，双蒸水：l]_yL。 [0化1 ] 用1.5%的琼脂糖电泳检测PCR扩增产物，WD2000Marker为标准分子量对照试剂。 菌株N6-2的16S rDNA PCR产物送到北京华大基因进行测序。序列见SEQ1，测得菌株N6-2的 16S rDNA序列长度为1409bp。
[0化2] 将菌株N6-2的16S rDNA序列在NCBI的核酸数据库中通过化AST进行分析。通过 MEGA6软件Neighbor-joining选项绘制发育树：BLAST重复1000次，选择模型核酸P- dis化nce，得到结果如图1所示。
[0053] 下载与实验菌株亲缘关系较近的序列，用BioEdit软件进行多序列对比，与菌株 N6-2的 16S rDNA序列（1409bp)相似性比较高的菌株为BacillussafensisstrainFO- 036b(T)(99.72%)、Bacillus pumilus ATCC 7061(T)(99.65%)、Bacillus altiUidinis 41KF化(Τ)(99.29%)通过《常见细菌系统鉴定手册》，可W确定为芽抱杆菌属(Bacillus)的 细菌，且相似性最高的是沙福芽抱杆菌，可能是属于沙福芽抱杆菌的变种，是一种新的芽抱 杆菌的变种，命名为Bacillus SP.N6-2。该图也证明了Bacillus SP.N6-2的系统学地位。
[0054] 实施例2海洋芽抱杆菌N6-2产生的β-葡聚糖酶的分离纯化
[0055] (1)菌株的发酵：
[0056] 取海洋芽抱杆菌Ν6-2菌株，接种于含有种子培养基的试管中，在28Γ的摇床中 150巧m，培养28h;将上述培养后的菌株按4%(v/v)的接种量接种于发酵培养基，28°C， 150rpm摇床培养80h;取菌株发酵液，离屯、，去掉发酵液中的菌体和杂质，并调节其pH在7.0， 即为粗制发酵样品。
[0057] (2)超滤截留：
[0058] 取海洋芽抱杆菌N6-2发酵液，在SOOOrpm下离屯、，除掉菌体与部分杂质。依次用分 子量为5040曰、3040曰、1040曰、化0曰、340曰的滤膜，截留发酵液，将发酵液分成3~化0曰、5~ 10kDa、10~30kDa、30~50kDa的组分，电泳检测。
[0059] (3)硫酸锭沉淀法浓缩：
[0060] 取步骤(2)所述的10~30kDa组分，置于冰浴之中，缓慢向其中加入硫酸锭固体粉 末，使其水溶液浓度达到30%，4°C静置化，lOOOOrpm，离屯、lOmin，沉淀作为杂蛋白，遗弃，取 上清取，向其中缓慢加入硫酸锭固体粉末，使其水溶液浓度达到65 %，4°C静置2h， lOOOOrpm，离屯、lOmin，取沉淀，弃上清。沉淀用50mmol/L的pH7.96Ξ径甲基氨基甲烧盐酸盐 (Tris-HCl)缓冲液溶解，装入3W)a透析袋，置于相同缓冲液中透析，地，化，1化换一次等浓 度缓冲液，既获得硫酸锭饱和浓度在30 % -65 %的组分。
[0061 ] (4)离子交换色谱法提取β-葡聚糖酶
[0062] 1.Q离子交换层析
[0063] 取步骤(3)所述的硫酸锭饱和浓度30%-65%的组分，过Q离子交换层析柱，上样缓 冲液为50mmol/L的抑7.96Ξ径甲基氨基甲烧盐酸盐(Tris-肥1)缓冲液，每次上样量为5mL， 洗脱液为含Imol/L化Cl的化is-HCl上样缓冲液，洗脱液W100% (v/v)的浓度进行洗脱，流 速为3mL/min，检测波长为280nm，收集各峰，将穿透Q1组分脱盐后真空冷冻干燥保存；
[0064] 2. CM离子交换层析
[0065] 取收集的穿透峰Q1，过CM离子交换柱，上样缓冲液为25mmol/L的抑9.0氨氧化钢甘 氨酸缓冲液(化OH-Glycine)，每次上样量2mL，洗脱液为含Imol/L化C1的氨氧化钢甘氨酸 上样缓冲液，洗脱液Wl〇〇%(v/v)的浓度进行洗脱，流速为3mL/min，收集各峰，将穿透峰C1 组分脱盐后真空冷冻干燥保存，即为海洋芽抱杆菌N6-2产生的β-葡聚糖酶。
[0066] 实施例3海洋芽抱杆菌Ν6-2产生的β-葡聚糖酶的纯度检测
[0067] l.Protein-PAK ? 60疏水性的蛋白分析柱检测纯度
[0068] 取经CM柱收集的穿透峰C1，过Protein-PAK ? 60疏水性蛋白分析柱，上样量为化 L，流动相为水，峰图结果显示为单一峰。
[00例 2. SDS-PAGE电泳检测β-葡聚糖酶的纯度
[0070] 基于现有SDS-PAGE技术，将超滤膜截留（1号样品）、硫酸锭沉淀30%-65%(2号样 品）、CM离子交换峰Cl(3,4号样品）、Q离子交换穿透峰Ql(5号样品）进行12%的SDS-PAGE凝 胶电泳检测。红框显示就是海洋芽抱杆菌N6-2产生的β-葡聚糖酶。见图2。
[0071] 实施例4ESI质谱检测β-葡聚糖酶的分子量
[0072] 将穿透峰C1水溶液通过Cole化rmer 74900注射累打入ESI-MS进行分析。（此实验 由中国科学院青岛生物能源与过程研究所协助完成)检测结果显示海洋芽抱杆菌N6-2产生 的β-葡聚糖酶的分子量是24kDa。见图3。
[0073] 实施例郎-葡聚糖酶活性测定
[0074] 1.酶活力单位定义化/mU:在40°C和抑6.0条件下，Imin从β-葡聚糖溶液中分解产 生?μL?ο?还原糖所需要的酶量为一个酶活单位。
[00巧]2.葡萄糖标准曲线的绘制：配制0、0.5、1、2、3、4、5、6、7111邑/1^的葡萄糖溶液，向每 只试管中加入1.7mL的葡萄糖溶液，在每支试管中加入3mL DNS试剂，于沸水中煮lOmin。每 管中加蒸馈水定容到25mL混匀，用空白管调零点，于550皿处进行比色测定，记录OD55〇，W葡 萄糖(mg)为横坐标，WOD550为纵坐标绘制出标准曲线。
[0076] 2.酶活力测定体系：设置1个空白组，1个反应组，向反应组试管中加入 1.5mL10mg/mL的β-葡聚糖溶液，40°C水浴预热5min，加入0.2mL适当稀释后的酶液，空白组 加入1.5血lOmg/mL的β-葡聚糖溶液，40°C水浴预热5min后加入0.2血适当稀释后灭活酶液。 40°C水浴反应15min后加入3mL DNS试剂终止反应，于沸水中煮lOmin。每管中加蒸馈水定容 至lj25mL混匀，W空白调零，在550nm处进行比色测定。
[0077] 3.实验测得该β-葡聚糖酶的酶活力为:13.3U/mL。
[0078] 实施例郎-葡聚糖酶特性研究
[0079] 1.最适溫度:在试管中加入1.5mL 1.0%的pH = 6.0的β-葡聚糖底物，然后加入适 当稀释后的酶液200化分别在20、30、40、50、60、70、80、90°(：水浴条件下反应15.0111111测定酶 活。结果见图4,该酶最适溫度为40°C。
[0080] 2.热稳定性:酶液分别在0、30、40、45、50、60、65、70、75、80 °C水浴中保溫60min立 即冰浴，分别取0-葡聚糖底物1.5血，加入经不同溫度处理后的酶液20化L，40°C水浴15min， 测定酶活。结果见图5,该酶在60°CW下具有良好的热稳定性。60°C时酶活力保持在 64.54%，在50°C时相对酶活力保持在87.12%。
[0081 ] 3.最适抑:配置抑为2、3、4、5、6、7、8的憐酸氨二钢巧樣酸缓冲液和抑为9的氨氧化 钢-甘氨酸缓冲液，并用上述缓冲液分别配1.0%的0-葡聚糖溶液，取底物1.5mL，适当稀释 后的酶液20化L，分别在40°C水浴条件下反应15. Omin测定酶活。结果见图6，该酶的最适pH 为6。
[0082] 4. pH稳定性:配置pH为2、3、4、5、6、7、8的憐酸氨二钢巧樣酸缓冲液和pH为9、10、 11、12的氨氧化钢-甘氨酸缓冲液，用上述不同的pH缓冲液在室溫条件下处理酶化，取β-葡 聚糖底物1.5mL，加入经上述缓冲液处理后的酶液200yL，分别在40°C水浴条件下反应 15. Omin测定酶活。结果见图7，该酶在pH = 4-11之间具有良好的抑稳定性。抑=4时相对酶 活力为82.42%，pH=ll时相对酶活力为77.81 %。
[0083] 5.金属离子的影响：在试管中加入1.5ml 1.0%的β-葡聚糖底物(抑=6.0)，分别 加入20化L含50.0 mmo 1 /L化合物的酶液使各反应体系中各化合物终浓度分别为5.8mmo 1/L， 40°C水浴下反应15 . Omin，W蒸馈水作对照测定各金属离子对β-葡聚糖酶活的影响。由图8 可W看出MnCl2对β-葡聚糖酶的活性具有明显的促进作用，相对酶活可W达到155.45%。而 加(：12、〔曰(：12对0-葡聚糖酶的活性具有较弱的抑制作用相对酶活力分别为85.99%和 95.47%。而HgCl2抑制作用最强，明显抑制β-葡聚糖酶的酶活。ZnCl2、FeCl3具有一定的抑制 作用相对酶活力分别为54.52%和21.24%。
[0084] 综上所述，该β-葡聚糖酶具有较高的酶活力，且热稳定性和抑稳定性较好，在酿酒 工业、工业废水处理、功能性食品的开发及饲料应用方面具有广阔的开发潜力和应用前景。
【主权项】
1. 一种β-葡聚糖酶，其特征在于所述β-葡聚糖酶由海洋芽孢杆菌N6-2产生，分子量为 24kDa，所述的海洋芽孢杆菌Ν6-2于2014年11月23日保藏于中国武汉典型培养物保藏中心， 保藏号为CCTCC N0:M2014586,所述β-葡聚糖酶的制备方法:将海洋芽孢杆菌N6-2菌株接种 于含有种子培养基的试管中，在15_36°C的摇床中100_300rpm，培养25-30h;将上述培养后 的菌株按2-6% (v/v)的接种量接种于盛有发酵培养基的摇瓶中，15-36°C，100_300rpm，发 酵培养48-90h;取菌株发酵液，离心，除掉发酵液中的菌体和杂质，并调节其pH在6.5-7.5， 即为粗制发酵样品；超滤法粗提，获得10~30kDa组分，用硫酸铵沉淀法获得硫酸铵饱和浓 度在30 % -65 % (g/ml)的组分，将30 % -65 % (g/ml)的组分过Q离子交换层析柱，将穿透峰Q1 脱盐后真空冷冻干燥保存，将收集的穿透峰Q1，过CM离子交换柱，收集穿透峰C1，脱盐后真 空冷冻干燥保存，即为海洋芽孢杆菌N6-2所产生的β-葡聚糖酶。2. 根据权利要求1所述β_葡聚糖酶的制备方法，其特征在于所述的种子培养基的成分 及质量体积比：牛肉膏〇. 2-0.8%、蛋白胨1 -2%、氯化钠0.3-1 %，ρΗ6.8-7.5。3. 根据权利要求1所述β_葡聚糖酶的制备方法，其特征在于所述的发酵培养基的成分 及终浓度:蔗糖〇. 5-1 % (质量体积比）、牛肉膏0.2-0.8% (质量体积比）、蛋白胨1-2% (质量 体积比）、氯化钠0.3-1 % (质量体积比），矿物油0.5-1%。(v/v)，ρΗ6.8-7.5。4. 权利要求1所述β_葡聚糖酶的制备方法，其特征在于它的具体步骤为： (1) 菌株的发酵： 取海洋芽孢杆菌Ν6-2菌株，接种于含有种子培养基的试管中，在15-36°C的摇床中100-300rpm，培养25-30h; 将上述培养后的菌株按4%(v/v)的接种量接种于盛有发酵培养基的摇瓶中，15-36°C， 100-300rpm，发酵培养48-90h;取菌株发酵液，离心，除掉发酵液中的菌体和杂质，并调节其 pH在6.5-7.5，即为粗制发酵样品。 (2) 超滤截留 取海洋芽孢杆菌N6-2发酵液，在SOOOrpm下离心，除掉菌体与部分杂质。依次用分子量 为50kDa、30kDa、10kDa、5kDa、3kDa的滤膜，截留发酵液，获得10~30kDa的组分，调节pH值至 7.0； 所述的种子培养基的成分及终浓度:牛肉膏0.2-0.8% (质量体积比），蛋白胨1-2% (质 量体积比），氯化钠0.3-1 % (质量体积比），pH6.8-7.5。 所述的发酵培养基的成分及终浓度:蔗糖〇.5-1% (质量体积比），牛肉膏0.2-0.8% (质 量体积比），蛋白胨1-2 % (质量体积比），氯化钠0.3-1 % (质量体积比），矿物油0.5-1%。( v/ v)，pH6·8-7·5。 (3) 硫酸铵沉淀法粗提 取步骤(2)所述的10~30kDa组分，置于冰浴之中，缓慢向其中加入硫酸铵固体粉末，使 其水溶液浓度达到30 % (g/ml)，4 °C静置2h，lOOOOrpm离心，沉淀作为杂蛋白，遗弃;取上清 取，向其中缓慢加入硫酸铵固体粉末，使其水溶液浓度达到65 % (g/ml)，4 °C静置2h， lOOOOrpm，离心，弃上清，取沉淀;沉淀用50mmol/L的pH7.96三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲 液溶解，装入3kDa透析袋，置于相同缓冲液中透析，4h、8h、12h换一次缓冲液，既得到硫酸铵 饱和浓度在30 % -65 % (g/ml)的组分。 (4) Q离子交换层析 取步骤(3)所述的硫酸铵饱和浓度30%-65%(g/ml)的组分，过Q离子交换层析柱，上样 缓冲液为20-60mmol/L的pH6.0-8.0三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液，每次上样量为5-20mL，洗脱液为含lmol/L NaCl的上样Tris-HCl缓冲液，洗脱液以100% (v/v)的浓度进行洗 脱，流速为3mL/min，检测波长为280nm，收集穿透峰Q1，脱盐后真空冷冻干燥保存； 上述步骤中的上样缓冲液为50mmol/L，pH7.96。 上述步骤中每次上样量为5mL。 (5)CM离子交换层析 取步骤(4)中收集的穿透峰Q1，过CM离子交换柱，上样缓冲液为20-60mmol/L的pH6.0-9.0氢氧化钠甘氨酸缓冲液，每次上样量为1-lOmL洗脱液为含lmol/L NaCl的氢氧化钠甘氨 酸上样缓冲液，洗脱液以1〇〇 % (v/v)的浓度进行洗脱，流速为3mL/min，收集穿透峰C1，脱盐 后真空冷冻干燥保存，即为海洋芽孢杆菌N6-2所产生的β-葡聚糖酶。 上述步骤中的上样缓冲液为25mmol/L，ρΗ9.0; 上述步骤中每次上样量为2mL。5. 权利要求1所述β_葡聚糖酶在工业中的应用。6. 权利要求1所述β_葡聚糖酶在酿酒工业和工业废水处理中的应用。7. 权利要求1所述β_葡聚糖酶在食品行业中的应用。8. 权利要求1所述β_葡聚糖酶在制备魔芋等饮品中的应用。9. 权利要求1所述β_葡聚糖酶在饲料加工中的应用。
【文档编号】C12R1/07GK106011113SQ201610618679
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月29日
【发明人】郑兰红, 康道乐, 杨康利, 梁方方, 朱美虹
【申请人】中国水产科学研究院黄海水产研究所