一种益生型抗菌肽Enterocin P 及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种益生型抗菌肽Enterocin P及其制备方法和应用。本发明的益生型抗菌肽Enterocin P基因，具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本发明的抗菌肽Enterocin P基因编码成熟抗菌肽Enterocin P具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本发明抗菌肽Enterocin P的制备方法，包括如下步骤：(1)人工合成核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的基因；(2)构建能表达抗菌肽的重组质粒；(3)用所述重组质粒转化宿主菌构建基因工程菌；(4)利用所述基因工程菌表达抗菌肽；(5)对抗菌肽的抑菌活性进行检测。本发明对病原菌具有抑菌活性，可作动物饲料添加剂。
【专利说明】
-种益生型抗菌化Enteroc i η P及其制备方法和应用
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体设及一种益生型抗菌肤Enterocin P及其制 备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 近年来，抗生素在动物养殖业中的大量滥用，导致抗生素耐药性菌株不断出现，药 物残留，环境污染和生态破坏等诸多问题，严重威胁到人类健康和畜牧业的发展。因此，寻 找一种能替代抗生素的新型抗菌制剂迫在眉睫。抗菌肤具有抗菌效果好，热稳定性好，无 毒，无残留，无副作用，安全高效，对环境无污染且不易产生细菌耐药性等优点，有望成为解 决抗生素滥用运一难题的有效方法。
[0003] 抗菌肤是生物防御系统中产生的对抗外源性病原体的肤类物质，是生物天然的. 防御系统的重要组成部分。抗菌肤来源极其广泛，从植物，昆虫，鸟类，哺乳动物，微生物都 已被发现有抗菌肤的产生。迄今为止，已有近千种抗菌肤被相继分离纯化及鉴定。
[0004] 细菌产生的抗菌肤是在其代谢过程中通过核糖体合成机制产生的具有抑菌活性 的多肤类物质。抗菌肤在益生菌中较为普遍。几乎所有的益生菌都能产生一种或几种抗菌 肤物质。近年来，国内外学者已从植物乳杆菌，嗜酸乳杆菌，双歧杆菌，嗜热链球菌，乳酸乳 球菌等许多益生菌中分离纯化得到多种抗菌肤物质。
[0005] 抗菌肤Enterocin P是从Enterococcus faecium P13分离纯化获得的抗菌肤，命 名为Enterocin P。抗菌肤Enterocin P的结构基因编码71个氨基酸的前肤。其前肤包括27 个氨基酸的信号肤和44个氨基酸的成熟肤。抗菌肤化terocin P具有较广的抗菌谱，尤其对 单核细胞增生李斯特菌.金黄色葡萄球菌等病原菌有明显的抑制效果，具有较好的应用前 景。
[0006] 抗菌肤Enterocin P在其产生菌Enterococcus faecium P13中含量极低，从产生 菌中提取抗菌肤产量低，费时长，工艺复杂且费用昂贵，无法实现大规模生产，从而制约抗 菌肤化terocin P的实际应用。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是针对上述问题，提供一种具有显著的抗病原菌作用的益生型抗菌 肤Enterocin P及其制备方法和应用。
[000引为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：本发明的一种益生型抗菌肤 Enterocin P基因，具有沈Q ID No. 1所示的核巧酸序列。
[0009] 本发明所述的益生型抗菌肤Enterocin P基因编码成熟抗菌肤Enterocin P具有 SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
[0010] 本发明所述的益生型抗菌肤化terocin P的制备方法，包括如下步骤：
[0011] (1)人工合成核巧酸序列如SEQ ID NO:3所示的基因；
[0012] (2)构建能高效表达抗菌肤linterocin P的pNZ8148-Ente;rocin P重组质粒；
[0013] (3)用所述PNZ8148-化terocin P重组质粒转化宿主菌，构建乳酸乳球菌NZ900的 基因工程菌；
[0014] (4)利用所述基因工程菌乳酸乳球菌表达抗菌肤化terocin P;
[0015] (5)对抗菌肤化terocin P的抑菌活性进行检测。
[0016] 进一步地，在步骤（1)中，人工合成两侧含psti和化nd虹的酶切位点的Enterocin P基因具有SEQ ID No.3所示的核巧酸序列。
[0017]进一步地，在步骤(2)中，将SEQ ID No. 3所示的核巧酸序列连接与经限制性内切 酶psti和Hind虹双酶切后线性化的PNZ8148质粒连接获得pNZ8148-Enterocin P连接产物， 将连接产物导入大肠杆菌MC1061，获得含pNZ8148-Enterocin P重组质粒。
[0018] 更进一步地，在步骤(3)中，所述宿主菌为大肠杆菌MC1061;
[0019] 将提取pNZ8148-Enterocin P重组质粒，经PCR和酶切鉴定正确的质粒采用电转化 转入乳酸乳球菌感受态细胞NZ9000中进行抗菌肤Enterocin P的诱导表达，电转化处理参 数为2.0 k V、2 5 μ F、2 0 0 Ω、5 m S，经氯霉素抗性筛选、P C R验证，酶切鉴定得到正确的含 pNZ8148-Enterocin P重组质粒的乳酸乳球菌NZ900的基因工程菌。
[0020] 进一步地，在步骤(4)中，将含pNZ8148-Enterocin P重组质粒的乳酸乳球菌NZ900 的基因工程菌接种于含红霉素的GM17液体培养基，30°C培养至0D600nm为0.5时，加入终浓 度lOng/ml的nisin诱导表达，培养4h后，4000g离屯、lOmin取上清液，将获得的上清液进行 0.22μηι过滤获得诱导后的无菌上清液，得到益生型抗菌肤化terocin P。
[0021] 进一步地，在步骤(5)中，采用琼脂扩散法对抗菌肤Enterocin P的抑菌活性进行 检测，经37Γ培养后，抗菌肤Enterocin P对金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌或沙 口氏菌的抑菌活性进行检测。
[0022] 本发明所述的益生型抗菌肤化terocin P在动物饲料中的应用。
[0023 ] 进一步地，所述动物饲料为饲料添加剂。
[0024] 有益效果:本发明对病原菌具有较强的抑菌活性，安全，无毒，无副作用，无抗生素 耐药性等优点，可用作动物饲料添加剂。本发明的所构建的基因工程菌不仅具有乳酸乳球 菌本身的益生作用，还具有抗菌肤化terocin P明显的抗病原菌作用，可W更好的作为益生 型饲料添加剂安全有效地应用于动物饲料。
[0025] 与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[00%] (1)本发明的抗菌肤来自对动物有益生作用的Enterococcus faecium P13,预期 用于动物饲料添加剂中对动物会有更好的作用和益生效果，Enterocin P抗菌肤的成熟肤 分子量大约为4.5邸a具有显著的抗病原菌作用。
[0027] (2)本发明所表达的抗菌肤Enterocin P来自于Enterococ州S faecium P13,对动 物体没有毒性，因此用本发明的基因制备的抗菌肤与传统的抗生素药物相比，将是一种更 为安全的抗病原菌的短肤类物质。本发明的益生型抗菌肤Enterocin P基因为益生菌 Enterococcus faecium P13益生型抗菌肤linterocin P基因 linterocin P，所编码的抗菌肤 Enterocin P是从益生菌linterococ州S faecium P13发酵上清液中分离得到的。
[0028] (3)本发明W常用的益生菌乳酸乳球菌为宿主菌构建的基因工程菌，乳酸乳球菌 本身就是对动物健康有利的益生菌，同时将抗菌肤化terocin P在乳酸乳球菌中获得了有 效的分泌表达。将化terocin P基因导入益生菌乳酸乳球菌中获得基因工程菌并进行高效 表达，将此基因工程菌作为发酵菌株用于饲料发酵，可用作于动物饲料添加剂，提高饲料的 营养价值和动物抗病能力。
【附图说明】
[0029] 图1是本发明的按照质粒提取试剂盒提取由含目的基因的大肠杆菌DH5a质粒的示 意图，泳道1:目的基因质粒;泳道M:500bp ladder marker;
[0030] 图2是本发明的大肠杆菌D册α目的基因质粒酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳图，泳 道1:目的基因质粒;泳道M:500bp ladder marker;
[0031] 图3是本发明的PNZ8148质粒图谱的示意图；
[0032] 图4是本发明的采用化KaRa Biotech限制性内切酶PstI和化nd虹操作说明双酶切 pNZ8148质粒的示意图，泳道l:pNZ8148质粒;泳道Μ:11Λ ladder marker;
[0033] 图5是本发明重组质粒转化大肠杆菌MC1061单菌落的示意图；
[0034] 图6是本发明大肠杆菌MC1061单菌落为DNA模板的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电 泳图，泳道1:目的基因；泳道M:500bp ladder marker;
[0035] 图7是本发明天根质粒提取试剂盒操作说明提取大肠杆菌MC1061重组质粒后进行 1 %琼脂糖凝胶电泳图，泳道1:重组质粒;泳道M: 500bp ladder marker;
[0036] 图8是本发明提取大肠杆菌MC1061重组质粒采用TaKaRa Biotech限制性内切酶 PstI和化ndm操作说明双酶切质粒，产物经1%琼脂糖凝胶电泳图，泳道1:重组质粒;泳道 M：500bp 1曰dder m曰rker;
[0037] 图9是本发明重组质粒转化乳酸乳球菌NZ9000单菌落的示意图；
[0038] 图10是本发明乳酸乳球菌NZ9000单菌落为DNA模板的PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶 电泳图，泳道1:目的基因；泳道M:500bp ladder marker;
[0039] 图11是本发明天根质粒提取试剂盒操作说明提取乳酸乳球菌NZ9000重组质粒后 进行1 %琼脂糖凝胶电泳图，泳道1:重组质粒;泳道M:化b ladder marker;
[0040] 图12是本发明提取乳酸乳球菌NZ9000重组质粒采用TaKaRa Biotech限制性内切 酶PstI和化ndm操作说明双酶切质粒，产物经1%琼脂糖凝胶电泳图，泳道1:目的基因；泳 道M:500bp 1曰dder marker;
[0041 ]图13是本发明化terocin P对李斯特菌的抑菌效果图，其中1，2,3为实验组；
[0042] 图14是本发明化terocin P对金黄色葡萄球菌的抑菌效果图，其中1，2，3为实验 组；
[0043] 图15是本发明化terocin P对沙口氏菌的抑菌效果图，其中1，2,3为实验组。
【具体实施方式】
[0044] W下通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，运些实施例是本发明的阐释 和举例，并不W任何形式限制本发明的范围。
[0045] 本发明的一种益生型抗菌肤化terocin P基因，具有SEQ ID No.l所示的核巧酸序 列。
[0046] 权利要求1所述的益生型抗菌肤Enterocin P基因编码成熟抗菌肤化terocin P具 有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
[0047] 本发明所述的益生型抗菌肤化terocin P的制备方法，包括如下步骤：
[004引 （1)人工合成两侧含psti和化nd虹的酶切位点的化terocin P基因具有SEQ ID No.3所示的核巧酸序列。人工合成核巧酸序列如SEQ ID N0:3所示的基因；
[0049] (2)构建能高效表达抗菌肤Enterocin P的pNZ8148-Enterocin P重组质粒;将沈Q ID No. 3所示的核巧酸序列连接与经限制性内切酶psti和Hind虹双酶切后线性化的 PNZ8148质粒连接获得pNZ8148-Enterocin P连接产物，将连接产物导入大肠杆菌MC1061， 获得含9版8148斗11161'〇(3；[]1?重组质粒。
[(K)加](3)用所述PNZ8148-化terocin P重组质粒转化宿主菌，构建乳酸乳球菌NZ900的 基因工程菌;所述宿主菌为大肠杆菌MC1061;
[0化1 ] 将提取pNZ8148-Enterocin P重组质粒，经PCR和酶切鉴定正确的质粒采用电转化 转入乳酸乳球菌感受态细胞NZ9000中进行抗菌肤Enterocin P的诱导表达，电转化处理参 数为2.0 k V、2 5 μ F、2 0 0 Ω、5 m S，经氯霉素抗性筛选、P C R验证，酶切鉴定得到正确的含 pNZ8148-Enterocin P重组质粒的乳酸乳球菌NZ900的基因工程菌。
[0化2] (4)利用所述基因工程菌乳酸乳球菌表达抗菌肤Enterocin P;将含PNZ8148- Enterocin P重组质粒的乳酸乳球菌NZ900的基因工程菌接种于含红霉素的GM17液体培养 基，30°C培养至0D600皿为0.5时，加入终浓度lOng/ml的ni S in诱导表达，培养地后，4000g离 屯、lOmin取上清液，将获得的上清液进行0.22皿过滤获得诱导后的无菌上清液，得到益生型 抗菌肤Enterocin Pc
[0053] (5)对抗菌肤Enterocin P的抑菌活性进行检测。采用琼脂扩散法对抗菌肤 Enterocin P的抑菌活性进行检测，经37°C培养后，抗菌肤化terocin P对金黄色葡萄球菌、 单核细胞增生李斯特菌或沙口氏菌的抑菌活性进行检测。
[0化4] 本发明所述的益生型抗菌肤化terocin P在动物饲料中的应用。
[0055]所述动物饲料为饲料添加剂。
[0化6] 实施例1
[0057]本发明所使用的主要材料
[0化引菌株与载体:大肠杆菌MC1061、乳酸乳球菌NZ9000和PNZ8148质粒菌购于德国Mo Bi Tec公司；DM Marker购于上海捷瑞有限公司；李斯特菌、金黄色葡萄球菌W及沙口氏 菌;益生型抗菌肤Enterocin P基因由生工生物工程(上海)有限公司合成并转入大肠杆菌 D册α;引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。
[0059] 主要试剂与试剂盒:Ml 7肉汤培养基购自青岛海博公司；限制性内切酶Pst I和化nd 虹.T4DNA Ligase.EX Taq购自TaKaRa Biotech公司；氯霉素质粒提取和DNA凝胶回收试剂 盒购自天根公司;nisin购于Sigma公司。
[0060] 主要试剂的配制：
[0061 ] GM17:M17肉汤培养基121°C高压灭菌15min，冷却后加入过滤除菌的葡萄糖至终浓 度为0.5% (质量体积比）。
[0062] SGM17 :M17肉汤加入终浓度为0.5M薦糖，2.5 %甘氨酸.0.5 %葡萄糖。M17肉汤中加 入薦糖和甘氨酸后12rC高压灭菌15min，冷却后加入0.22μπι过滤除菌的葡萄糖至终浓度为 0.5% (质量体积比）。
[0063] 0.5Μ薦糖/10%甘油：17.115g薦糖溶解于80ml超纯水中，加入10ml甘油后混匀定 容至100ml，0.22皿过滤除菌。
[0064] LB液体培养基：lOg蛋白腺.5g酵母提取物，Ig化Cl溶解于900ml蒸馈水中，调节抑 值至7.0后，定容至1L后121°C高压灭菌15min。
[0065] 主要仪器:高速冷冻离屯、机，移液器.PCR仪均购于德国化pendorf公司；核酸电泳 槽.电泳仪.电转化仪购于Bio-Rad公司；凝胶成像仪购于上海天能公司；除菌过滤膜(0.2化 m)购自怖at Man公司。
[0066] 目的基因获得：
[0067] 1.益生型抗菌肤Enterocin P基因由生工生物工程(上海)有限公司合成，两侧加 PstI和化nd虹的酶切位点并导入大肠杆菌D册α。如图1所示，为本发明按照质粒提取试剂盒 提取由含目的基因的大肠杆菌DH5a质粒的示意图；泳道1:目的基因质粒；泳道M:500bp 1曰dder m曰rker。
[006引 2.如图2所示，为本发明的按照化KaRa Biotech限制性内切酶Pst巧肌ind虹双酶 切步骤1中提取的质粒，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳，目的基因片段采用天根公司DNA回 收试剂和操作方法进行胶回收，-20°C保存备用；泳道1:目的基因质粒；泳道M:500bp 1曰dder m曰rker。
[0069] 质粒PNZ8148线性化：
[0070] 如图3所示，为本发明采用的PNZ8148质粒图谱的示意图；如图4所示，为本发明的 采用TaKaRa Biotech限制性内切酶Pst巧日Hind虹操作说明双酶切PNZ8148质粒经1%琼脂 糖凝胶电泳图，目的基因片段采用天根公司DNA回收试剂和操作方法进行胶回收，-20°C保 存备用；泳道l:pNZ8148质粒;泳道Μ:11Λ ladder marker。
[0071 ]回收的目的基因和线性化质粒连接
[0072] 按照化KaRa Biotech的T4DNA连接酶试剂盒操作说明书对回收目的基因和质粒进 行连接。
[0073] 实施例2
[0074] 制备大肠杆菌MC1061感受态细胞
[00对 1、1 %接种MCI 061的LB液体培养基，于37 °C振荡过夜培养；
[0076] 2、取过夜培养菌液1 %接种于LB液体培养基，37 °C下振荡培养4h (此时细菌处于对 数生长期），冰上放置lOmin;
[0077] 3、4000g，4°C离屯、lOmin收集对数期细胞，弃上清，收集细菌细胞沉淀；
[0078] 4、用1/10于之前液体培养基体积的预冷的0.1M化Cl2菌体，冰上放置30min;
[00巧]5、4000旨，4。(：离屯、5111111弃上清，收集细菌细胞沉淀；
[0080] 6、用1/100于之前液体培养基体积的含0.1M化Cl2溶液重悬菌体；
[0081 ] 7、吸取20化L分装于离屯、管，-80°C保存。
[0082] 实施例3
[0083] 连接产物转化大肠杆菌MC1061感受态细胞
[0084] (1)取10化1 E.coli MCI061感受态细胞，加入10-5化1连接产物，轻柔混匀后，冰 浴30min;
[00化](2)将EP管放入预热至42 Γ的水浴中90S;
[0086] (3)快速将EP管转移到冰浴中，使细胞冷却l-2min;
[0087] (4)每管加90化1 LB培养液体基，37°C摇床溫和震荡培养1.化，使细菌复苏并充分 表达质粒编码的抗生素抗性标记基因；
[0088] (5)吸取10化1复苏培养菌液分别涂布于含lOyg/mL氯霉素的LB培养基平板上；
[0089] (6)将平板置于室溫至液体吸收，倒置平板，如图5所示，为本发明的37°C培养12- 24h直至出现单菌落图。
[0090] 实施例4
[0091 ]大肠杆菌MC1061重组质粒菌落PCR及双酶切鉴定
[0092] 挑取上步骤获得的单菌落进行PCR鉴定
[0093] 用于PCR扩增的引物
[0094] 正向引物:AAGTTGATGCAGCTACGC
[0095] 反向引物:TGTCCCATACCTGCCAAA
[0096] 扩增目的片段长度为14化P。
[0097] W单菌落为DNA模板的PCR反应体系如下： 正向引物（10 PM) 1 μL 技向引物（1_〇 μΜ) I化 dNTP Mixture 2 化
[009引 10XPCR 化ffer 2. 5 μL Taq DM聚合酶（月U/曲） 0. 2化 cidHsO 补足至巧化
[0099] 扩增程序：94°C，5min，然后 30 个循环（94°C，lmin;58°C，50S;72°C，lmin);72°C 延 伸lOmin。如图6所示，为本发明的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳图；泳道1:目的基因；泳 道M:500bp 1曰dder marker。
[0100] 重组质粒酶切鉴定：
[0101] 挑取经PCR验证正确的单菌落于LB液体培养基于37°C振荡培养好的菌液，如图7所 示，按照天根质粒提取试剂盒操作说明提取质粒后进行1%琼脂糖凝胶电泳图；泳道1:重 组质粒；泳道M:500bp ladder marker,如图8所示，为本发明的提取质粒采用TaKaRa Biotech限制性内切酶PstI和化nd虹操作说明双酶切质粒，产物经1 %琼脂糖凝胶电泳图； 泳道1:重组质粒;泳道M:500bp ladder marker。
[0102] 实施例5
[0103] 制备乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞
[0104] 1.乳酸乳球菌1 %接种于SGM17 (GM17含0.5M薦糖，2.5 %甘氨酸），培养至0D600> 0.5-0.8;
[0105] 2.5000g，4°C 离屯、lOmin 收集菌体；
[0106] 3.用冰预冷的含10%甘油的0.5M薦糖的溶液洗涂菌体2次；
[0107] 4.用1/100与之前培养基体积的含10%甘油的0.5M薦糖溶液重悬菌体，于-80°c保 存。
[0108] 乳酸乳球菌电转化：
[0109] 取化L经验证正确的重组质粒与40化感受态细胞混合后，转入预冷的电转杯中，冰 上放置lOmin。电转化条件：电压2000V，电容25μΡ，电阻200Ω。电击完毕后，立即往电转杯中 加入ImL GM17培养基(含20mM MgC12,2mM CaC12)后，30°C静置培养化，涂布于含扣g/ml氯 霉素的GM17平板上，如图9所示，为本发明的3(TC培养直至出现单菌落图。
[0110] 乳酸乳球菌NZ9000重组质粒菌落PCR及双酶切验证
[0111] 挑取上步骤获得的单菌落进行PC閲金证
[0112] 用于PCR扩增的引物
[0113] 正向引物:AAGTTGATGCAGCTACGC
[0114] 反向引物:TGTCCCATACCTGCCAAA
[0115] 扩增目的片段长度为14化P。
[0116] W单菌落为DNA模板的PCR反应体系如下： 正向引物（10 μ'Μ) 1化 反向引物（10 μΜ) 1化 dNTP Mixture 2 μL
[0117] 10XPCR Buffer 2. 5 化 Ta马鹏A聚合酶（S U/化） 化2化 cki也Ο 补足至巧化
[011 引扩增程序:94°(：，5111111，然后30个循环(941：，1111111;58°(：，505;721：，1111111);72°(：延 伸lOmin。如图10所示，为本发明的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳图；泳道1:目的基因；泳 道M:500bp 1曰dder marker。
[0119] 挑取经PCR验证正确的单菌落于GM17液体培养基于30°C振荡培养好的菌液，如图 11所示，按照天根质粒提取试剂盒操作说明提取质粒后进行1%琼脂糖凝胶电泳图；泳道1: 重组质粒；泳道M:lkb ladder marker;图12所示，为本发明的提取质粒采用TaKaRa Biotech限制性内切酶PstI和化nd虹操作说明双酶切质粒，产物经1 %琼脂糖凝胶电泳图； 泳道1:目的基因；泳道M:500bp ladder marker。
[0120] 实施例6
[0121] 乳酸乳球菌NZ9000重组菌的诱导表达
[0122] 重组菌4%接种于含扣g/ml氯霉素的GM17液体培养基待生长至0D600nm为0.5时加 入终浓度为lOng/ml nisin诱导培养地获得培养菌液，4000g离屯、lOmin取上清液，将获得的 上清液进行0.22WI1过滤获得诱导后的无菌上清液，用于下一步的抑菌实验。
[0123] 实施例7
[0124] 重组抗菌肤抑菌实验 [01巧]1.重组抗菌肤抑菌实验
[01%]本实验采用琼脂扩散法对重组表达的抗菌肤Enterocin P的抑菌活性进行检测。 将处于对数生长期的金黄色葡萄球菌.李斯特菌，沙口氏菌培养物各取10化L涂布与20ml固 体培养基中，再用8mm的打孔器打孔，加入20化1的待测样品上清液，W未经nisin诱导的含 有益生型抗菌肤化terocin P基因的乳酸乳球菌上清为对照，37°C培养观察。
[0127] 2.抑菌实验结果
[0128] 采用琼脂扩散法对重组抗菌肤的抑菌活性进行检测，经37Γ培养后，结果显示，如 图13所示，为本发明化terocin P对李斯特菌的抑菌效果图，其中1，2,3为实验组，对照为对 照组，如图14所示，为本发明化terocin P对金黄色葡萄球菌的抑菌效果图，其中1，2,3为实 验组，对照为对照组，如图15所示，为本发明化terocin P对沙口氏菌的抑菌效果图，其中1， 2，3为实验组，对照为对照组，本发明Enterocin P对Ξ种病原菌均具有抑菌性，对李斯特菌 抑制性最强。本发明的益生型抗菌肤化terocin P的基因工程菌可在饲料添加剂中应用。
[0129] W上显示和描述了本发明的基本原理.主要特征和本发明的优点。本行业的技术 人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明 要求保护范围由所附的权利要求书.说明书及其等效物界定。
【主权项】
1. 一种益生型抗菌肽Enterocin P基因，其特征在于具有SEQ ID No.l所示的核苷酸序 列。2. 权利要求1所述的益生型抗菌肽Enterocin P基因编码成熟抗菌肽Enterocin P具有 SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。3. 权利要求2所述的益生型抗菌肽Enterocin P的制备方法，其特征在于包括如下步 骤： (1) 人工合成核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的基因； (2) 构建能高效表达抗菌肽Enterocin P的pNZ8148_Enterocin P重组质粒； (3) 用所述pNZ8148-Enterocin P重组质粒转化宿主菌，构建乳酸乳球菌NZ900的基因 工程菌； (4) 利用所述基因工程菌乳酸乳球菌表达抗菌肽Enterocin P; (5) 对抗菌肽Enterocin P的抑菌活性进行检测。4. 根据权利要求3所述的益生型抗菌肽Enterocin P的制备方法，其特征在于:在步骤 (1) 中，人工合成两侧含pstI和HindIΠ 的酶切位点的EnterocinP基因具有SEQIDNo.3所 示的核苷酸序列。5. 根据权利要求3所述的益生型抗菌肽Enterocin P的制备方法，其特征在于:在步骤 (2) 中，将SEQ ID如.3所示的核苷酸序列连接与经限制性内切酶?5^1和把11(1111双酶切后线 性化的PNZ8148质粒连接获得pNZ8148-Enterocin P连接产物，将连接产物导入大肠杆菌 MC1061，获得含pNZ8148-Enterocin P重组质粒。6. 根据权利要求3所述的益生型抗菌肽Enterocin P的制备方法，其特征在于:在步骤 (3) 中，所述宿主菌为大肠杆菌MC1061; 将提取pNZ8148-Enterocin P重组质粒，经PCR和酶切鉴定正确的质粒采用电转化转入 乳酸乳球菌感受态细胞NZ9000中进行抗菌肽Enterocin P的诱导表达，电转化处理参数为 2.0kV、25yF、200Q、5ms，经氯霉素抗性筛选、PCR验证，酶切鉴定得到正确的含pNZ8148-Enterocin P重组质粒的乳酸乳球菌NZ900的基因工程菌。7. 根据权利要求3所述的益生型抗菌肽Enterocin P的制备方法，其特征在于:在步骤 (4) 中，将含pNZ8148-Enterocin P重组质粒的乳酸乳球菌NZ900的基因工程菌接种于含红 霉素的GM17液体培养基，30°C培养至0D600nm为0.5时，加入终浓度10ng/ml的nisin诱导表 达，培养4h后，4000g离心10min取上清液，将获得的上清液进行0.22μπι过滤获得诱导后的无 菌上清液，得到益生型抗菌肽Enterocin Ρ。8. 根据权利要求3所述的益生型抗菌肽Enterocin P的制备方法，其特征在于:在步骤 (5) 中，采用琼脂扩散法对抗菌肽Enterocin P的抑菌活性进行检测，经37°C培养后，抗菌肽 Enterocin P对金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌或沙门氏菌的抑菌活性进行检测。9. 权利要求2至8任一项所述的益生型抗菌肽Enterocin P在动物饲料中的应用。10. 根据权利要求9的应用，所述动物饲料为饲料添加剂。
【文档编号】A23K10/18GK106011153SQ201610490028
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月28日
【发明人】沈城
【申请人】江苏盐城源耀生物科技有限公司