一种致肝脓肿肺炎克雷伯菌分子检测试剂盒及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种致肝脓肿肺炎克雷伯菌分子检测试剂盒及其应用，本发明提供了致肝脓肿肺炎克雷伯菌基因特异性序列pagO和luxR，这两个基因特异性的存在于致肝脓肿肺炎克雷伯菌中，可作为肺炎克雷伯菌肝脓肿的诊断标记物。基于这两个基因设计的引物可用于制备致肝脓肿肺炎克雷伯菌分子检测试剂盒，可以用于肺炎克雷伯菌肝脓肿的诊断或其早期诊断，具有极大的商业化开发价值。
【专利说明】
-种致肝賊肿肺炎克雷伯菌分子检测试剂盒及其应用
技术领域
[0001] 本发明设及疾病诊断领域，具体设及一种致肝脈肿肺炎克雷伯菌分子检测试剂盒 及其应用。
【背景技术】
[0002] 肺炎克雷伯菌化.pneumoniae subsp.pneumonia)，属于肠杆菌科细菌。常寄生于 人体皮肤、鼻咽部和肠道等处，为条件致病菌。在临床上，可引起肺炎和尿路感染等 (Podschun R,Ullmann U.Klebsiella spp.as nosocomial pathogens :epidemiology, taxonomy , typing methods ,and pathogenicity factors.Clinical microbiology reviews. 1998; 11 (4): 589-603)。1980年到1990年，台湾地区Liu等人首次报道了7例由高毒 力肺炎克雷伯菌引起的严重肝脈肿伴眼内炎病例化iu Y，畑eng D，Lin C.Klebsiella pneumoniae liver abscess associated with septic endophthalmitis.Arch Intern Med 1986; 146:1913-16)。此后，肺炎克雷伯菌肝脈肿开始全球流行，特别是在亚洲。与普通 的肺炎克雷伯菌相比，致肝脈肿肺炎克雷伯菌侵袭力强、致死率高。除了导致肝脈肿，致肝 脈肿肺炎克雷伯菌还可W引起严重的脑膜炎、眼内炎和肺脈肿等(Siu LK，Yeh KM，Lin JC， Fung CP , Chang FY.Klebsiella pneumoniae liver abscess : a new invasive syn化ome.The Lancet Infectious diseases.2012;12(ll):881-7)。对于运样高毒力的肺 炎克雷伯菌感染，尽快诊断，及时治疗，对降低严重并发症的发生，改善预后具有重要的临 床价值。但是，目前没有一种快速简便的方法用于致肝脈肿肺炎克雷伯菌的检测鉴定。
[0003] 随着肺炎克雷伯菌肝脈肿病例报道的增加和致肝脈肿肺炎克雷伯菌研究的深入， 几个与致肝脈肿肺炎克雷伯菌相关的表型相继被提出，包括菌落高粘性表型和芙膜多糖血 清型K1型/K2型等。肺炎克雷伯菌可分泌多糖类物质于细胞表面，从而使菌落产生高粘性表 型，用W抵抗巨隧细胞和中性粒细胞的吞隧。但最近研究发现，只有50%不到的致肝脈肿肺 炎克雷伯菌表现为菌落高粘性（Qu TT，Zhou JC，Jiang Y，Shi KR，Li B,化en P，et al. Clinical and microbiological characteristics of Klebsiella pneumoniae liver abscess in Blast Qiina.BMC infectious diseases.2015;15:161)。芙膜多糖血清 抗原ΚΙ型和Κ2型是致肝脈肿肺炎克雷伯菌的主要血清型，但仍有20% W上的致肝脈肿肺炎 克雷伯菌不属于K1/K2血清型。此外，血清型K1型或K2型也被发现存在于普通肺炎克雷伯菌 (Sun Y,Wu Η,Shen D.Clinical and Molecular Analysis of Klebsiella pneumoniae Causing Liver Abscess in China. Journal of molecular microbiology and biotechnology. 2016; 26(4): 245-51)。因此，为了能够在分子水平更快速有效的鉴定致肝 脈肿肺炎克雷伯菌，我们通过对致肝脈肿肺炎克雷伯菌和普通肺炎克雷伯菌的基因组比 较分析，找到致肝脈肿肺炎克雷伯菌的特异性基因序列。利用运些特异性序列，通过简单的 PCR方法，可W快速地鉴定致肝脈肿肺炎克雷伯菌，为由该病原菌引起的感染的及时诊断和 治疗、改善患者预后提供基础。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供了致肝脈肿肺炎克雷伯菌基因特异性序列pagO,所述的基 因特异性序列pagO为SEQ ID N0.1所示。
[0005] 本发明的另一个目的在于提供了基于致肝脈肿肺炎克雷伯菌基因特异性序列 pagO 设计的引物，引物为:pagO_F: TGCTCTTGAAACTATCCCTCC，pagO_R: GGCAATAACTCCCGTCCA。
[0006] 本发明还有一个目的在于提供了致肝脈肿肺炎克雷伯菌基因特异性序列luxR，所 述的基因特异性序列111诚为56〇10^.2所示。
[0007] 本发明还有一个目的在于提供了基于致肝脈肿肺炎克雷伯菌基因特异性序列 luxR设计的引 物，引 物为：luxR_F:CTTTGCCGGCATGGAACATA，luxR_R: TGAGCCAAATGTATGCCAAGGA 〇
[0008] 本发明还有一个目的在于提供了致肝脈肿肺炎克雷伯菌基因特异性序列pagO或 基于pagO设计的引物在制备致肝脈肿肺炎克雷伯菌检测试剂盒中的应用，包括用于制备肺 炎克雷伯菌肝脈肿早期诊断试剂盒中的应用。
[0009] 本发明还有一个目的在于提供了致肝脈肿肺炎克雷伯菌基因特异性序列luxR或 基于luxR设计的引物在制备致肝脈肿肺炎克雷伯菌检测试剂盒中的应用，包括用于制备肺 炎克雷伯菌肝脈肿早期诊断试剂盒中的应用。
[0010] 本发明的最后一个目的在于提供了一种致肝脈肿肺炎克雷伯菌分子检测试剂盒， 所述的试剂盒包括引物：
[0011] pag0_F：TGCTCTTGAAACTATCCCTCC
[0012] pag0_R：GGCAATAACTCCCGTCCA
[0013] luxR_F：CTTTGCCGGCATGGAACATA
[0014] luxR_R:TGAGCCAAATGTATGCCAAGGA。
[001引为了实现上述目的，本发明采用W下技术措施：
[0016] 致肝脈肿肺炎克雷伯菌基因特异性序列pagO,所述的基因特异性序列pagO为SEQ ID NO. 1 所示。
[0017] 基于pagO序列设计的引物均为本发明的保护范围，优选的，pagO的引物为:pag0_ F: TGCTCTTGAAACTATCCCTCC;pag0_R:GGCAATAACTCCCGTCCA。
[001引致肝脈肿肺炎克雷伯菌基因特异性序列luxR，所述的基因特异性序列luxR为SEQ ID NO.2所示。
[0019]基于luxR序列设计的引物均为本发明的保护范围，优选的，luxR的引物为：luxR的 引物为：luxR_F: CTTTGCCGGCATGGAACATA; luxR_R: TGAGCCAAATGTATGCCAAGGA。
[0020] 本发明的保护范围还包括致肝脈肿肺炎克雷伯菌基因特异性序列pagO或基于 pagO设计的引物在制备致肝脈肿肺炎克雷伯菌检测试剂盒中的应用，包括制备肺炎克雷伯 菌肝脈肿早期诊断试剂盒。
[0021] 本发明的保护范围还包括致肝脈肿肺炎克雷伯菌基因特异性序列luxR或基于 luxR设计的引物在制备致肝脈肿肺炎克雷伯菌检测试剂盒中的应用，包括制备肺炎克雷伯 菌肝脈肿早期诊断试剂盒。
[0022] -种致肝脈肿肺炎克雷伯菌检测试剂盒，包括：
[0023] pagO_F：TGCTCTTGAAACTATCCCTCC
[0024] pagO_R：GGCAATAACTCCCGTCCA [00 巧]luxR_F:CTTTGCCGGCATGGAACATA
[0026] luxR_R：TGAGCCAAATGTATGCCAAGGA 〇
[0027] 与现有技术相比，本发明具有W下特点：
[00%] 1.目前尚无很好的用于致肝脈肿肺炎克雷伯菌鉴定的分子标志物，本发明通过测 序2株分离自中国大陆的致肝脈肿肺炎克雷伯菌和1株非致肝脈肿肺炎克雷伯菌，联合网上 公布的45株致肝脈肿肺炎克雷伯菌和103株非致肝脈肿肺炎克雷伯菌的全基因组数据，通 过比对分析，得到了用于在致肝脈肿肺炎克雷伯菌中高度特异的两段序列。
[0029] 2.本发明提供的2段致肝脈肿肺炎克雷伯菌特异的序列，可W作为制备致肝脈肿 肺炎克雷伯菌检测试剂盒
[0030] 3.本发明提供的2段致肝脈肿肺炎克雷伯菌特异的序列，可W作为分子标志物，用 于肺炎克雷伯菌肝脈肿的早期诊断。特别是在血液等其他体液来源标本的病原菌培养结果 出报告前，利用患者血液标本或肝脏脈腔脈液，采用快速的PCR方法检测致肝脈肿肺炎克雷 伯菌特异性基因 pagO或/和luxR的有无，结合患者临床表现和影像学资料，可从陕速对肺炎 克雷伯菌肝脈肿做出诊断，提高肺炎克雷伯菌肝脈肿的治疗成功率。
【具体实施方式】
[0031] 具体实施例对本发明作进一步说明。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本 领域的常规方案。
[0032] 实施例1:
[0033] 特异性序列的开发和验证：
[0034] 特异性基因序列的筛选过程结合第二代测序技术（Next-Generation Sequencing，NGS)，比较基因组学（Comparative Genomics)及生物信息学 (Bioinformatics)方法，并采用科学的统计学方法，对序列在多个肺炎克雷伯菌基因组中 分布的特异性进行检验，并且在分离的致肝脈肿肺炎克雷伯菌及非致肝脈肿肺炎克雷伯菌 中进行PC閲金证，W确定序列在致肝脈肿肺炎克雷伯菌中的特异性。具体实施过程如下：
[0035] 选取2株分离自中国大陆的致肝脈肿肺炎克雷伯菌和1株非致肝脈肿肺炎克雷伯 菌用于全基因组测序，测序结果用SPAdes(v3.5)软件进行拼接，用PATRIC在线分析平台进 行基因预测和功能注释。得到的测序结果联合美国国立生物信息中屯、(National Center for Bi otechnology Information,NCBI)公布的45株致肝脈肿肺炎克雷伯菌和103株非致 肝脈肿肺炎克雷伯菌的全基因组数据，通过比对分析，筛选只存在于致肝脈肿肺炎克雷伯 菌基因组中的基因，得到了两段在致肝脈肿肺炎克雷伯菌中高度特异的序列pag0(SEQ ID NO.1所示)和luxR(SEQ ID NO.2所示煙于运两段特异的序列设计引物，开发得到一套用于 鉴定致肝脈肿肺炎克雷伯菌的引物：
[0036] pagO的引物为：
[0037] pag0_F：TGCTCTTGAAACTATCCCTCC
[0038] pag0_R：GGCAATAACTCCCGTCCA
[0039] luxR的引物为：
[0040] luxR_F：CTTTGCCGGCATGGAACATA [0041 ] luxR_R：TGAGCCAAATGTATGCCAAGGA 〇
[0042] 实施例2:
[0043] 基因特异性验证：
[0044] pagO和luxR致肝脈肿肺炎克雷伯菌特异性基因在临床分离菌株中的验证，其具体 步骤是：
[0045] 1.选择临床分离的致肝脈肿和非致肝脈肿肺炎克雷伯菌菌株，用于检测pagO(SEQ ID N 0.1所示)和luxR(SEQ ID NO.2所示)在致肝脈肿肺炎克雷伯菌中的特异性。选择肝脈 肿患者脈腔中分离的40株肺炎克雷伯菌作为检测组(致肝脈肿组），另选取非肺炎克雷伯菌 肝脈肿患者中分离的肺炎克雷伯菌36株作为阴性对照组(非致肝脈肿组）。同时也选取了临 床上分离的常见其他致病菌(其他致病菌组）W进一步验证运些因子在致肝脈肿肺炎克雷 伯菌中的特异性:包括金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、尿肠球菌、粪肠球菌。
[0046] 2. 2个预测基因特异性引物的设计：针对pagO和luxR特异性序列设计的引物如 下：
[0047] pagO的引物为：
[0048] pag〇_F:TGCTCTTGAAACTATCCCTCC
[0049] pagO_R：GGCAATAACTCCCGTCCA
[0化0] luxR的引物为：
[0051 ] luxR_F：CTTTGCCGGCATGGAACATA [0化。luxR_R: TGAGCCAAATGTATGCCAAGGA
[0053] 3.细菌基因组的提取:将选取的76株肺炎克雷伯菌按照常规方式提取DM。
[0化4] 4.PCR检测pagO和luxR基因在Ξ组菌（致肝脈肿组、非致肝脈肿组和其他致病菌 组）中的存在情况:PCR反应采用Premix TaqVersion 2.0(化1(曰1?曰，(：〇(16:03314)试剂盒。根 据试剂盒说明，设置的PCR反应体系为25u 1，其中PremiX Taq 12.5u 1，基因组DNA模板1U1 (约lOOng)，上下游引物0.加 l(lOuM)，加去离子水10.5u巧h充至总体积25ul。
[0055] PCR 条件为：94°C 变性 5111111;95^3〇3,55^3〇3,72^3〇3,30个循环；72^7111111;反应 结束后各取5ul反应产物用于DNA的琼脂糖凝胶电泳，电泳胶用漠化乙锭化thi dium bromid)染色5min后，在美国伯乐(Bio-Rad)凝胶成像分析仪上拍照分析。
[0056] 结果见表1，如表1所示，pagO和luxR在致肝脈肿肺炎克雷伯菌中的检出阳性率分 别为100%，而在非致肝脈肿的肺炎克雷伯菌中全为2.78%。在其他致病菌组中，包括金黄 色葡萄球菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、尿肠球菌、粪肠球菌均为阴性。
[0057] W上结果可W证明，pagO或luxR在致肝脈肿肺炎克雷伯菌中具有很高的特异性， 可W分别或结合作为诊断肺炎克雷伯菌肝脈肿的分子标记物。
[005引表1 pagO和luxR在临床菌株中的PCR检测的结果
[0化9]
[0060] 实施例3:
[0061] pagO和luxR序列或基于其序列设计的引物在制备肺炎克雷伯菌肝脈肿诊断试剂 盒中的应用：
[0062] 本实验设计思路如下:将临床获得的血培养样品分为血培养阳性组和健康人阴性 组，其中血培养阳性组指所有血中培养出细菌的样品，不仅仅局限于血中培养出肺炎克雷 伯菌，包括培养出其他致病菌的样品。用PCR检测阳性血培养样品和阴性血培养样品中特异 性因子（即pagO和luxR)的存在情况，最后把PCR结果与患者最终临床诊断对应分析，W此来 判断本发明提供的方法对肺炎克雷伯菌肝脈肿的检出率。
[0063] 1.临床血培养样品的收集:共收集2组血培养样品，血培养阳性组69瓶、健康人血 培养阴性组40瓶。
[0064] 2. PCR检测pagO和luxR在血培养样品中的存在情况：
[0065] 2.1模板的制备:在无菌条件下，抽取3ml培养瓶中的血液，SOOOrpm，离屯、2min。弃 去上清，沉淀用200ul双蒸水吹打混匀成悬液。悬液在100°C煮沸lOmin，然后用1300化pm，离 屯、5min，上清液作为PCR检测的模板。
[0066] 2.2PCR检测pagO和luxR基因序列标记物及其组合在两组血培养样品中的存在情 况:PCR反应采用Premix TaqVersion2.0(TaKaRa，Code:D331A)试剂盒。根据试剂盒说明，设 置的PCR反应体系为25ul，其中Premix Taq 12.加1，基因组DNA模板化1，上下游引物0.加1 (10碰），加去离子水10.511巧|'充至总体积25111。？〇?反应条件为:94°(：变性5111111;951：303,55 °C 30s，72°C 30s，30个循环;72°C7min;反应结束后各取加1反应产物用于DNA的琼脂糖凝胶 电泳，电泳胶用漠化乙锭化thidium bromid)染色5min后，在美国伯乐(Bio-Rad)凝胶成像 分析仪上拍照分析。
[0067] pagO的引物为：
[006引 pag0_F:TGCTCTTGAAACTATCCCTCC
[0069] pag0_R：GGCAATAACTCCCGTCCA
[0070] luxR的引物为：
[0071] luxR_F：CTTTGCCGGCATGGAACATA [00。] luxR_R:TGAGCCAAATGTATGCCAAGGA
[0073]血培养阳性组中PCR检测结果及最终病人确诊结果见表2。规定，pagO和luxR中只 要一个扩增结果为阳性即该样本为阳性。健康人血培养阴性组无任何条带扩出，均为阴性， 因此结果不在表2和表3中示出。表2中"确诊结果"栏V'表示病人的最终诊断为肺炎克雷伯 菌肝脈肿，表示病人排除肺炎克雷伯菌肝脈肿诊断，为其他疾病。特异性因子栏（即"pa g炉、"luxR"、"pagO+luxR")中V'表示个标记物扩增结果为阳性，表示所检测的因子 全阴性。
[0074] 表2血培养阳性组病人最终确诊结果和PCR扩增结果
[0075]
[0076]
[0077]
[0078] 其中表2中，特异性因子在10号病例的血培养样品中PCR结果全为阳性，但一开始 10号病例在临床上并未诊断为肺炎克雷伯菌肝脈肿，
【申请人】怀疑因子出现了假阳性;但两 周后，随着病情进展，患者发现肝脈肿，确诊为肺炎克雷伯菌肝脈肿，从而排除了特异性因 子假阳性结果;运个病例也说明，特异性因子具有早期诊断肺炎克雷伯菌肝脈肿的作用。
[0079] 表3血培养阳性组中各标记物的阳性率和假阳性率
[0080]
[0081 ] pagO在肺炎克雷伯菌肝脈肿患者的血培养样品中PC郎日性率为97.37%，在非肺炎 克雷伯菌肝脈肿患者血培养样品中的阳性率仅为〇%，在血培养阴性组的阳性率为0%; luxR在肺炎克雷伯菌肝脈肿患者的血培养样品中PCR阳性率为92.11 %，在非肺炎克雷伯菌 肝脈肿患者血培养样品中的阳性率为0%，在血培养阴性组的阳性率为0% ;pag〇+luxR在肺 炎克雷伯菌肝脈肿患者的血培养样品中PCR阳性率为97.37%，在非肺炎克雷伯菌肝脈肿 患者血培养样品中的阳性率仅为〇%，在血培养阴性组的阳性率为0%。^上结果说明pagO 和luxR在肺炎克雷伯菌肝脈肿患者血培养阳性标本中具有很高的特异性，可W分别或结合 作为肺炎克雷伯菌肝脈肿快速诊断的分子标志物。
【主权项】
1. 一种致肝脓肿肺炎克雷伯菌基因特异性序列，所述的基因特异性序列pa go 为SEQ ID N0.1 所示。2. -种致肝脓肿肺炎克雷伯菌基因特异性序列2 t/zT?，所述的基因特异性序列2 t/zT? 为SEQ ID NO .2所示。3. 基于权利要求1所述特异性序列设计的引物。4. 根据权利要求3所述的引物，其特征在于:/7 a g· 0 _F: TGCTCTTGAAACTATCCCTCC， p a M _R:GGCAATAACTCCCGTCCA〇5. 基于权利要求2所述特异性序列设计的引物。6. 根据权利要求5所述的引物，其特征在于：2 u 7? _F : CTTTGCCGGCATGGAACATA， 2 uxT? _R:TGAGCCAAATGTATGCCAAGGA。7. 权利要求1所述的特异性序列或权利要求3所述的引物在制备致肝脓肿肺炎克雷伯 菌检测试剂盒中的应用。8. 权利要求2所述的特异性序列或权利要求5所述的引物在制备致肝脓肿肺炎克雷伯 菌检测试剂盒中的应用。9. 一种致肝脓肿肺炎克雷伯菌分子检测试剂盒，包括： p a gO_F：TGCTCTTGAAACTATCCCTCC p a gO_R：GGCAATAACTCCCGTCCA luxR _￥： CTTTGCCGGCATGGAACATA luxR _R：TGAGCCAAATGTATGCCAAGGA〇
【文档编号】C12Q1/04GK106011154SQ201610669762
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年8月15日
【发明人】张彦亮, 陶臻, 黄岩, 俞杨, 黄金伟, 江建平, 叶美萍
【申请人】南京市第医院, 南京市第一医院