一种人凝血酶的制备方法
【专利摘要】本发明涉及血液制品领域，特别是涉及一种人凝血酶的制备方法。本发明提供一种人凝血酶的制备方法，包括如下步骤：1）将人血浆Cohn级分得到的组分III复溶、病毒灭活，所得料液通过阴离子交换树脂纯化，获得凝血酶原复合物洗脱液；2）在步骤1）所得洗脱液中加入钙离子，孵育至凝血酶原被有效活化；3）将步骤2）所得料液通过阳离子交换树脂进行分离纯化；4）将步骤3）所得料液进行纳米膜过滤，即得所述人凝血酶成品。本发明所提供的制备方法利用本工艺市场的凝血酶制品，不仅活力高、得率高，而且长期稳定性也好，符合临床应用的安全有效的要求，具有较明显的经济价值和现实意义。
【专利说明】
-种人凝血酶的制备方法
技术领域
[0001] 本发明设及血液制品领域，特别是设及一种人凝血酶的制备方法，所述制备方法 可W用于从人血浆中大规模生产人凝血酶。
【背景技术】
[0002] 凝血酶属于丝氨酸蛋白类水解酶，由308个氨基酸残基组成，分子量36KD，是由轻 链和重链通过二硫键连接而成的双链分子。其中轻链有49个氨基酸残基，对凝血酶的结构 稳定性起到重要作用；重链有259个氨基酸残基，是凝血酶的酶活功能区。凝血酶的前体是 凝血酶原(FII)，是一种维生素 K依赖蛋白，在肝脏合成，血浆中含量约10-15毫克/分升，分 子量68KD。
[0003] 凝血酶的形成在整个凝血机制中起到中屯、的作用。凝血机制启动后，产生的微量 凝血酶能够激活凝血因子ν,νιπ，IX等因子而放大凝血反应，进而产生大量的凝血酶。运些 凝血酶会迅速将可溶性的纤维蛋白原裂解成不可溶的纤维蛋白，并通过活化XIII在纤维蛋 白之间进行共价交联而形成稳定的网状结构。凝血酶还能够与血小板表面的凝血酶受体结 合而活化血小板，促使血小板的释放和聚集，并与凝固的纤维蛋白一起，在血管损伤处形成 稳定的血栓，从而达到止血的目的。另一方面，凝血酶能够激活蛋白C系统，灭活内源性凝血 因子化和VII la的活性，终止凝血反应，与ΑΤ-ΙΙI系统和组织因子途径抑制物系统共同阻止 血液凝块的形成。此外，凝血酶在激活纤溶系统，清除血块，促进伤口愈合也有重要生理功 能。
[0004] 在临床上，凝血酶可直接作用于凝血反应的最后环节，将血液中的纤维蛋白原转 变为纤维蛋白，促使血小板凝聚，加速血液凝固，达到迅速止血的目的，是一种公认的速效 局部止血首选药，适用于各种因素引起的出血症状，如消化道，气管，W及各种手术出血等。 凝血酶还可与纤维蛋白原配合，制成纤维蛋白胶粘合剂，用于外科出血，粘合组织和处置难 度大的创伤。临床研究发现，凝血酶可W促进上皮细胞的生成，使创面愈合时间缩短一半。 在中枢神经系统正常发育和损伤保护中的研究表明，小剂量凝血酶可产生神经保护作用， 而大剂量则具有细胞毒性作用。随着对凝血酶制剂临床研究的不断深入，凝血酶的市场需 求必将呈现逐渐扩大的趋势。
[0005] 相对于动物血浆来源的凝血酶，人血浆来源制备的凝血酶不会引起异源性免疫反 应，也不存在感染CJDV等病毒的风险，无疑具有更加良好的市场前景。
[0006] 制备人凝血酶的原料主要有去冷胶血浆，Cohn组分I上清，Cohn组分III，凝血酶原 复合物等。US PATENT 5354682报道，W去冷胶血浆为原料，通过DEAE介质富集II因子并洗 脱收集。在洗脱液中加入巧离子和兔脑凝血活酶激活凝血酶原，解育约1小时后生成凝血 酶。经过SD除病毒步骤，凝血酶经过S-S邱harose进一步纯化，得到高比活的凝血酶制品。US PATENT 5907032同样报道了一种W去冷胶血浆为原料生成凝血酶的方法。通过DEAE- cellose吸附去冷胶血浆中的凝血因子后，洗脱液中加入约70mM的巧离子，PH控制在6.4- 6.6，在20°C解育18小时即可大量生成凝血酶。作者认为DEAE-cel lose洗脱液中含有活化与 非活化的因子IX和X，促凝憐脂W及足够的因子V和VIII，在巧离子存在的情况下，通过内源 凝血途径大量生成凝血酶。为去除潜在的病毒污染，文中采用SD结合干热法两步措施实现 除病毒效果。US PATENT 5714370也介绍了一种单巧离子激活产生凝血酶的工艺条件，即 2.5mM巧离子，PH7.0，30°C解育80min后，1U的凝血酶原可产生4洲的凝血酶活性。专利特殊 的地方在于，凝血酶原被DEAE富集洗脱后即进行冻干，然后进行60°C干热10hrs，80°C干热 化r，先行干热除病毒步骤。之后复溶冻干品，进入下一步纯化步骤。作者认为，因为凝血酶 对高溫的天然敏感性，而凝血酶原却对溫度有较好的耐受性，因此在凝血酶原阶段进行干 热出病毒，能够大幅提高凝血酶的得率。干热除病毒阶段添加稳定剂可W提高凝血酶的得 率，但同时也可能增强病毒抗热能力，从而削弱干热除病毒的效果。中国专利CN02117151.3 也介绍了 一种低巧离子激活产生凝血酶的工艺条件，从8公斤Cohn组分III得到70000单位 的凝血酶半成品，得率为每公斤血浆制得约800单位凝血酶。由于该专利采用干热病毒灭活 法处理凝血酶冻干品，可能对凝血酶的活力造成影响，凝血酶活力的长期稳定性也无法得 到保证。
【发明内容】
[0007] 鉴于W上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种人凝血酶的制备方 法，用于解决现有技术中的问题。
[0008] 为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种人凝血酶的制备方法，包括如 下步骤：
[0009] 1)将人血浆Cohn级分得到的组分ΙΠ 复溶、病毒灭活，所得料液通过阴离子交换树 脂纯化，获得凝血酶原复合物洗脱液；
[0010] 2)在步骤1)所得洗脱液中加入巧离子，解育至凝血酶原被有效活化；
[0011] 3)将步骤2)所得料液通过阳离子交换树脂进行分离纯化；
[0012] 4)将步骤3)所得料液进行纳米膜过滤，即得所述人凝血酶成品。
[0013] 所述步骤1)中，复溶所采用的溶剂通常可W是本领域各种适用于对人血浆Cohn级 分得到的组分ΠΙ进行纯化的溶液，例如可W是包括但不限于巧樣酸钢水溶液、氯化钢水溶 液中的一种或多种的组合，再例如，巧樣酸钢水溶液中巧樣酸钢的浓度可W为0.01Μ~ 0.02Μ，氯化钢水溶液中氯化钢的浓度可W为0.1Μ~0.2Μ，水溶液的pH可W为6.5~7.0。
[0014] 在本发明一些实施方式中，所述步骤1)中，病毒灭活采用S/的去病毒灭活。
[001日]所述步骤1)中，所述S/D(Solvent/dete巧ent)法病毒灭活通常指有机溶剂/去污 剂混合物(S/D)破坏包膜病毒的脂膜。本领域技术人员可选择合适的条件对复溶后的人血 浆Cohn级分得到的组分ΙΠ 进行S/的去病毒灭活，例如，S/的去病毒灭活的条件可W是25°C，5 ~6小时，再例如可W是0.3%TNBP+l%Triton-X100，再例如可W是0.3%TNBP+l%吐溫- 80o
[0016]所述步骤1)中，阴离子交换树脂主要是用于吸附经病毒灭活后的料液中的凝血因 子。本领域技术人员可选用合适种类的阴离子交换树脂对所述料液进行纯化，具体可选用 的阴离子交换树脂可W是例如DEAE Sephadex A50、DEAE Sepharose FF、Q Sepharose FF、 Q Se地arose XL、Capto DEAE、Capto Q、段h施mo猿Q、扣ac化妒廊EMD TMAE、Fiacto尝过愈EMD DEAE等凝胶中的一种或多种的组合。本领域技术人员可选择合适的条件使用阴离子交换树 脂对所述料液进行纯化，w获得凝血酶原复合物洗脱液。所述纯化通常包括吸附、洗涂、洗 脱等步骤，例如，洗涂时采用的溶液可W是巧樣酸钢水溶液、氯化钢水溶液中的一种或多种 的组合，再例如，巧樣酸钢水溶液中巧樣酸钢的浓度可W为0.01M~0.02M，氯化钢水溶液中 氯化钢的浓度可W为0.1M~0.2M，水溶液的抑可W为6.5~7.0，再例如，洗脱时采用的溶液 可W是巧樣酸钢水溶液、氯化钢水溶液中的一种或多种的组合，再例如，巧樣酸钢水溶液中 巧樣酸钢的浓度可W为0.01M~0.02M，氯化钢水溶液中氯化钢的浓度可W为0.5M~2.0M， 水溶液的pH可W为6.5~7.0。
[0017] 在本发明一些实施方式中，所述步骤2)中，解育至凝血酶原通常被巧离子有效活 化，在解育过程中，通常可W通过检测凝血酶活性，判断凝血酶原是否被有效活化，例如，解 育至凝血酶原被有效活化可W通过检测人凝血酶效价（中国药典2015版Ξ部)判断凝血酶 原是否有效活化。更具体的，可W通过凝血酶活性检测，凝血酶含量趋于稳定而不再增加， 即可判断料液中的凝血酶原已有效活化。在本发明一些实施方式中，所述步骤2)中，洗脱液 中巧离子的浓度为lOmM~lOOmM。
[0018] 在本发明一些实施方式中，所述步骤2)中，洗脱液中加入巧离子的具体方法为:洗 脱液中加入可溶性巧盐。
[0019] 在本发明一些实施方式中，所述步骤2)中，所述可溶性巧盐可W为水溶性巧盐，所 述可溶性巧盐选自氯化巧等中的一种或多种的组合。
[0020] 所述步骤3)中，阳离子交换树脂主要是用于吸附料液中的凝血酶。本领域技术人 员可选用合适种类的阳离子交换树脂对所述料液进行纯化，具体可选用的阳离子交换树脂 可W是例如SP-Sepharose FF,SP-Sephadex 巧0,CM-Sepha;rose FF，抗actogcl'Kl.M) S0：3- (Μ)等中的一种或多种的组合。本领域技术人员可选择合适的条件使用阳离子交换树脂对 所述料液进行纯化，W获得较高纯度的凝血酶。所述纯化通常包括吸附、洗涂、洗脱等步骤， 例如，洗涂时采用的溶液可W是氯化钢水溶液、Tris-HCL水溶液等，氯化钢水溶液中氯化钢 的浓度为0.1~0.2M，Tr i S-HCL水溶液的浓度可W为0.01~0.02M，水溶液的pH可W为6.5~ 7.5,再例如，洗脱时采用的溶液可W是氯化钢水溶液、Tris-HCL水溶液等，氯化钢水溶液中 氯化钢的浓度为0.5~2.0M，Tris-H化水溶液的浓度可W为0.01~0.02M，水溶液的抑可W 为6.5~7.5。
[0021] 在本发明一些实施方式中，所述步骤3)和/或步骤4)中，还可W根据需要调整料液 中凝血酶的浓度，例如，可W在纳米膜过滤前调整料液中凝血酶的浓度，调整后的凝血酶浓 度可 W 为 lOOIU/ml ~2000IU/ml。
[0022] 在本发明一些实施方式中，所述步骤4)中，纳米膜过滤所使用的纳米膜的孔径为 10nm~50nm〇
[0023] 在本发明一些实施方式中，还可W将步骤4)所得产物进行除菌和/或冻干。
[0024] 本领域技术人员可选择合适的条件对料液进行除菌，例如，可选用除菌过滤的方 法，更具体可W使用除菌膜进行除菌过滤，所述除菌膜可W是例如〇.22um孔径滤膜(用于过 滤除菌)等。
[0025] 如上所述，本发明的人凝血酶的制备方法结合W往凝血酶制备工艺的经验W及药 典要求，针对凝血酶产品特点W及工艺特要求，创新性地提供了一种W纳米膜进行病毒去 除的大规模工业化的凝血酶生产方法。所述人凝血酶的制备方法利用本工艺市场的凝血酶 制品，不仅活力高、得率高（制备的凝血酶得率每公斤血浆约5000-10000单位，比活每毫克 蛋白约800-900单位），而且长期稳定性也好，符合临床应用的安全有效的要求，具有较明显 的经济价值和现实意义。
【具体实施方式】
[0026] W下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书 所掲露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可W通过另外不同的具体实 施方式加 W实施或应用，本说明书中的各项细节也可W基于不同观点与应用，在没有背离 本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0027] 在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案;还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中 另外明确指出，单数形式"一个"、"一"和"运个"包括复数形式。
[0028] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端 点W及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和 科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、 材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可W使用与本 发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实 现本发明。
[0029] 除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领 域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及 相关领域的常规技术。运些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等 MOLECULAR CL0NING:A LABORATORY MANUAL,Second edition,Cold Spring Harbor LaboratoiT Press,1989 and Third edition，2001;Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY John Wiley&Sons，New York,1987 and periodic updates;the series METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego；Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION,Third edition'Academic Press，San Diego,1998;METH0DS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，畑romatin。.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego,1999;和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY'Vol.119'Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
[0030] 实施例中所使用的检测方法如下：
[0031 ] - .凝血酶含量的检测
[0032] 参看中国药典2015版二部，"凝血酶冻干粉"所列方法。标准品为凝血酶国家标准 品（GB20021105,5IU/via)，纤维蛋白原为人纤维蛋白原制品，如上海RAAS公司生产的HFNG (201202肥A0)。
[0033] 二.样品蛋白浓度的检测
[0034] 利用岛津UV-1800,调整波长至280,可W测定样品在280nm的紫外吸收值(0D280)。
[0035] 实施例1
[0036] 1. 2.3吨健康人血浆经乙醇级分法得到的80公斤组分III，经过SD病毒灭活和离 子交换树脂分离纯化得到11.5公斤凝血酶原复合物溶液(具体方法参见凝血酶原复合物病 毒灭活的研究[J].中国生物制品学杂志，1995,8(3): 101-104;人凝血酶原复合物的病毒灭 活与验证[J].中国输血杂志，1998,11(4): 195-197)。经过lOmM巧离子激活，检测凝血酶活 性大于lOOOIU/ml并趋于稳定时，停止巧离子解育，进行阳离子交换树脂分离纯化凝血酶。 层析介质为SP-Sephadex C50，平衡缓冲液为0.1M氯化钢，0.02M TriS-肥L，pH6.5的溶液， 洗脱缓冲液是0.5M氯化钢，0.02M化iS-肥L，P册.5的溶液。洗脱液为15.2公斤凝血酶溶液， 总活力为1.5 X107单位，总蛋白含量为18500毫克。活力回收每公斤血浆为6500单位凝血 酶，比活为每毫克蛋白810单位凝血酶。
[0037] 2.用0.15M氯化钢，20mM Tris，1 %甘氨酸超滤换液，配制成25公斤凝血酶原液，每 毫升含600单位凝血酶活力。用1平方米的20纳米孔径的纳米膜过滤去除病毒，用除菌膜过 滤后分装成12000瓶凝血酶半成品，每瓶装量2毫升，含1200单位凝血酶。
[0038] 3.经过冻干后，真空上塞密封，凝血酶成品放在2至8度低溫保存。
[0039] 实施例2
[0040] 1. 2.3吨健康人血浆经乙醇级分法得到的81公斤组分III，经过SD病毒灭活和离 子交换树脂分离纯化得到12公斤凝血酶原复合物溶液(具体方法参见凝血酶原复合物病毒 灭活的研究[J].中国生物制品学杂志，1995,8(3) :101-104;人凝血酶原复合物的病毒灭活 与验证[J].中国输血杂志，1998,11(4) :195-197)。经过lOOmM巧离子激活，检测凝血酶活性 大于lOOOIU/ml并趋于稳定时，停止巧离子解育，进行阳离子交换树脂分离纯化凝血酶。层 析介质为SP-Sepharose FF，平衡缓冲液为0.15M氯化钢，0.01M Tris-肥L，pH7.0的溶液，洗 脱缓冲液是1.0M氯化钢，0.01M化iS-HCL，pH7.0的溶液。得到15.4公斤凝血酶洗脱液，总活 力为1.55X107单位，总蛋白含量为19000毫克。活力回收每公斤血浆为6740单位凝血酶，比 活为每毫克蛋白815单位凝血酶。
[0041 ] 2.用0.15M氯化钢，20mM化is，1 %甘氨酸超滤换液，配制成25.8公斤凝血酶原液， 每毫升含600单位凝血酶活力。用1平方米的20纳米孔径的纳米膜过滤去除病毒，用除菌膜 过滤后分装成12400瓶凝血酶半成品，每瓶装量2毫升，含1200单位凝血酶。
[0042] 3.经过冻干后，真空上塞密封，凝血酶成品放在2至8度低溫保存。
[0043] 实施例3
[0044] 将实施例2制备的凝血酶成品于25°C放置，并分别于0，1，2,3个月取出样品，用2ml 水复溶，检测凝血酶活性，观察凝血酶的稳定性，结果如下表：
[0045]
[0046] 检测数据表明，经过纳米膜除病毒得到的凝血酶活力具有良好的长期稳定性。
[0047] 综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
[0〇4引上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟 悉此技术的人±皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因 此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所掲示的精神与技术思想下所完 成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
【主权项】
1. 一种人凝血酶的制备方法，包括如下步骤： 1) 将人血浆Cohn级分得到的组分III复溶、病毒灭活，所得料液通过阴离子交换树脂纯 化，获得凝血酶原复合物洗脱液； 2) 在步骤1)所得洗脱液中加入钙离子，孵育至凝血酶原被有效活化； 3) 将步骤2)所得料液通过阳离子交换树脂进行分离纯化； 4) 将步骤3)所得料液进行纳米膜过滤，即得所述人凝血酶成品。2. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中，病毒灭活采用S/D法病毒 灭活。3. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述阴离子交换树脂选 自DEAE Sephadex A50、DEAE Sepharose FF、Q Sepharose FF、Q Sepharose XL、Capto DEAE、Capto Q、_Eshmuno?_Q、FractogcIS.EMD TMAE、FractogeKiiEMD DEAE中的一种或多种的 组合。4. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，洗脱液中钙离子的浓度 为 IOmM ~IOOmM 〇5. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，洗脱液中加入钙离子的 具体方法为:洗脱液中加入可溶性钙盐。6. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中，所述阳离子交换树脂选 自 SP-Sepharose FF ,SP-Sephadex C50, CM-Sepharose FF，FradogeKiiEMD SO3-(M)中的一 种或多种的组合。7. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中，在纳米膜过滤前调整料 液中凝血酶的浓度至100 IU/ml~2000 IU/ml。8. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中，纳米膜过滤所使用的纳 米膜的孔径为IOnm~50nm〇9. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，还可以将步骤4)所得产物进行除菌和/ 或冻干。
【文档编号】C12N9/74GK106011116SQ201610614283
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月29日
【发明人】徐俊, 施炜, 夏正祥, 王弘远, 占德国, 周雪峰, 程露
【申请人】上海莱士血液制品股份有限公司