提高铜绿假单胞菌杂交效率的溶液及绿假单胞菌杂交方法

文档序号:10645195阅读:572来源:国知局
提高铜绿假单胞菌杂交效率的溶液及绿假单胞菌杂交方法
【专利摘要】本发明公开了提高铜绿假单胞菌杂交效率的溶液,其特征在于:选择浓度范围10%甘油+0.05M CaCl2、15%甘油+0.1M CaCl2作为提高杂交效率的溶液,15%甘油+0.1M CaCl2溶液为宜。本发明通过生理条件的不同改变外源基因进入受体细胞的效率。在实验室条件要想获得高效率的重组体并不是非常的容易,在此基础上进行了杂交溶液的配方以及配比的确定。通过使用该溶液可以提高细菌杂交过程中的效率,使我们可以获得更多的重组体。
【专利说明】
提高铜绿假单胞菌杂交效率的溶液及绿假单胞菌杂交方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物学应用技术领域,具体涉及提高铜绿假单胞菌杂交效率的溶液及绿假单胞菌杂交方法。
【背景技术】
[0002]微生物功能基因的研究过程中需要构建不同基因的敲除突变体,在单个基因突变的情况下对比野生菌株来研究某个基因的功能。铜绿假单胞菌是临床中比较常见的一种致病菌,在临床中主要感染免疫力比较低下的人群,因此,对于铜绿假单胞菌的相关研究非常的多。在研究铜绿假单胞菌的过程中一个主要的方法就是构建不同基因的敲除突变体,而现有的方法基本都是通过基因重组的过程实现的,而要发生基因重组,必须要将目的基因转入受体菌中。转入目的基因有多种方式,其中一种就是利用三亲本(或者两亲本)杂交的方法进行。在进行杂交的过程基本相同,但是其效率并不能保证非常容易的获得重组体。因此,能够开发出新的提高杂交效率的方法或者溶剂,对于重组体的获得以及铜绿假单胞菌的基因功能的研究非常的重要。

【发明内容】

[0003]针对以上问题,本发明提供了提高铜绿假单胞菌杂交效率的溶液及铜绿假单胞菌杂交方法,可以有效提高【背景技术】中的效率。
[0004]为了实现上述目的,本发明采用的技术方案如下:提高铜绿假单胞菌杂交效率的溶液,选择浓度范围10%甘油+0.05M CaCl2?15%甘油+0.1M CaCl2作为提高杂交效率的溶液,15%甘油+0.1M CaCl2溶液为宜。
[0005]铜绿假单胞菌杂交方法,包括以下步骤:步骤一,菌种接种并培养;步骤二,离心收集菌体;步骤三,菌种混合混匀;步骤四,阴性对照及培养;步骤五,混合菌液涂布及培养;步骤六,挑取单克隆划线至PIA固体平板上;步骤七,检验;
[0006]在所述的步骤一中,将供体菌(含有重组质粒的1B细胞)、受体菌(野生型PA01)W及辅助菌(含PRK2013质粒的大肠杆菌)接种至含合适抗生素的液体LB中,200rpm 37°C培养12h;
[0007]在所述的步骤二中,培养后取ImL离心(2000g离心5分钟)收集菌体,先用ImLl5%甘油+0.1M CaCl2缓冲液洗细胞一遍,再用适量的15%甘油+0.1M CaCl2缓冲液重悬使其细胞终浓度为500yg湿细胞/mL;
[0008]在所述的步骤三中,将步骤一中的供体菌、受体菌和辅助菌按照2:1:2的比例将三种菌混匀,分别吸取20μ1、10μ1和20μ1总体积为50μ1,吹吸混匀;
[0009]在所述的步骤四中,吸取50μ1混合菌液点至LB固体平板上同时点相同体积的铜绿假单胞菌作为阴性对照,37°C过夜培养;
[0010]在所述的步骤五中,将菌斑刮至ImL 15%甘油+0.1M CaCl2缓冲液或者LB中重悬,取适量混合菌液涂布至假单胞菌分离琼脂固体平板上,37°C过夜培养;
[0011]在所述的步骤六中,挑取单克隆划线至PIA固体平板上,带有sacB蔗糖致死基因的没有发生重组的单克隆无法生长;
[0012]在所述的步骤七中,挑取单克隆进行PCR验证是否发生重组。
[0013]作为本发明的进一步技术方案:在所述的步骤五中,假单胞菌分离琼脂固体平板上含有对应的抗生素作为筛选标记。
[0014]作为本发明的进一步技术方案:在所述的步骤六中,PIA固体平板为含有10%蔗糖溶液的固体平板。
[0015]本发明的有益效果:
[0016]本发明通过生理条件的不同改变外源基因进入受体细胞的效率。在实验室条件要想获得高效率的重组体并不是非常的容易,在此基础上进行了杂交溶液的配方以及配比的确定。通过使用该溶液可以提高细菌杂交过程中的效率,使我们可以获得更多的重组体。
【具体实施方式】
[0017]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
实施例:
[0018]实施例:
[0019]提高铜绿假单胞菌杂交效率的溶液,选择浓度范围10%甘油+0.05M CaCl2?15%甘油+0.1M CaCl2作为提高杂交效率的溶液,15%甘油+0.1MCaCl2溶液为宜。
[0020]铜绿假单胞菌杂交方法,包括以下步骤:步骤一,菌种接种并培养;步骤二,离心收集菌体;步骤三,菌种混合混匀;步骤四,阴性对照及培养;步骤五,混合菌液涂布及培养;步骤六,挑取单克隆划线至PIA固体平板上;步骤七,检验;
[0021]在所述的步骤一中,将供体菌(含有rpoS基因连入pEX18Ap质粒的1B细胞)、受体菌(野生型PAOl)以及辅助菌(含pRK2013质粒的大肠杆菌)接种至含合适抗生素的液体LB中,200rpm 37°(:培养1211;
[0022]在所述的步骤二中,培养后取ImL离心(2000g离心5分钟)收集菌体,先用ImL15%甘油+0.1M CaCl2缓冲液冲洗一遍,再用适量的15%甘油+0.1M CaCl2缓冲液重悬使细胞终浓度为500yg湿细胞/mL;
[0023]在所述的步骤三中,将步骤一中的供体菌、受体菌和辅助菌按照2:1:2的比例将三种菌混匀,分别吸取20μ1、10μ1和20μ1总体积为50μ1,吹吸混匀;
[0024]在所述的步骤四中,吸取50μ1混合菌液点至LB固体平板上同时点相同体积的铜绿假单胞菌作为阴性对照,37°C过夜培养;
[0025]在所述的步骤五中,将菌斑刮至ImL 15%甘油+0.1M CaCl2缓冲液或者LB中重悬,取适量混合菌液涂布至假单胞菌分离琼脂固体平板上,37 °C过夜培养;
[0026]在所述的步骤六中,挑取单克隆划线至PIA固体平板上(含有10%蔗糖),带有sacB蔗糖致死基因的没有发生重组的单克隆无法生长;
[0027]在所述的步骤七中,挑取单克隆进行PCR验证是否发生重组。
[0028]作为本发明的进一步技术方案:在所述的步骤五中,假单胞菌分离琼脂固体平板上含有对应的抗生素作为筛选标记。
[0029]作为本发明的进一步技术方案:在所述的步骤六中,PIA固体平板为含有10%蔗糖溶液的固体平板。
[0030]对于本领域技术人员而言,显然本发明不限于上述示范性实施例的细节,而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下,能够以其他的具体形式实现本发明。因此,无论从哪一点来看,均应将实施例看作是示范性的,而且是非限制性的,本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定,因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
【主权项】
1.提高铜绿假单胞菌杂交效率的溶液,其特征在于:选择浓度范围10%甘油+0.05MCaCl2?15%甘油+0.1M CaCl2作为提高杂交效率的溶液,15%甘油+0.1M CaCl2溶液为宜。2.铜绿假单胞菌杂交方法,包括以下步骤:步骤一,菌种接种并培养;步骤二,离心收集菌体;步骤三,菌种混合混匀;步骤四,阴性对照及培养;步骤五,混合菌液涂布及培养;步骤六,挑取单克隆划线至PIA固体平板上;步骤七,检验;其特征在于: 在所述的步骤一中,将供体菌、受体菌以及辅助菌接种至含合适抗生素的液体LB中,200rpm 37°(:培养1211; 在所述的步骤二中,培养后取ImL离心收集菌体,先用ImL 15%甘油+0.1M CaCl2缓冲液洗细胞一遍,再用适量的15 %甘油+0.1M CaCl2缓冲液重悬使其细胞终浓度为500yg湿细胞/mL; 在所述的步骤三中,将步骤一中的供体菌、受体菌和辅助菌按照2:1:2的比例将三种菌混匀,分别吸取20μ1、10μ1和20μ1总体积为50μ1,吹吸混匀; 在所述的步骤五中,将菌斑刮至ImL 15%甘油+0.1M CaCl2缓冲液或者LB中重悬,取适量混合菌液涂布至假单胞菌分离琼脂固体平板上,37°C过夜培养; 在所述的步骤六中,挑取单克隆划线至PIA固体平板上,带有sacB蔗糖致死基因的没有发生重组的单克隆无法生长; 在所述的步骤七中,挑取单克隆进行PCR验证是否发生重组。3.根据权利要求2所述的铜绿假单胞菌杂交方法,其特征在于:在所述的步骤五中,假单胞菌分离琼脂固体平板上含有对应的抗生素作为筛选标记。4.根据权利要求2所述的铜绿假单胞菌杂交方法,其特征在于:在所述的步骤六中,PIA固体平板为含有1 %蔗糖溶液的固体平板。
【文档编号】C12N15/78GK106011166SQ201610321545
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月16日
【发明人】陈林, 樊泽正, 王潇倩, 郭子晟
【申请人】西北大学
网友询问留言 已有0条留言
  • 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞!
1