水稻黑色种皮基因qBP3、分子标记引物及分子标记方法
【专利摘要】本发明公开了一种水稻黑色种皮基因qBP3、分子标记引物及分子标记方法，所述水稻黑色种皮基因qBP3在水稻第3染色体20.4?20.6 Mb的区间内，所述水稻黑色种皮基因qBP3控制水稻黑色种皮颜色变化。本发明通过鉴定了一个新的黑色种皮基因qBP3，获得了与其紧密连锁的基于PCR的InDel分子标记IDBP3?1，该标记可以有效进行水稻黑色种皮的辅助选择，主要用于水稻外观品质的辅助选择；本发明的分子标记引物可以在苗期对自然群体或杂交低世代群体在各种环境条件下进行基因型选择，保留带有基因qBP3的杂合或纯合的个体做进一步杂交，提高了水稻性状改良中选择的准确性和效率，加快育种进程。
【专利说明】
水稻黑色种皮基因 qBP3、分子标巧引物及分子标巧方法
技术领域
[0001] 本发明属于植物分子遗传学、植物基因组学、植物分子育种领域，尤其设及一种水 稻黑色种皮基因姐P3、分子标记引物及分子标记方法。
【背景技术】
[0002] 水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全世界有超过一半人口 W稻米为主食。随 着生活质量和水平的不断提高，全面平衡营养观念深入人屯、，人们对有色稻米的喜爱逐渐 增力日。有色稻米根据种皮颜色，可分为红米、黄米、黑（紫)米和绿米。其中，黑米因具有很高 的营养价值而深受广大消费者喜爱，具有广阔的市场前景。黑米的种皮色素主要为花青素 (又称花色素）。在植物中，对玉米、金鱼草、矮牵牛等的花青素代谢途径研究已经比较成熟， 分离和克隆了很多花青素生物合成相关基因。但水稻花青素形成的潜在机制仍未阐明完 全，基因如何调控种皮不同颜色、花青素各种转录因子的互作机制、花青素在组织器官中的 表达特点等问题需要研究和探讨。
[0003] 水稻是单子叶模式作物，基因组较小，全基因组已经被测序，运有利于进一步研究 花青素代谢途径过程中相关基因的表达调控和互作机制。通过对水稻黑色种皮中花青素基 因的鉴定、功能分析及其生物合成途径中调控机制的深入研究，可W丰富对水稻花青素的 形成机制的认识，为进一步精准开发利用黑色种皮稻米提供重要基础。
【发明内容】
[0004] 针对W上技术问题，本发明公开了一种水稻黑色种皮基因 qBP3、分子标记引物及 分子标记方法，利用419份广西地方稻种资源核屯、种质进行了水稻种皮颜色全基因组关联 分析，在水稻第3染色体上鉴定了一个新的黑色种皮基因姐P3,获得了与其紧密连锁的基于 PCR的InDel分子标记IDBP3-1，该标记可W有效进行水稻黑色种皮的辅助选择，主要用于 水稻外观品质的辅助选择。
[0005] 对此，本发明采用的技术方案为： 一种水稻黑色种皮基因姐P3,所述水稻黑色种皮基因姐P3在水稻第3染色体20.4-20.6 Mb的区间内，所述水稻黑色种皮基因姐P3控制水稻黑色种皮颜色变化。
[0006] 作为本发明的进一步改进，所述水稻黑色种皮基因 qBP3为化化?知?7W口，所述 化口成?iZW口的核巧酸序列如序列表中SEQ ID N0:1所示。
[0007] 本发明还公开了一种如上所述的水稻黑色种皮基因 qBP3在水稻基因克隆、功能分 析或育种上的应用。
[000引本发明发现了一个影响水稻黑色种皮变化的关键区域，位于水稻第3染色体上，解 释黑色种皮颜色的遗传变异达到31.97%，并获得了与此性状紧密连锁标记IDBP3-1，有望用 于新基因的标记辅助选择育种。本发现的新基因基因 gWy位于水稻第3染色体20.4-20.6 Mb区域内，运个位点上尚未有控制水稻种皮颜色的基因被发现，因此，g公/?是一个控制水稻 黑色种皮颜色的新基因。
[0009] -种如上所述的水稻黑色种皮基因 qBP3的分子标记引物，所述分子标记引物包括 一对特异的PCR引物IDBP3-1，所述IDBP3-1的正向引物的序列如序列表中SEQ ID N0:2所 示，所述IDBP3-1的反向引物的序列如序列表中SEQ ID N0:3所示。
[0010] 所述IDBP3-1正向引物序列为:GTCGAGCATGAAGTCTTTTT; 所述IDBP3-1反向引物的序列为:GAGTTGGATTTGGAAATGTG。
[0011] 本发明还公开了一种如上所述的水稻黑色种皮基因 qBP3的分子标记引物在水稻 基因克隆、功能分析或育种上的应用。
[0012]本发明还公开了一种水稻黑色种皮基因 qBP3的分子标记方法，采用如上所述的水 稻黑色种皮基因姐P3的分子标记引物进行分子标记，如果能扩增出131 bp大小的片段，说 明该材料带有姐P3基因。
[0013] 本发明还公开了一种如上所述的水稻黑色种皮基因 qBP3的分子标记方法在水稻 基因克隆、功能分析或育种上的应用。
[0014] 筛选上述的水稻黑色种皮新基因9公化觀分子标记的开发方法，包括W下步骤： 1)通过2013年、2014年晚稻对419水稻材料种皮颜色进行鉴定，白色种皮材料308份，占 73.5%;红色种皮92份，占22.0%;黑色种皮19份，占4.5%。
[0015] 2)利用419份水稻品种的简化基因组测序，获得了 1，090,071个单核巧酸多态性位 点（SNPs)。通过全基因组关联分析(GWAS)鉴定了影响水稻黑色种皮的关键区域，位于水稻 第3染色体20.4-20.6 Mb区域内。
[0016] 3)依据2)中重测序结果，比较419份材料在20.2-20.8 Mb区域内的序列差异，发 现大部分黑米材料与非黑米材料相比较，存在21 bp的缺失。
[0017] 4)选取21 bp缺失区段的两侧300 bp范围内的序列，用Primer Premie巧.0软件 设计引物，使其扩增的产物大小适中。
[0018] 5)使用4)设计的标记对水稻黑色种皮材料与非黑色种皮材料的基因组DNA进行扩 增，黑色种皮材料与非黑色种皮材料分别能扩增出131 bp和110 bp大小的片段。
[0019] 本发明所述的水稻黑色种皮新基因 gWy为进一步开发利用黑色种皮稻米提供理 论证据和材料基础。
[0020] 与现有技术相比，本发明的有益效果为： 第一，水稻黑色种皮基因 g公/?是利用广西稻种资源核屯、种质通过GWAS分析鉴定的新基 因，其位于水稻第3染色体上。目前，已报道的水稻黑色种皮基因绝大部分位于水稻第1、4染 色体上。
[0021] 第二，通过设计与新基因紧密连锁的共显性分子标记，能够用于水稻分子标记辅 助选择育种，获得带有曲W的育种材料。
[0022] 第Ξ，本发明的标记可W苗期对自然群体或杂交低世代群体在各种环境条件下进 行基因型选择，保留带有基因 gWy的杂合或纯合的个体做进一步杂交，提高了水稻性状改 良中选择的准确性和效率，加快育种进程。
【附图说明】
[0023] 图1为419份广西地方稻种资源核屯、种质种皮颜色的全基因组关联分析结果。其 中，A为关联SNP位点的Mahattan图；B为QQ-Plot图。
[0024] 图2为利用InDel标记IDBP3-1对自然群体进行分析的电泳图。其中，Μ为DNA 1日'1?5';1，2为非黑色种皮材料1?13日1日地和〔3;3-14为黑色种皮材料〔28、(：52、(：54、〔60、〔61、 〔65、(：132、(：133、(：136、〔222、〔251、〔253、〔256、〔258、〔303、〔348、〔358、〔362、〔364;日为片段 大小为 110 bp，b为 131 bp。
【具体实施方式】
[0025] 下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。
[0026] (一)g公/?基因的定位 1.供试材料 实验材料为419份广西地方稻种资源核屯、种质，于2013年、2014年晚稻对其进行种皮颜 色鉴定，白色种皮材料308份，占73.5%;红色种皮92份，占22.0%;黑色种皮19份，占4.5%。
[0027] 2. DNA提取、基因组修饰、PCR扩增及测序 采用CTAB法(Rogers and Bendich, 1988)提取每个样品的DNA，利用事先选好的酶切 组合对DNA进行酶切打断实验，将酶切产物进行5'末端修复，同时对5'末端进行憐酸化 修饰，3 '末端加 A，使之与sol exa接头5 '端T互补，提高接头连接效率，阻止so lexa接头自连。 3'和和5'端分别修饰完成之后，继续连接solexa测序接头，便于将连接产物错定在 flowcell上，进行桥式扩增。用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，通过PCR扩增，增大文库 量，建好的文库用Illumina HiSeqTM 2000进行测序。
[00%] 3.测序数据分析 对测序得到的原始reads(双端序列）进行数据评估，得到各个样品的原始reads,将 reads比对到参考基因组上，基因组为Ensembl数据库上下载的最新水稻基因组(RGAP， http://rice.plan忧iology.msu.edu/)。获得SLAF 片段后进行 SNP检测。
[0029] 4.全基因组关联分析 基于419份水稻品种的简化基因组测序，经质控后，获得了 1，090,071个单核巧酸多态 性位点（SNPs)。使用混合线性模型来检测关联的SNPs，黑色种皮最高显著关联位点位于水 稻第3染色体20491101 bp处。依据LD衰退水平（120化），将始/?定位在20.4-20.6 Mb范围 内，并获得了与之紧密连锁的分子标记IDBP3-U位于20.0 Mb)。该区间目前尚未有任何已 知的水稻种皮颜色的基因位点或QTL被报道。如图1结果所示，鉴定了水稻黑色种皮新基因 g公户义位于水稻第3染色体20.4-20.6 Mb区域内；在第7染色体上显著关联区域(6.06-6.35 Mb)，为水稻红色果皮基因 Rc，已克隆。
[0030] 5.生物信息学分析 我们依据LD衰退水平，在筛选出的最显著SNP位点上下游240化范围内有22个预测基 因，并与KEGG，GO，COG，nr，Swi Ssprot等数据库比对，进行功能注释，提取对应基因的注释 结果，获得了一个与花青素化合物生物合成的基因 L0C_0s03g37010(G0:0009718)。同时参 考已报道种皮颜色相关基因信息，将化化树7W口作为重要候选基因，其序列见SEQ ID NO: 1所示。
[0031] 6.依据上述重测序结果，比较419份材料在20.2-20.8 Mb区域内的序列差异，发 现大部分黑米材料与非黑米材料相比较，存在21 bp的缺失。
[0032] 7.选取21 bp缺失区段的两侧300 bp范围内的序列，设计引物，使其扩增的产物 大小适中。所述分子标记引物包括一对特异的PCR引物IDBP3-1，所述IDBP3-1的正向引物的 序列如序列表中SEQ ID N0:2所示，所述IDBP3-1的反向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。
[0033] 所述IDBP3-1 正向引物序列为:GTCGAGCATGAAGTCTTTTT; 所述IDBP3-1反向引物的序列为:GAGTTGGATTTGGAAATGTG。
[0034] 8.使用所述IDBP3-1引物对水稻黑色种皮材料与非黑色种皮材料的基因组DNA进 行扩增。
[0(X3日]其中材料分别为：1，2为非黑色种皮材料kasalath和C3;3-14为黑色种皮材料C28、 C52、C54、C60、C61、C65、C132、C133、C136、C222、C251、C253、C256、C258、C303、C348、C358、 C362、C364。
[0036] 如图2所示，黑色种皮材料与非黑色种皮材料分别能扩增出131 bp和110 bp大小 的片段。我们利用开发的分子标记IDBP3-1，在自然群体中进行IDBP3-1的基因型选择，用分 子标记IDBP3-1能够扩增出mbp的扩增片段，标志着水稻品种带有gW义说明利用gW褲f 基因的分子标记IDBP3-1可W进行水稻黑色种皮的标记辅助选择。
[0037] 本发明应用于水稻外观品质性状分子标记辅助选择育种，可W在苗期对自然群体 或杂交低世代群体，在各种复杂环境条件下进行基因型选择，保留带有基因 qBP3的杂合或 纯合的个体做进一步杂交，提高了水稻性状改良中选择的准确性和效率，加快育种进程。
[0038] W上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于运些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，还可W做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的 保护化围。
【主权项】
1. 一种水稻黑色种皮基因 qBP3,其特征在于:所述水稻黑色种皮基因 qBP3在水稻第3染 色体20.4-20.6 Mb的区间内，所述水稻黑色种皮基因 qBP3控制水稻黑色种皮颜色变化。2. 根据权利要求1所述的水稻黑色种皮基因 qBP3,其特征在于:所述水稻黑色种皮基因 qBP3为所述的核苷酸序列如序列表中SEQ ID ΝΟ:1所 不。3. 权利要求1或2所述的水稻黑色种皮基因 qBP3在水稻基因克隆、功能分析或育种上的 应用。4. 权利要求1或2所述的水稻黑色种皮基因 qBP3的分子标记引物，其特征在于:所述分 子标记引物包括一对特异的PCR引物IDBP3-1，所述IDBP3-1的正向引物的序列如序列表中 SEQ ID NO:2所示，所述IDBP3-1的反向引物的序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。5. 权利要求4所述的水稻黑色种皮基因 qBP3的分子标记引物在水稻基因克隆、功能分 析或育种上的应用。6. -种水稻黑色种皮基因 qBP3的分子标记方法，其特征在于:采用权利要求4所述的水 稻黑色种皮基因 qBP3的分子标记引物进行分子标记，如果能扩增出131 bp大小的片段，说 明该材料带有qBP3基因。
【文档编号】C12Q1/68GK106011149SQ201610579097
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月21日
【发明人】杨行海, 张宗琼, 李丹婷, 夏秀忠, 农保选, 曾宇, 刘开强, 邓国富, 韦价报
【申请人】广西壮族自治区农业科学院水稻研究所