一种细胞内支架结构及方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于TALE的新型细胞内支架结构及方法，它包括构建在质粒载体上的DNA支架序列和两段相邻的TALE?酶融合蛋白结合序列。利用TALE?DNA支架技术将细胞内异源代谢通路酶系共区域化，提高代谢速率，增加目的代谢物产量。
【专利说明】
-种细胞内支架结构及方法
技术领域
[0001] 本发明设及生物工程和生物制造领域，特别设及利用分子生物学技术和基因编辑 技术发明一种新型的细胞内支架结构，作为在工程微生物中提高目的产物产量的新方法。
【背景技术】
[0002] 真核细胞中天然存在的代谢过程可集中在由内膜系统构建成的各种亚细胞隔间 中进行，使酶促反应系统区域化。例如，Ξ簇酸循环和脂肪酸的β-氧化集中在线粒体中完 成，而蛋白质的加工和修饰在高尔基体中进行。酶的区域化有利于同一代谢途径中的酶互 相联系、密切配合，酶、辅酶和底物高度浓缩，从而提高酶促反应速率;同时能使不同代谢途 径隔离分布，使各代谢途径各行其职，互不干扰，整个细胞的代谢得W顺利进行;此外，某一 代谢途径产生的代谢产物在不同细胞器呈区域化分布，而形成局部高代谢物浓度，有利于 其对相关代谢途径的特异调节。特别当产物有毒、活性强、不稳定或是相对不溶时，酶促反 应区域化显得尤为重要。
[0003] 然而，目前的代谢工程和发酵工程等领域的研究和生产依赖于将其他物种(特别 是真核生物）的酶促代谢通路或代谢流转入工程微生物(如大肠杆菌、酵母等）中进行研究 和生产，而异源代谢通路中的酶系在微生物细胞内往往没有区域化的机制，特别是无内膜 系统的原核生物。因此，异源代谢通路在工程微生物中缺少区域化集成和调节机制运一情 况，往往导致目标产物产量低，生产效率低，且部分有毒中间产物甚至对宿主造成伤害。
[0004] 因此，近年来有许多研究者致力于在工程微生物中设计支架结构，搭载酶蛋白复 合物，使多酶体系集成化。DNA纳米技术能进行一维、二维甚至Ξ维的装配，形成支架网络结 构，迄今，蛋白-DNA装配体已被用于组织级联酶促反应，但其装配复杂，且依赖单链茎环结 构，其细胞内工程应用受限。蛋白支架在生命体中天然存在，如ΜΡΚ信号通路中的支架蛋白 KSR等，但其空间折叠复杂，原核体系异源表达常无效。RNA支架可W通过转录机制产生，天 然形成单链茎环结构，产生稳定的核酸-蛋白相互作用，RNA已被用于在细胞内建立高阶组 件，并有可能被用来在体内设计细胞内环境。2011年，Camile等人证明了一种通过合理设计 RNA组件，搭建RNA支架，将该支架配体蛋白与产氨相关酶融合，在大肠杆菌中提高了产氨效 率。此后，类似的方法被应用于十五烧和班巧酸的微生物制造。尽管RNA支架的应用日趋深 入，但因其配体蛋白的种类有限，且RNA相对DNA易降解，因此其可扩展性和稳定性一直是其 不可逾越的瓶颈。
[0005] 因此，能否设计出一类天然的、具有高度稳定性的、可扩展的和装配简单的细胞内 支架结构，从而应用于一系列蛋白酶的特异性结合和次序性排列，实现酶促反应体系的区 域化集成和高效率生产，成为生物工程和生物制造领域重点关注的课题。鉴于该支架系统 的设计思路是蛋白质与稳定支架系统的特异性有序结合，近年来日趋成熟的基因编辑技术 (例如ZFN、TALEN、CRISPER-CAS9)有望成为解决该问题的突破口。ZFN技术依赖于锋指蛋白 与Ξ联碱基的特异性识别，对DNA结合序列有较强的选择性，其作用逐渐被TALEN技术取代。 CRISPER-化S作为近年来最热口的新型基因编辑技术，主要依赖于目的DNA、引导RNA(gRNA) 和化s蛋白Ξ者的结合，实现对特定DNA序列的编辑。最近有研究将CRISPER-化s技术应用到 细胞内支架系统的构建，证明其能局部提高代谢反应中特定酶的浓度。然而，该方法仍然基 于引导RNA(gRNA)与配体蛋白的结合，属于RNA支架的范畴，其稳定性和扩展性存在局限。 TALEN技术基于TALE蛋白模块与DNA四种碱基直接的一一对应特异性结合，理论上非常适合 于构建细胞内多酶代谢通路的支架系统。
[0006] 转录激活子样效应因子（transcription activatorUke effector,TALE)最初是 在植物致病菌黄单胞杆菌属(Xanthomonas)中发现的。运类植物致病菌通过in型分泌系统 将TALE蛋白注射到植物细胞质中，然后TALE被转运到细胞核中，模拟真核细胞的转录因子 指导宿主细胞基因转录。TALE的结构包括几个重要功能部分:核定位信号和C-端的酸性激 活区，位于中间的结合DNA的串联重复区域。中间的DNA结合区域由一系列数目可变的可重 复单元构成，天然TALE的可重复单元数目一般为8.5~28.5个，常见的为17.5个。每个重复 单元包括33~35个氨基酸，特异识别一种碱基。在运33~35个氨基酸中，位于第12和第13位 的两个相邻的氨基酸决定了运个重复单元所特异识别的碱基，运两个氨基酸被称为重复可 变双残基(repeat variable di-residue,RVD)，运两个氨基酸决定了每个重复单元所识别 的DNA碱基，基于每个重复单元对应一个碱基，可将不同的重复单元串联起来，通常为14~ 20个重复单元，使之识别特定的DNA序列。
[0007] TALE识别DNA的机制在于不同的RVD能够相对特异地分别识别ATCG 4种碱基中的 一种通过对天然TALE的研究发现，有20多种不同的RVD，其中His/Asp化D)、Asn/Gly(NG)、 Asnzlle(NI)和Asn/Asn(順)4种RVD占总量的3/4根据生物信息学和实验研究，NI识别碱基 A;皿识别碱基C; NG识别碱基T;順识别碱基G/AdRVD的第1位氨基酸与蛋白质骨架结合，起到 稳定RVD的作用；第2位氨基酸则直接与DNA的碱基特异识别。此外，天然TALE祀DNA序列5 ' 端保守的跟随着一个T碱基，所W祀序列总是WT碱基开始，通过运些结构特点，可W根据实 验目的对DNA结合域的重复序列进行设计，得到特异识别任意序列祀位点的TALE。目前TALE 主要被用于祀向基因编辑的工具，比如knock-out、knock-in、碱基替换、点突变或者基因修 饰等，此外还被用于基因的表达调控，比如万能启动子。TALE技术现已经成功应用于细胞、 斑马鱼、果蛹、大鼠、小鼠及植物上，并且被研究者不断地尝试应用到其他更多的物种。
【发明内容】
[0008] 本发明要解决的技术问题是利用TALE-DNA支架技术将细胞内异源代谢通路酶系 共区域化，提高代谢速率，增加目的代谢物产量。
[0009] 为了解决上述技术问题，本发明建立了一种基于TALE-DNA支架技术的新型细胞内 异源代谢通路加速系统。该系统设计了 Ξ段TALE编码序列(分别由14个TALE模块组成，识别 14个碱基的DNA序列），分别与对应的巧光蛋白或酶蛋白融合，在大肠杆菌中表达。
[0010] 具体技术方案为：
[0011] 所述细胞内支架结构包括构建在质粒载体上的DNA支架序列（含串联重复的两段 相邻的TALE结合序列)和TALE-酶融合蛋白编码序列。
[0012]优选地，所述两段相邻的TALE-酶融合蛋白结合序列之间无间隔序列。
[OOU]优选地，所述两段相邻的TALE-酶融合蛋白结合序列之间有6bp的间隔序列。
[0014]优选地，所述两段相邻的TALE-酶融合蛋白结合序列之间有16bp的间隔序列。
[001引本发明所述TALE-酶融合蛋白编码序列中TALE蛋白编码序列的3'端(对应TALE蛋 白的C端)通过ACTAGA(SEQ ID NO. 22，对应化r-A巧氨基酸残基)与酶编码序列的5 '端(对应 酶蛋白的N端)融合。
[0016] 优选地，所述DNA支架序列如沈Q ID NO.7、沈Q ID NO.8或沈Q ID NO.9所示;所述 了八1^蛋白编码序列如56910^.1、56910^.3或沈910^.5所示。沈9^.1，569^.3 和沈QN0.5就是分别编码TALE1至TALE3的序列，在质粒上会与沈QIDN0.7、沈QIDN0.8 或SEQ ID NO.9所示的支架序列组合排列在一起，不过中间会加一些基本元件，比如Plac启 动子，核糖体结合位点，转录终止子W及融合的目的蛋白表达序列GFP1/GFP2或IAAM/IAAH。
[0017] 本发明还提供了一种PSB1C3改造质粒，所述PSB1C3改造质粒中含有权利要求6所 述的支架结构。
[0018] 所述PSB1C3改造质粒的构建方法包括如下步骤(所有克隆过程均在PSB1C3载体上 进行）：
[0019] (1)在TALE1序列下游插入GFP1或IAAM编码片段，在TALE2序列、TALE3序列下游插 入 GFP2 或 IAAH 片段，构成 TALE1-GFP1、TALE1-IAAM、TALE2-GFP2、TALE2-IAAH、TALE3-GFP2、 TALE3-IAAH片段；同时在Plac下游插入RBS片段，构成Plac-RBS片段所述TALE1序列即为SEQ ID NO. 1所示序列；所述TALE2序列即为沈Q ID NO.3所示序列；所述TALES序列即为沈Q ID NO. 5所示序列；
[0020] (2)在TALE 1-GFP1、TALE2-GFP2、TALE2-IAAH、TALE3-GFP2、TALE3-IAAH 下游插入 ter 片段，构成 TALEl-GFPl-ter、TALE2-GFP2-ter、TALE2-IAAH-ter、TALE3-GFP2-ter、 TALE3-IAAH-ter 片段；
[0021] (3)在TALEl-GFPl'TALEl-IAAM'TALEl-GFPl-ter'TALES-GFPS-ter'TALES-GFPS- ter 上游插入 Plac-RBS 片段 ，构成 Plac-RBS-TALEl-GFPl、Plac-RBS-TALEl-IAAM、Plac-RBS- TALEl-GFPl-ter、Plac-RBS-TALE2-GFP2-ter、Plac-RBS-TALE3-GFP2-ter 片段；
[0022] (4)在Plac-RBS-TALEl-GFPl下游插入RBS序列，随后在所得片段下游插入TALE2- GFP2-ter 或 TALE3-GFP2-ter 片段，构建至 PSB1C3 质粒骨架中得到 pTl-Gl/T2-G2、pTl-Gl/ T3-G2 质粒，再酶切得到 Plac-RBS-TALEl-GFPl-RBS-TALE2-GFP2-ter、Plac-RBS-TALEl- GFPl-RBS-TALE3-GFP2-ter 片段；在 Plac-RBS-TALEl-IAAM 下游插入 RBS 序列随后在所得片 段下游插入TALE2-IAAH-ter片段，构建至PSB1C3质粒骨架中得到PT1-IAAM/T2-IAAH质粒， 再酶切得到 Plac-RBS-TALEl-IAAM-RBS-TALE2-IAAH-ter 片段；
[0023] (5)在Scaffoldl上游分别插入 Plac-RBS-TALEl-GFPl-ter、Plac-RBS-TALE3- GFP2-ter、Plac-RBS-TALEl-GFPl-RBS-TALE3-GFP2-ter片段，构建至pSBlC3质粒骨架中得 至 IJpTl-GFPl-Sl、pT3-GFP2-Sl、pTl-Gl/T3-G2-Sl 质粒；
[0024] (6)在Scaffolds上游分别插入 Plac-RBS-TALE2-GFP2-ter、Plac-RBS-TALEl- GFPl-RBS-TALE2-GFP2-ter、Plac-RBS-TALEl-IAAM-RBS-TALE2-IAAH-ter 片段，构建至 PSB1C3 质粒骨架中得到 pT2-GFP2-S2、pTl-Gl/T2-G2-S2、pTl-IAAM/T2-IAAH-S2 质粒；
[00 巧](7)在Scaffolds上游分别插入 Plac-RBS-TALE2-GFP2-ter、Plac-RBS-TALEl- GFPl-RBS-TALE2-GFP2-ter、Plac-RBS-TALEl-IAAM-RBS-TALE2-IAAH-ter 片段，构建至 PSB1C3 质粒骨架中得到 pTl-Gl/T2-G2-S3、pTl-IAAM/T2-IAAH-S3 质粒；
[00%]所述 pTl-GFPl-Sl、pT3-GFP2-Sl、pTl-Gl/T3-G2-Sl、pT2-GFP2-S2、pTl-Gl/T2-G2- 82、口1'1-1441/了2-144护52、91'1-61/了2-62-53、91'1-1441/了2-144护53质粒即为9581〔3改造 质粒；91'1-6。？1-51、9了3-6。？2-51、91'1-61/了3-62-51、9了2-6。？2-52、91'1-61/了2-62-52、口1'1- IAAM/T2-IAAH-S2、pTl-Gl/T2-G2-S3、pTl-IAAM/T2-IAAH-S3质粒序列依次如沈Q ID NO. 10 至沈Q ID NO. 17所示。
[0027] 上述方法中，PSB1C3质粒载体、Plac启动子、GFP1、GFP2、IAAM+IAAH、终止子原始质 粒由iGEM 化undation DNA distribution 2015提供，TALE1、TALE2、TALE3质粒利用Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0构建、RBS序列由iGEM Regist巧提供，基因片段由 Invitroge?完成单链合成后在缓冲液中自95°C缓慢降溫至室溫得到。Scaffoldl、 Scaf fold2、Scaffolds由Vi ewSo lid公司全序列合成。实验中根据需要通过PCR对原始质粒 中的GFP巧日GFP2编码序列进行了改造;其中，在GFP1下游插入密码子序列W实现翻译终止、 在GFP2上游敲去一个碱基W避免移码突变。同时在IAAM+IAAH质粒中通过PCR克隆出IAAM、 IAAH基因。所有新构建和改造的基因片段均被亚克隆于PSB1C3载体并测序检测，选取测序 正确的分子进行酶切得到对应基因片段。
[0028] 下面对本发明作进一步说明：
[0029] TALE识别的DNA支架序列与TALE-酶表达序列共建在同一个PSB1C3质粒上，使该质 粒既能表达目的蛋白，又能承担支架功能，简化了该TALE-DNA支架系统。该系统具有如SEQ 10^.1所示(编码氨基酸序列如569 10^).2所示）、569 10^.3(编码氨基酸序列如569 ID NO.4所示)和SEQ ID NO.5所示(编码氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示）的TALE编码序列， 沈Q ID NO.7、SEQ ID NO.8和沈Q ID NO.9所示的DNA支架序列。
[0030] 本发明在大肠杆菌中将TALE-DNA支架系统应用于二酶反应体系，设计了两种不同 的DNA结合基序W及对应的TALE结合蛋白。结合序列选自斑马鱼CD154基因，W防与微生物 工程菌基因组同源。由于TALE目前应用于基因编辑领域时，通常设计为14~20个重复单元， 使之识别14~20bp的特定DNA序列，过短则可能导致识别特异性下降，过长则可能影响 TALE在细胞内的正常装配。本发明使用的TALE模块和识别碱基对数限定于14~20bp，由于 对特异性要求相对基因编辑技术应用时较低，因此选择14bp作测试。
[0031] 本发明根据TALE与DNA的结合原理，W及细胞内典型B型DNA的空间构象，设计并优 化了二酶代谢通路支架系统相邻DNA结合基序的间距W及朝向，从而保证酶系中相邻酶的 有序、紧密排列（参见图1)。本发明认为，对于相邻的TALE-酶融合蛋白有头头相邻(参见图 1A)和头尾相邻(参见图1B和1C)两种方式，其中头尾相邻有利于降低空间位阻，且更适合于 更多酶系成员的扩展。本发明同时利用头头相邻和头尾相邻两种方式验证TALE的共区域化 效果(害螺GFP实验），主要利用头尾相邻的方式验证TALE系统的酶促代谢加速能力（IAA合 成实验）。根据细胞内典型的B型DNA空间结构，即DNA沿中屯、轴每旋转一周有lObp(即每lObp 一个螺距）。为保证头尾相邻的TALE蛋白末端连接的酶系在空间上朝向同侧，从而进一步限 定酶系的活动区域，TALE识别的DNA支架序列中，相邻TALE识别序列之间的间隔序列需保证 间隔序列+识别序列总长度为lObp的整数倍（即1个螺距的整数倍）。由于本发明所使用的识 别碱基长度为14bp，因此间隔序列设计为6bp(相邻酶间隔1个螺距)和16bp(相邻酶间隔2个 螺距）。
[0032] 本发明还提供了将DNA支架W十次重复的方式直接整合在表达TALE-酶蛋白融合 基因的质粒骨架上的方法，W增加酶在DNA支架上的结合量。
[0033] 本发明利用割裂GFP技术验证TALE-DNA支架系统的对异源表达蛋白的共区域化能 力，利用植物生长素 IAA合成的二酶代谢通路验证TALE-DNA支架系统提高异源代谢通路速 率的能力。
[0034] 本发明设及的酶为在微生物细胞内能进行异源表达和正确折叠的次生代谢酶类， 酶系需要两个酶W上才能实现目的产物的合成。
【附图说明】
[0035] 图1二酶代谢通路支架系统的设计；（A)第一类支架用于尽可能拉近各酶之间的距 离，相邻两个结合基序间无插入序列；（B)第二类支架相邻结合基序间插入化P间隔序列，用 于避免位阻现象并确保酶的空间定位；（C)第Ξ类支架相邻结合基序间插入16bp间隔序列， 用于检测不同长度插入序列的效应；
[0036] 图2本发明构建的质粒示意图；（A)pSBlC3-Plac-RBS-TALEl-GFPl-Ter-Scaffoldl (pTl-GFPl-Sl)、pSBlC3-Plac-RBS-TALE2-GFP2-Ter-Scaffold2(pT2-GFP2-S2)及pSBlC3- P lac-RBS-TALE3-GFP2-Ter-Scaf f 01 d 1 (PT3-GFP2-S1)质粒；（8)9581〔3斗1日。-1^5-了41^1- GFPl-TALE3-GFP2-Ter-Scaffoldl(pTl-Gl/T3-G2-Sl)^pSBlC3-Plac-RBS-TALEl-GFPl- TALE2-GFP2-Ter-Scaffold2(pTl-Gl/T2-G2-S2)^pSBlC3-Plac-RBS-TALEl-GFPl-TALE2- GFP2-Ter-Scaffold3(pTl-Gl/T2-G2-S3)、无 SI 支架的 pSBlC3-Plac-RBS-TALEl-GFPl- TALE3-GFP2-Ter(pTl-Gl/T3-G2)和无 S2/S3 支架的 pSBlC3-Plac-RBS-TALEl-GFPl-TALE2- Scaffold2(pTl-IAAM/T2-IAAH-S2)^pSBlC3-Plac-RBS-TALEl-IAAM-TALE2-IAAH-Ter- Scaffold3(pTl-IAAM/T2-IAAH-S3)和无 S2 或 S3 支架的 PT1-IAAM/T2-IAAH 质粒；
[0037] 图3验证TALE-GFP融合蛋白与DNA支架的结合能力；（A)化IP-PCR实验引物设计及 对应PCR扩增区域示意图，P1/P2用于TALE1-GFP1的ChIP-PCR实验，P3/P4用于TALE2-GFP2和 TALE3-GFP2的ChIP-PCR实验；（B)大肠杆菌IPTG诱导表达和TALE-DNA结合溫度条件的优化； (C)TALE1-GFP1，TALE2-GFP2和TALE3-GFP2结合到相应支架上能力的检测。I吨ut表明了试 样中总的DNA量；
[003引图4通过割裂GFP实验验证TALE-DNA支架系统对异源蛋白的共区域化效果；（A)割 裂GFP和TALE-DNA支架系统的整合方式及结合模式示意图；（B)割裂GFP转入大肠杆菌后，经 IPTG诱导（或未经诱导）培养过夜测得的巧光强度（激发光波长：488nm;发射光波长： 538nm)，被ODsqq标准化后得到相对巧光强度值;将TALE1-GFP1/TALE3-GFP2对照组相关的巧 光强度设为1.0,其余组的巧光值按比例进行计算;实验中，Ξ组平行反应同时进行，数据由 至少Ξ组独立实验获得；图中**代表p<0.01; (C)RT-PCR检测GFP巧日GFP2在不同TALE-GFP支 架组中的表达情况;大肠杆菌16S核糖体RNA的cDNA序列用作内参；
[0039]图5验证TALE-DNA支架系统对提高IAA合成二酶代谢通路速率的能力；（A)IAA合成 通路示意图；（B)IAAM和IAAH与TALE-DNA支架系统的整合方式及结合模式示意图；（C)转化 相应质粒的大肠杆菌经IPTG诱导过夜后，通过夹屯、酶联免疫分析法化LISA)检测IAA产量。 经显色和终止反应后，通过分光光度法测量样品在450nm处的吸光度;样品中IAA浓度标准 曲线算出；将TALE1-IAAM/TALE2-IAAH无支架对照组IAA浓度设为1.0，其余组浓度值按比例 进行计算；实验中，Ξ组平行反应同时进行，数据由至少Ξ组独立实验获得；图中**代表八 ο. ο 1. (D)RT-PCR检ii IAAM和IAAH在不同TALE-IAA支架组表达情况;大肠杆菌16S核糖体RNA 的cDNA序列用作内参；
[0040] 图6 TALE-DNA支架系统提高多酶代谢通路速率的效果模拟;A组分析:尽管有无 TALE支架时反应底物的消耗速率差别不大，但是TALE支架可W加速中间产物向最终产物的 转化。显然，支架系统有利于提高反应速率;B组分析:本组TALE支架上的酶间距大于组1，但 是相似地，有无 TALE支架时反应底物的消耗速率差别不大;TALE支架仍可W加速中间产物 向最终产物的转化，但是支架系统对反应速率的提高效果有所下降；C组分析:本组TALE支 架上的酶间距进一步增大;不同的是，支架系统对反应速率的提高效果消失了;D组分析:当 多酶反应链加长时，有无 TALE支架时反应底物的消耗速率仍然差别不大;但是，支架系统对 反应速率的提高效果进一步加强；
[0041] 图7 TALE-DNA支架系统中酶不同间距（代谢反应链长度相同）对代谢速率提高的 影响模拟。
【具体实施方式】
[0042] 实施例1 TALE-DNA支架系统原核表达质粒的构建方法
[0043] 利用Golden Gate TALEN and TAL Effector Kit 2.0构建TALE表达序列，利用 DM合成的方法合成DNA支架序列。利用限制性内切酶Spe 1和Xba 1同尾酶的性质，在pSB 1C3 质粒上设计EcoRl、Xbal、Spel和Pstl的多克隆位点系统，基于标准的分子克隆方法根据对 应质粒构建需要插入Plac启动子、核糖体结合位点(RBS)、TALE、割裂GFP、色氨酸单加氧酶 (IAAM)、吗I噪乙酷胺水解酶（IAAH)、终止子(Ter)或DNA支架序列（Scaffold)等核酸元件。具 体构建如下质粒：构建pSBlC3-Plac-RBS-TALEl-GFPl-Ter-Scaffoldl(pTl-GFPl-Sl)、 pSBlC3-Plac-RBS-TALE2-GFP2-Ter-Scaffold2(pT2-GFP2-S2) W及9581〔3斗1日(3-1?85- TALE3-GFP2-Ter-Scaffoldl(pT3-GFP2-Sl)质粒用于检测 TALE-GFP 融合蛋白与 DNA 支架的 结合能力（参见图 2A)。构建 pSBlC3-Plac-RBS-TALEl-GFPl-TALE3-GFP2-Ter-Scaffoldl (pTl-Gl/T3-G2-Sl)^pSBlC3-Plac-RBS-TALEl-GFPl-TALE2-GFP2-Ter-Scaffold2(pTl-Gl/ T2-G2-S2)^pSBlC3-Plac-RBS-TALEl-GFPl-TALE2-GFP2-Ter-Scaffold3(pTl-Gl/T2-G2- S3)用于验证TALE-DNA支架系统对异源蛋白的共区域化效果，无 S1支架的pSB 1C3-P1 ac- RBS-TALEl-GFPl-TALE3-GFP2-Ter(pTl-Gl/T3-G2)和无 S2/S3 支架的 pSBlC3-Plac-RBS- TALEl-GFPl-TALE2-GFP2-Ter(pTl-Gl/T2-G2)质粒用于设置无支架对照组（参见图2B)。构 建pSBlC3-Plac-RBS-TALEl-IAAM-TALE2-IAAH-Ter-Scaffold2(pTl-IAAM/T2-IAAH-S2)和 pSBlC3-Plac-RBS-TALEl-IAAM-TALE2-IAAH-Ter-Scaffold3 (PT1-IAAM/T2-IAAH-S3)用于 验证TALE-DNA支架系统对提高二酶代谢通路速率的能力。无 S2或S3支架的PT1-IAAM/T2- IAAH质粒用于设置无支架对照组(参见图2C)。
[0044] 实施例2验证本发明提供的TALE-GFP融合蛋白与DNA支架的结合能力
[0045] 利用化IP-PCR检验TALE与异源表达蛋白（GFP1/2)融合蛋白是否有效结合到质粒 DNA支架。首先将构建的pSBlC3-l、pSBlC3-2W及PSB1C3-3质粒分别转入大肠杆菌化21 (DE3)菌株感受态，筛选阳性克隆，接种于5mL含氨节青霉素（5化g/ml)的LB液体培养基中， 置37 °C摇床，W 25化pm转速培养5小时，再将培养物W1:100比例加入含氨节青霉素（5化g/ ml)的LB液体培养基，置37°C摇床，W25化pm转速继续培养。测定细菌生长曲线，待OD600至 0.6~1.0时，加入IPTG，使终浓度为ImM，然后转入20°C、25°C或30°C培养箱，200巧m过夜。细 菌经溶菌酶和裂解液裂解后，根据碧云天提供的操作手册进行化IP实验。因结合质粒片段 较小，细菌裂解产物未经超声波处理而直接使用1 %的甲醒，并与GFP多克隆抗体进行免疫 共沉淀反应。产物利用上游引物P1 (ATGCGTAAAGGAGAAGA) (SEQ ID NO. 18)和下游引物P2 (TTATTGTTTGTCTGCCA) ( SEQ ID NO . 1 9 )扩增 GFP 1 片段；矛。用上游弓| 物 P 3 ^.21)扩增6。?2片段，片段大小分别为47化9和25化9(参见图34)。优化的？0?条件为:941： 预变性 4min;94°C 变性 40s，55°C 退火 lmin，72°C 延伸 3〇3,30个循环；72°(：延伸1〇111111。？〔尺产 物用1.2 %琼脂糖凝胶电泳鉴定。
[0046] 为了优化大肠杆菌IPTG诱导表达和TALE-DNA结合的溫度条件，本发明选用转化有 pTl-GFPl-Sl质粒的大肠杆菌进行不同IPTG诱导溫度下TALE-GFP与DNA支架结合实验。结果 显示20°C、25°C、30°C都适合TALE-GFP融合蛋白的表达及与相应DNA支架的结合，且25°C诱 导溫度组化IP-PCR扩增信号最强（参见图3B)。继续选择25°C的诱导溫度用于后续实验，如 图3C所示，pTl-GFPl-Sl组、PT2-GFP2-S2组和PT3-GFP2-S1组ChIP-PCR均扩增出明显的目的 条带，而无关IgG同型对照组或分离珠对照组均无相应条带。该结果表明转化有pTl-GFPl- Sl、pT2-GFP2-S2 或 PT3-GFP2-S1 质粒的大肠杆菌，其细胞内 TALE1-GFP1、TALE2-GFP2 和 TALE3-GFP2均能与对应的DNA支架结合。
[0047] 实施例3验证本发明提供的TALE-DNA支架系统对异源蛋白的共区域化效果
[0048] 利用割裂GFP实验验证本发明提供的TALE-DNA支架系统对异源蛋白的共区域化效 果。将pTl-Gl/T3-G2-Sl、pTl-Gl/T2-G2-S2、pTl-Gl/T2-G2-S3、pTl-Gl/T3-G2、pTl-Gl/T2- G2五组质粒分别转化大肠杆菌化21 (DE3)菌株感受态，阳性克隆扩大培养后用ImM IPTG于 25°C诱导过夜。未添加 IPTG组作为未诱导的对照组。随后收集细菌样品，用巧光酶标仪 Fluoroskan Ascent FlXThermo Scientific公司）测量各组的0〇6日日和巧光强度FI(激发光 波长：488nm;发射光波长：538nm)。如图4B所示，PT1-G1/T3-G2-S1组FI/OD600值显著高于无 支架 PT1-G1/T3-G2 对照组；PT1-G1/T2-G2-S2 和 PT1-G1/T2-G2-S3 组 FI/ODsoo值显著高于无 支架PT1-G1/T2-G2对照组。RT-PCR结果显示W上含支架组和不含支架组割裂GFP的表达量 是无显著差异的，因此绿色巧光的增强是TALE-DNA支架系统对割裂GFP共区域化的结果，而 不归因于割裂GFP的表达量差异（参见图4C)。运些结果表明证本发明提供的TALE-DNA支架 系统是一个可W实现TALE融合蛋白共区域化和有序化的有效装置。
[0049] 实施例4验证本发明提供的TALE-DNA支架系统对提高二酶代谢通路速率的能力
[0050] 为了研究不同TALE-DNA支架系统在代谢通路中的作用，本发明选用植物生长素吗I 噪乙酸IAA的二酶体系合成通路进行验证。将pTl-IAAM/T2-IAAH-S2、pTl-IAAM/T2-IAAH- S3、pTl-IAAM/T2-IAAHΞ 组质粒分别转化大肠杆菌 BL2UDE3) 菌株感受态 ，阳性克隆扩大培 养后用ImM IPTG于25°C诱导过夜。未添加 IPTG组作为未诱导的对照组。随后收集细菌样品， 根据酶联生物公司提供的试剂盒W及方法进行夹屯、法酶联免疫分析。结果显示含支架的 PT1-IAAM/T2-IAAH-S2和PT1-IAAM/T2-IAAH-S3组IAA的产量显著高于无支架对照组，其中 PT1-IAAM/T2-IAAH-S2组较无支架组单位时间内产量提高3.2倍，PT1-IAAM/T2-IAAH-S3组 无支架组单位时间内产量提高2.5倍(参见图5B)。RT-PCR结果显示W上含支架组和不含支 架组IAAM和IAAH的表达量是无显著差异的，因此IAA生产速率的增强是TALE-DNA支架系统 对ΙΑΑΜ和ΙΑΑΗ共区域化的结果，而不归因于表达量差异(参见图5C)。^上结果证明了本发 明提供的TALE-DNA支架系统可W显著提高二酶代谢通路的代谢速率。此外，随着相邻酶在 DNA支架上的间距增加，代谢速率提高的程度降低。
[0051] 实施例5利用数学模型验证本发明提供的TALE-DNA支架系统可W提高细胞内多 酶代谢通路的反应效率
[0052] 利用MATLAB将随机模拟方法用于计算和评估有TALE支架和无 TALE支架的反应系 统，W概率分布的形式求解两类系统的性能参数。模型运算的参数设置如图6所示。模型忽 略不与多酶促反应直接相关的细胞结构，只考虑细胞、反应物、支架和酶(包括游离和固定 的酶)的行为，在TALE-DNA支架体系中，酶固定在支架上。模拟在二维平面上进行，因此用圆 形来描述细胞、反应物、支架和酶用直线段来描述支架(参见图7)。该模型在计算时采用时 间驱动的方式，假设在相同的足够小时间间隔内，给出分子的运动方向和速度大小V便可 确定其下一个状态的位置，其中假设运动方向和速度大小V满足均匀分布。此外，对于相互 作用的假设是所有分子只能在细胞内运动，且忽略分子间的非接触力。模拟过程中，反应底 物和中间产物均可与酶及支架发生重叠，运在一定程度上模拟了酶与反应物结合的行为。 假设只要反应物与酶满足特异性条件，则两者的碰撞(重叠）均是有效的，且反应可W在碰 撞的瞬间完成。
[0053] 模拟实验显示，由于支架对酶的共聚作用，比起无支架系统，支架系统倾向于花费 更少的时间来完成中间产物进一步与其对应酶的碰撞过程。因此支架系统可W提高多酶促 反应的效率。然而，支架上的酶间距的扩大使得支架对酶的共聚效果渐渐不明显，导致其加 速效果逐渐消失。因此该模型的结果证明TALE-DNA支架系统可W提高多酶代谢通路的代谢 效率，且随着对酶促反应链的加长，支架系统对速率的提高效果加强。然而，随着支架上酶 的间距扩大，支架对于代谢效率的提高效果减弱。
【主权项】
1. 一种细胞内支架结构，其特征在于，所述支架结构包括构建在质粒载体上的DNA支架 序列和TALE-酶融合蛋白编码序列。2. 如权利要求1所述的支架结构，其特征在于，所述两段相邻的TALE-酶融合蛋白结合 序列之间无间隔序列。3. 如权利要求1所述的支架结构，其特征在于，所述两段相邻的TALE-酶融合蛋白结合 序列之间有6bp的间隔序列。4. 如权利要求1所述的支架结构，其特征在于，所述两段相邻的TALE-酶融合蛋白结合 序列之间有16bp的间隔序列。5. 如权利要求1至4任一项所述的支架结构，其特征在于，所述DNA支架序列如SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8或SEQ ID NO. 9所示；所述TALE-酶融合蛋白编码序列如SEQ ID NO. 1、 SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.5所示。6. -种TALE-酶融合蛋白编码序列，其特征在于，所述TALE-酶融合蛋白编码序列中， TALE蛋白编码序列的3 '端通过ACTAGA与酶编码序列的5 '端融合。7. 如权利要求6所述的TALE-酶融合蛋白编码序列，其特征在于，所述TALE-酶融合蛋白 编码序列如SEQIDN0.1、SEQIDN0.3或SEQIDN0.5所示。8. -种pSBlC3改造质粒，其特征在于，所述pSBlC3改造质粒中含有权利要求6所述的支 架结构。9. 如权利要求7所述质粒的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： (1) 在TALE1序列下游插入GFP1或IAAM编码片段，在TALE2序列、TALE3序列下游插入 GFP2 或 IAAH 片段，构成 TALE1-GFP1、TALE1-IAAM、TALE2-GFP2、TALE2-IAAH、TALE3-GFP2、 TALE3-IAAH片段；同时在Plac下游插入RBS片段，构成Plac-RBS片段所述TALE1序列即为SEQ ID NO. 1所示序列；所述TALE2序列即为SEQ ID NO.3所示序列；所述TALE3序列即为SEQ ID NO. 5所示序列； (2) 在TALE1-GFP1、TALE2-GFP2、TALE2-IAAH、TALE3-GFP2、TALE3-IAAH 下游插入 ter 片 段，构成 TALEl-GFPl-terJALES-GFPS-terJALES-IAAH-terJALES-GFPS-terJALES-iAAH-ter 片段； (3) 在TALE1-GFP1、TALE1-1AAM、TALE1-GFP1-ter、TALE2-GFP2-1er、TALE3-GFP2-1er上 游插入 Plac-RBS 片段 TALEl-GFPl-ter、Plac-RBS-TALE2-GFP2-ter、Plac-RBS-TALE3-GFP2-ter 片段； (4) 在Plac-RBS-TALEl-GFPl下游插入RBS序列，随后在所得片段下游插入TALE2-GFP2-ter 或 TALE3-GFP2-ter 片段，构建至 pSBlC3 质粒骨架中得到 pTl-Gl/T2-G2、pTl-Gl/T3-G2 质 粒，再酶切得到 Plac-RBS-TALEl-GFPl-RBS-TALE2-GFP2-ter、Plac-RBS-TALEl-GFPl-RBS-TALE3-GFP2-ter片段;在Plac-RBS-TALEl-IAAM下游插入RBS序列随后在所得片段下游插入 TALE2-IAAH-ter片段，构建至pSBlC3质粒骨架中得到ρΤ1-ΙΑΑΜ/Τ2-ΙΑΑΗ质粒，再酶切得到 Plac-RBS-TALEl-IAAM-RBS-TALE2-IAAH-ter 片段； (5) 在Scaffoldl上游分别插入 Plac-RBS-TALEl-GFPl-ter、Plac-RBS-TALE3-GFP2-ter、Plac-RBS-TALEl-GFPl-RBS-TALE3-GFP2-ter片段，构建至pSBlC3质粒骨架中得到pTl-GFP1-S1、pT3-GFP2-Sl、pTl-Gl/T3-G2-Sl 质粒； (6) 在 Scaffold2 上游分别插入 Plac-RBS-TALE2-GFP2-ter、Plac-RBS-TALEl-GFPl- RBS-TALE2-GFP2-ter、Plac-RBS-TALEl-IAAM-RBS-TALE2-IAAH-ter 片段，构建至 pSBlC3 质 粒骨架中得到 pT2-GFP2-S2、pTl-Gl/T2-G2-S2、pTl-IAAM/T2-IAAH-S2 质粒； (7)在Scaffold3 上游分别插入 Plac-RBS-TALE2-GFP2-ter、Plac-RBS-TALEl-GFPl-RBS-TALE2-GFP2-ter、Plac-RBS-TALEl-IAAM-RBS-TALE2-IAAH-ter片段，构建至pSBlC3质 粒骨架中得到 pTl-Gl/T2-G2-S3、pTl-IAAM/T2-IAAH-S3 质粒； 所述 pH-GFPl-Sl、pT3-GFP2-Sl、pH-Gl/T3-G2-Sl、pT2-GFP2-S2、pIl-Gl/T2-G2-S2、 pTl-IAAM/T2-IAAH-S2、pTl-Gl/T2-G2-S3、pTl-IAAM/T2-IAAH-S3 质粒即为 pSBlC3 改造质 S;pn-GFPl-Sl、pT3-GFP2-Sl、pH-Gl/T3-G2-Sl、pT2-GFP2-S2、pTl-Gl/T2-G2-S2、pTl-IAAM/T2-IAAH-S2、pTl-Gl/T2-G2-S3、pTl-IAAM/T2-IAAH-S3质粒序列依次如SEQ ID NO. 10 至SEQ ID NO. 17所示。
【文档编号】C12N15/55GK106011160SQ201610380526
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月1日
【发明人】朱律韵, 朱凌云, 邱鑫源, 吴小敏, 章媛, 范冬雨, 朱楚姝, 张东裔
【申请人】中国人民解放军国防科学技术大学