大白菜抗根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR540、引物及应用
【专利摘要】本发明公开了一种大白菜抗根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR540，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，TCR540与CRb基因共分离，可用于芸薹种包括结球白菜和青梗菜抗根肿病基因的分子标记辅助选择。在辅助选择过程中同时使用这些标记，选择理论准确度可达到100％，并且该标记重复性好，可靠性高，检测成本低，省时省力。
【专利说明】
大白菜抗根肿病CRb基因的共分离分子标巧TCR540、引物及 应用
技术领域
[0001 ]本发明属于生物技术领域，具体设及一种大白菜抗根肿病CRb基因的共分离分子 标记TCR540、引物及应用。
【背景技术】
[0002] 2002年，本课题组获得了1份抗芸臺根肿病的大白菜双单倍体系'CR化inki DH' 系，研究表明该抗病材料抗芸臺根肿菌生理小种2、4和8 (Piao等，Conver si on of A化P marker linked to clubroot resistance gene into SCAR marker.2002，J Kor Soc 化的Sci 43:653-665)。进一步研究证明抗根肿病基因为显性单基因，并命名为CRb(Piao 等，SCAR and CAPS mapping of CRb, a gene conferring resistance to PI曰smodiophor曰 br曰ssic曰e in Chinese c曰bb曰ge(Br曰ssic曰 r曰p曰 ssp.pekinensis)， Theor Appl Genet,2004,108:1458-1465)。
[0003] 在芸臺种抗根肿病品种转育过程中，每代都需要采用田间接种根肿病菌的方法鉴 定中间材料的基因型，而且环境条件会影响到正确中间材料的选择，运样势必影响转育进 程，因此抗病品种转育难的问题还没有彻底解决。分子标记辅助选择技术(MAS)可能是最终 解决运一问题的有效途径。
[0004] 目前，国内沈阳农业大学朴钟云课题组获得了与芸臺种抗根肿病基因 CRb连锁的 标记（2004,2014)，包括TCR01，TCR05和TCR09,见（Piao等，SCAR and CAPS mapping of CRb,a gene conferring resistance to Plasmodiophora brassicae in Chinese cabbage(Brassica rapa ssp.pekinensis)，W及1'〔1?108、1'〔1?30、1'〔1?74、1'〔1?79，见口11日]1邑 等，Fine genetic and physical mapping of the CRb gene conferring resistance to clubroot disease in Brassica rapa.，Mol Breeding, 134:1173-1183)。但运些标记并不 是与C肺共分离的标记，利用运些标记进行分子标记辅助选育时容易造成连锁累寶。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种大白菜抗根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR540、引 物及应用，利用该分子标记可对待测植株进行苗期鉴定，从而减少连锁累寶，简化大白菜抗 根肿病品种的转育程序。
[0006] 本发明提供了一种大白菜抗根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR540,所述大白 菜抗根肿病C肺基因的共分离分子标记TCR540的核巧酸序列如SEQ ID N0.1所示，为：
[0007] 5 '-TGACATTGTTGATGTGCTGATAAAAAAATCAGTAAGTCTAAGCAAATGTATATATTTTAGTTCTAT TGGAACTTTGGATTACTGCTTTCTTCGCTTAGAAAAGTTTGCATTTTTACTTCAGGGAACCGAAGCAATTGAAGGCA TATTT-3'。
[000引本发明还提供了一种上述大白菜抗根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR540的 PCR特异性扩增引物，包括：
[0009] F TCR540:5'-TGACATTGTTGATGTGCTGA-3'
[0010] R TCR540:5 '-AAATATGCCTTCAATTGCTTC-3 '。
[0011] 本发明还提供了一种大白菜抗根肿病C肺基因的共分离分子标记TCR540,在分子 标记辅助选择中的应用。
[0012]本发明还提供了一种大白菜抗根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR540,在大白 菜抗根肿病分子标记辅助选择中的应用。
[0013] 本发明还提供了一种上述大白菜抗根肿病C肺基因的共分离分子标记TCR540的应 用方法，具体包括：
[0014] (1)用CTAB方法提取待巧耐料的基因组DNA [00 巧](2)PCR 扩增
[0016] a.反应体系：10化体系，各组分物质的含量分别为15ng模板DNA;5pmol · L-1引物； 1.0mmol.L-idNTP;1.0uL 10XPCR Buffer;0.5U Taq DNA聚合酶；d地2〇补齐lOyL，混匀，离 屯、，
[0017] 其中引物的序列为F TCR540:5'-TGACATTGTTGATGTGCTGA-3'，
[0018] R TCR540:5 '-AAATATGCCTTCAATTGCTTC-3 '；
[0019]6.扩增程序：94°(：预变性5111111;94°(：变性3〇3;60°(：退火453;72°(：延伸3〇3;35个循 环后；72°C延伸lOmin;最后4°C保存；
[0020] C.电泳:将扩增产物与等体积的上样缓冲液混合，94°C变性6min，之后在DNA测序 电泳仪上进行6%变性聚丙締酷胺凝胶电泳，70W条件下电泳1.5小时，电泳结束后，进行银 染，并观察扩增结果；
[0021] d.判断:扩增结果中如果能够检测到148bp和大于148bp两条带，则待测材料中含 有大白菜抗根肿病基因 CRb的概率为100%。
[0022] 本发明提供的一种大白菜抗根肿病C肺基因的共分离分子标记TCR540,与芸臺种 抗根肿病基因 C^b共分离，可广泛应用于芸臺种抗根肿病基因(^b的分子标记辅助选择育 种。本发明通过特异引物PCR扩增可对待测植株进行苗期鉴定，大大提高育种效率，缩短育 种进程。
【附图说明】
[0023] 图1为TCR540和TCR541在抗病材料'CRBJN3-2'、感病材料'BJN3-2' W及重组体中 的扩增结果；
[0024] 其中，图1A为TCR540在抗病材料' CRBJN3-2 '（R泳道）、感病材料' BJN3-2 '（ S泳道） W及重组体（1-44号泳道）中的扩增结果，图1B为TCR5"在抗病材料' CRBJN3-2 '（R泳道）、感 病材料'BJN3-2 '（S泳道)W及重组体(1-44号泳道)中的扩增结果；
[0025] 图2为TCR540的引物在大白菜抗病材料和感病材料当中扩增出来的序列对比图；
[0026] 图3为大白菜抗根肿病CRb基因的遗传连锁图谱。
【具体实施方式】
[0027] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明进行详细说明，但应当理解本发明的保护 范围并不受【具体实施方式】的限制。
[00%] -、大白菜抗根肿病C肺基因的共分离分子标记TCR540和TCR541的获得
[0029] 1、分离群体的构建
[0030] W含抗根肿病基因 CRb的大白菜品系' CRBJN3-2 '为父本，易感染根肿病的大白菜 品系' B JN3-2 '为母本杂交获得Fi，所获Fi代植株全部表现为抗病。W上两个亲本' CRBJN3-2 ' 和'BJN3-2'均保存于沈阳农业大学。选择单株Fi自交构建F2代作图群体，群体数为4783个。 播种的全部4783个F2群体，种植10天后接种根肿菌。40天后进行抗病性鉴定，4783个F2群体 中3641个抗病，1142个感病，经卡方检验符合3:1的分离比二3.16 <二3.84)。
[0031] 2、CTAB 法提取 DNA
[0032] 1)、在1.5ml离屯、管中加入498uL 1 X CTAB提取液W及2uU3-琉基乙醇，摇匀，其中1 X CTAB提取液包含2% 的CTAB，lOOmmol/L的Tris-肥1，20mmol/L的抓TA和 1.4mol/L的化C1， 其中2%的CTAB指的质量浓度为2%(w/v);
[0033] 2)、取0.2g幼嫩叶片，在液氮条件下研磨至粉末，加入到含有CTAB提取液和β-琉基 乙醇的离屯、管中，摇匀；
[0034] 3)、随后将离屯、管放入65°C水浴中，每隔5分钟摇一次，水浴30min;
[0035] 4)、取出离屯、管，加入等体积的氯仿:异戊醇混合物(24:l，v/v)，摇晃lOmin后，常 溫下120001·/min 离屯、lOmin;
[0036] 5)、将上清液转移到另一离屯、管中，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1，v/v)，摇晃 lOmin 后，常溫下 120001·/min 离屯、lOmin;
[0037] 6)、将上清液移至另一离屯、管当中，加入2倍体积事先预冷的无水乙醇，混匀后，将 抱团的DNA挑入到装有400ULTE缓冲液的离屯、管中溶解；
[003引 7)、加入 1.加 LRNaseA(lOugAiL)，混匀后 37Γ 保存 30min;
[0039] 8)、重复步骤5);
[0040] 9)、将上清液转移到另一离屯、管中，向离屯、管中加入50uL 3mol/LNaAC溶液和预冷 的等体积的异丙醇，-20 °C沉淀20min;
[0041 ] 10)、4°C条件下12000r/m离屯、lOmin，弃掉上清液，加入75%的乙醇清洗2次；
[0042] 11)、在超净工作台上风干DNA，加入50化TE (Tri S-抓TA)溶解DNA，-20 °C冰箱中保 存。
[0043] 二、大白菜抗根肿病C肺基因的共分离分子标记TCR540和TCR541的获得和鉴定
[0044] 1、多态性引物的筛选
[0045] 根据朴钟云课题组2014年发表的抗根肿病CRb基因的2个侧翼标记TCR79和 TCR108序列（Zhang 等，Fine genetic and physical mapping of the CRb gene conferring resist曰nee to clubroot disease in Brassies r曰p曰.，Mol Breeding,34: 1173-1183)，将该基因错定在大白菜A3连锁群83.5化区间内。分析化assica化tabase数据 库化ttp: //brasS i ca化.0巧)序列信息，发现目标区域存在15个基因。根据运15个基因的基 因功能，对其中5个抗病相关基因在抗病材料'CRBJN3-2'上进行测序。对测序结果进行比 对，发现抗病材料中有3个基因的序列与Brassica Database数据库（http:// brassicadb.org)中参考基因组序列存在差异。因此，根据抗病材料的测序结果，利用 Prime巧.0软件，共设计3对引物。
[0046] 利用设计的3对引物扩增亲本'CRBJN3-2'和'BJN3-2'的DNA，其中有2对引物在亲 本间具有多态性，并分别命名为TCR540和TCR541，TCR540和TCR541对应的分子标记的序列 分别为：
[0047] (l)TCR540(148bp)的核巧酸序列如沈Q ID N0.1所示，为：
[004引 5 '-TGACATTGTTGATGTGCTGATAAAAAAATCAGTAAGTCTAAGCAAATGTATATATTTTAGTTCTAT TGGAACTTTGGATTACTGCTTTCTTCGCTTAGAAAAGTTTGCATTTTTACTTCAGGGAACCGAAGCAATTGAAGGCA TATTT-3'。
[0049] (2)1'〇?541(25269)的核巧酸序列如沈9 10^.4所示，为：
[0050] 5 '-TGCTTGAGCAGAAACAATATCAAAAATCTACCTGGAAGCATCAAGAAACTTCATCATCTCAAATCT CTTTACTTGCATTGTCAACAGCTCGTTTCTCTTCCACTGCTTCCATCAAATCTGCAGTATCTGGATGCTCATGGCTG TATCTCACTCGAAACAGTGGCTAAACCCATGACGCTTCTTGTGGTAGCTGAAAGGAACCAGTCTACTTTCGTCTTCA CTGATTGTTTCAAGCTAAACAGAGATGCGCAA-3 '。
[0化1] 根据上述序列分别设计并合成了针对TCR540的一对引物F TCR540/R TCR540，W 及针对TCR541的一对引物F TCR541/R TCR541，具体序列如下：
[0化2] (1)TCR540的引物：
[0化3] FTCR540:5'-TGACATTGTTGATGTGCTGA-3'（核巧酸序列如沈QIDN0.2所示）
[0化4] 1?1'〇?540:5'-444了4了6〇：1'1^44176(：1'1'(：-3'（核巧酸序列如沈9 10備.3所示）。
[0化5] (2)TCR541 的引物：
[0化6] FTCR541:5-TGCTTGAGCAGAAACAATATCAA-3'（核巧酸序列如沈QIDN0.5所示） [0057] 1?1'〇?541:5'-176〔6〔41'(：1'(：了61'7^6(：1'1'-3'（核巧酸序列如沈9 10備.6所示）。
[0化引 2、分子标记的鉴定
[0化9] 为了验证运些分子标记的可靠性，首先，利用C肺两翼连锁标记TCR79和TCR74见 (Zhang等，Fine genetic and physical mapping of the CRb gene conferring resistance to clubroot disease in Brassica rapa.，Mol Breeding,34:1173-1183)f^ 选1142株F2代感病个体中的重组体；然后，利用TCR540的引物（F TCR540/R TCR540)和 TCR541的引物(F TCR541 /RTCR541)分别对含抗根肿病基因 CRb的大白菜' CR BJN3-2 '和易 感根肿病的大白菜自交系'BJN3-2 '及其44个F2代感病重组体进行了PCR扩增。扩增结果表 明如图1所示，图1A为TCR540在抗病材料'CR BJN3-2'（R泳道）、感病材料'BJN3-2'（S泳道） W及重组体（1-44号泳道）中的扩增结果，使用TCR540的引物进行扩增，在抗病亲本'CR BJN3-2'上能扩增出一条148bp的条带，在感病亲本'BJN3-2'和44株F2代感病重组体上均能 扩增出一条大于148bp的条带；图1B为TCR541在抗病材料'CR BJN3-2'（R泳道）、感病材料 '8抑3-2'（5泳道似及重组体（1-44号泳道）中的扩增结果，使用1'0?541的引物进行扩增，在 抗病亲本' CRBJN3-2 '上能扩增出一条252bp的条带，在感病亲本' BJN3-2 '和44株F2代感病 重组体上均能扩增出一条大于25化P的条带。
[0060] TCR540的引物在抗病材料当中扩增出来的序列为：
[0061 ] 5 '-TGACATTGTTGATGTGCTGATAAAAAAATCAGTAAGTCTAAGCAAATGTATATATTTTAGTTCTAT TGGAACTTTGGATTACTGCTTTCTTCGCTTAGAAAAGTTTGCATTTTTACTTCAGGGAACCGAAGCAATTGAAGGCA TATTT-3'。
[0062] TCR540的引物在感病材料当中扩增出来的序列为：
[0063] 5 '-TGACATTGTTGATGTGCTGACCAACAACTCAGTAAGTCAGAGAAAATGTATATCTGTTACTTCCAC TGCTAGAAAATGTATATCTATTACTTCCACTGAAATTTAGAATACTGTTTAGGTTCCTTTGTACACTTAGAAGCTTA TGTTTCTGAACTCATTTGCCATTTTTCTTCAGGGAACAGAAGCAATTGAAGGCATATTT-3'。
[0064] 上述两个序列的对比结果如图2所示，结果表明，两个序列存在较大的差异性，说 明TCR540的分子标记能够很好的区分大白菜抗病材料和感病材料，可用于芸臺种包括结球 白菜和青梗菜抗根肿病基因的分子标记辅助选。
[0065] 3、遗传图谱的构建
[0066] 根据F2群体的筛选鉴定结果，计算各标记与CRb基因间的重组率，MapchartS. 1绘 审化Rb基因的遗传连锁图谱（图3)，图右侧标记之间的数字表示标记间的重组体数，图左侧 的数字表示两标记之间的遗传距离，由图可知^379、1'0?108、1'0?0、1'0?7、1'0?74，分别定 位于距离CRb基因0.03cM、0.04cM、0.36cM、0.43cM、0.49cM处。而新开发的分子标记TCR540、 TCR541与CRb基因存在共分离关系。因此，确定运2个标记可W运用到今后大白菜抗根肿病 CRb基因的分子标记辅助选育过程当中，并且由于运2个分子标记为共分离标记，与之前的 连锁标记相比，在分子标记辅助育种的应用中能够消除连锁累寶现象，大大提高转育效率。
[0067] Ξ、大白菜抗根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR540和TCR541在辅助选择大白 菜抗根肿病植株中的应用方法，具体包括：
[0068] 1、用CTAB方法提取待测材料的基因组DNA
[0069] 用CTAB方法提取待测大白菜材料的基因组DNA，具体步骤参照上文中"一、大白菜 抗根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR540、TCR541的获得"中"2、CTAB法提取DNA"部分记 载的内容。
[0070] 2、PCR 扩增
[0071] a.反应体系：10化体系，各组分物质的含量分别为15ng模板DNA;5pmol · 1/1引物； 1.0mmol.L-idNTP;1.0uL 10XPCR Buffer;0.5U Taq DNA聚合酶；d地2〇补齐lOyL，混匀，离 屯、，
[0072] 其中，TCR540使用的引物的序列为：
[0073] F TCR540:5 '-TGACATTGTTGATGTGCTGA-3 '，
[0074] R TCR540:5 '-AAATATGCCTTCAATTGCTTC-3 '，
[00巧]TCR541使用的引物的序列为：
[0076] F TCR541:5 '-TGCTTGAGCAGAAACAATATCAA-3 '，
[0077] R TCR541:5 '-TTGCGCATCTCTGTTTAGCTT-3 '；
[007 引 6.扩增程序：94°(：预变性5111111;94°(：变性303;60°(：退火453;72°(：延伸303;35个循 环后；72°C延伸lOmin;最后4°C保存。
[0079] 3、电泳：
[0080] TCR540:将扩增产物与等体积的上样缓冲液混合，94°C变性6min，之后在DNA测序 电泳仪上进行6%变性聚丙締酷胺凝胶电泳，70W条件下电泳1.5小时，电泳结束后，进行银 染；
[0081 ] TCR541:将扩增产物与等体积的上样缓冲液混合，94°C变性6min，之后在DNA测序 电泳仪上进行6%变性聚丙締酷胺凝胶电泳，70W条件下电泳2小时，电泳结束后，进行银染。 [0082]需要说明的是，上样缓冲液采用聚丙締酷胺凝胶电泳常用的缓冲液，其中包含 98%("八）的的1'111日1111(16,1011^的抓了4,0.001%(>八）的巧16]16巧日]1〇巧1]0.001%(>八）的 bromphenol blue。
[0083] 4、结果分析
[0084] ①在使用TCR540的引物的扩增结果中如果能够检测到148bp和大于148bp两条带， 则待测材料中含有大白菜抗根肿病基因 CRb的概率为100 %。
[0085] ②在使用TCR541的引物的扩增结果中如果能够检测到25化P和大于25化P两条带， 则待测材料中含有大白菜抗根肿病基因 CRb的概率为100 %。
[0086] 如果①、②2项中的扩增结果均可获得，则待测材料具有大白菜抗根肿病基因 CRb 的概率为100 %。
[0087] 尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造 性概念，则可对运些实施例作出另外的变更和修改。所W，所附权利要求意欲解释为包括优 选实施例W及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0088] 显然，本领域的技术人员可W对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精 神和范围。运样，倘若本发明的运些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围 之内，则本发明也意图包含运些改动和变型在内。
【主权项】
1. 一种大白菜抗根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR540，其特征在于，所述大白菜抗 根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR540的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，为： 5'-TGACATTGTTGATGTGCTGATAAAAAAATCAGTAAGTCTAAGCAAATGTATATATTTTAGTTCTATTGGA ACTTTGGATTACTGCTTTCTTCGCTTAGAAAAGTTTGCATTTTTACTTCAGGGAACCGAAGCAATTGAAGGCATATT T-3, 。2. -种权利要求1所述的大白菜抗根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR540的PCR特异 性扩增引物包括： F TCR540:5 '-TGACATTGTTGATGTGCTGA-3 ' R TCR540:5 '-AAATATGCCTTCAATTGCTTC-3 '。3. 根据权利要求1所述的大白菜抗根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR540,在分子标 记辅助选择中的应用。4. 根据权利要求1所述的大白菜抗根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR540，在大白菜 抗根肿病分子标记辅助选择中的应用。5. -种权利要求1所述的大白菜抗根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR540的应用方 法，具体包括： (1) 用CTAB方法提取待测材料的基因组DNA (2) PCR扩增 a. 反应体系：10yL体系，各组分物质的含量分别为15ng模板DNA;5pmol · I/1引物； l.Ommol.L-MNTPd.OuL 10XPCR Buffer;0.5U Taq DNA聚合酶；ddH20补齐 10yL，混匀，离 心， 其中引物的序列为F TCR540:5'-TGACATTGTTGATGTGCTGA-3'， R TCR540:5 '-AAATATGCCTTCAATTGCTTC-3 '； b. 扩增程序：94°C预变性5min; 94°C变性30s; 60°C退火45s; 72°C延伸30s; 35个循环后； 72°(：延伸1〇11^11;最后4°(：保存； c .电泳:将扩增产物与等体积的上样缓冲液混合，94°C变性6min，之后在DNA测序电泳 仪上进行6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，70W条件下电泳1.5小时，电泳结束后，进行银染，并 观察扩增结果； d.判断:扩增结果中如果能够检测到148bp和大于148bp两条带，则待测材料中含有大 白菜抗根肿病基因 CRb的概率为100 %。
【文档编号】C12Q1/68GK106011134SQ201610459379
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月22日
【发明人】朴钟云, 张腾, 庞文星, 李晓楠, 朴英兰, 张椿雨
【申请人】沈阳农业大学