一种通用型慢病毒载体及其制备方法

文档序号:10645203阅读:877来源:国知局
一种通用型慢病毒载体及其制备方法
【专利摘要】一种通用型慢病毒载体及其制备方法,涉及一种慢病毒载体及其其制备方法。本发明是要解决目前CAR?T制备中过程中载体构建步骤烦琐、耗时过长,慢病毒载体无法通用,成本高的问题。该慢病毒载体以pCDH?CMV?MCS?EF1?Puro质粒为骨架,向质粒骨架的多克隆位点MCS处插入以下元件:CD8α Leader DNA序列、CD8α铰链区、CD28跨膜区?胞内区、CD137胞内区和CD3ζ。方法:一、引物设计;二、外周血单个核细胞的获得、激活;三、mRNA的提取及RT反应;四、重组质粒制备;五、合成单链CD8α Leader DNA序列;六、将线性载体、目的基因片段及CD8α Leader片段连接,即得到通用型慢病毒载体。本发明用于制备慢病毒载体。
【专利说明】
-种通用型慢病毒载体及其制备方法
技术领域
[0001 ]本发明设及一种慢病毒载体及其其制备方法。
【背景技术】
[0002] T淋己细胞是肿瘤细胞的天敌,在肿瘤免疫应答中起主要作用,对肿瘤细胞有极强 的杀伤作用。但是,使用内源性T细胞进行肿瘤免疫治疗时,祀抗原需经过加工处理后才能 和祀细胞表面的主要组织相容性复合物(main histocompatibility complex,MHC)作用, 也就是存在我们常说的"ΜΗ邱良制性"。然而,肿瘤免疫编辑的过程会使MHC在肿瘤细胞表面 表达下降,破坏抗原加工过程,降低肤段免疫原性。运样长期形成的免疫逃逸机制,能使肿 瘤细胞成功躲避T细胞攻击,肿瘤快速增殖。
[0003] 过继性细胞免疫治疗(adoptive cellular immunotherapy, ACI)是目前较为有效 的恶性肿瘤的治疗方法之一。随着技术的日趋成熟,已在多种实体瘤和血液肿瘤的临床治 疗中取得较好疗效。其中,嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)T细胞技术是 近年来发展非常迅速的一种细胞治疗技术。通过基因改造技术,效应Τ细胞的祀向性、杀伤 活性和持久性均较常规应用的免疫细胞高,并可克服肿瘤局部免疫抑制微环境和打破宿主 免疫耐受状态。
[0004] 目前,大多数嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)由胞外抗原结合 区(由来源于单克隆抗体的轻链(VL)和重链(VH)组成,中间由带初性的较链区连接形成单 链抗体(single chain fragment variable,scFv)、跨膜区域和胞内信号转导区组成。CAR 的信号域已从第一代的单一信号分子发展为包含CD28、4-1BB等共刺激分子的多信号结构 域(第二、Ξ代),其可W提高T细胞的细胞毒性、增殖活性,维持T细胞应答,延长T细胞存活 时间等;双特异性嵌合抗原受体(tan-CAR)有两种抗原识别区,它们连接在同一个信号转导 受体上,可W同时作用于肿瘤微环境中的肿瘤细胞和元件,从而增强T细胞活性,增加亲和 力。
[0005] 慢病毒化entivirus)载体是WHIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的 基因治疗载体。它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力,可用于感染难转染的细胞,如 原代细胞、神经元细胞、干细胞、不分化细胞、屯、肌细胞、血液细胞等,且可装载高达化bDNA 片段,使目的基因进入到宿主细胞之后,经过反转录,整合到基因组,形成稳定遗传物质,使 得目的基因在细胞中可稳定长期表达。病毒载体颗粒通过包装元件和含病毒基因组质粒共 转染包装细胞系,目前比较广泛采用的第Ξ代包装系统--四质粒系统只含有HIV-1共9个基 因中的3个,即gag、pol、rev。由于HIV-1基因组成分中60%被去除,因此父代病毒无法复制, 是目前重组系数最低的一个慢病毒包装系统,至今未见重组报道。
[0006] 目前,CAR-T研究及应用中广泛使用慢病毒作为CAR基因载体,大多数嵌合抗原受 体(CAR)由胞外抗原结合区(scFv)、跨膜区域和胞内信号转导区组成,也有一些研究将胞外 抗原结合区设计为具有双特异性的单链双特异性抗体(scBsAb),且胞外抗原结合区前需加 一条具有分泌功能的信号序列,W保证CAR基因所对应的蛋白序列能够具有分泌功能,由于 不同种类的癌症具有不同肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen,ΤΑΑ)和肿瘤特异性 抗原(tumor specific antigenJSA),所W每种CAR需加入不同的抗体序列,每种肿瘤都进 行CAR基因整体克隆成本相对较高,且载体构建时间会相对延长,因此构建出通用型载体是 非常必要的。

【发明内容】

[0007]本发明是要解决目前CAR-T制备中过程中载体构建步骤烦琐、耗时过长,慢病毒载 体无法通用,成本高的问题,提供一种通用型慢病毒载体、其制备方法及应用。
[000引本发明通用型慢病毒载体WpCDH-CMV-MCS-EFl-Puro质粒为骨架,向质粒骨架的 多克隆位点MCS处插入W下元件:CD8化eader DNA序列、CD8a较链区、CD28跨膜区-胞内区、 CD137胞内区和CD3C;其中CDSaLeader DNA序列如序列表中SEQ ID N0:1所示,CD8a较链区 如序列表中569 10^:2所示,〔028跨膜区-胞内区如序列表中569 10^):3所示,〔0137胞 内区如序列表中SEQ ID N0:4所示,CD3C如序列表中SEQ ID N0:5所示。
[0009] pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro 质粒为购买得到,编号为 CD510B-1。
[0010] 本发明通用型慢病毒载体的制备方法,选择的基因为人CD8a引导链序列、CD8a较 链区、CD28跨膜区-胞内区、CD137胞内区及CD3C,具体构建步骤如下:
[00川一、引物设计:
[0012] 设计CD8a较链区、CD28跨膜区-胞内区、CD137胞内区及CD3C的上游引物和下游引 物,分别命名为:CD8aF/CD8aR、CD28F/CD28R、CD 137F/CD137R、CD3CF/CD3CR。
[0013] 引物具体要求为:
[0014] a.CDSa较链区上游引物添加 EcoR I酶切位点,CD3C下游添加 Not I酶切位点;
[0015] b.CDSa较链区下游引物与CD28跨膜区-胞内区上游引物应有一部分可W互补结合 的重叠序列;
[0016] C.CD28跨膜区-胞内区下游引物与CD137胞内区上游引物应有一部分可W互补结 合的重叠序列;
[0017] d.CD137胞内区下游引物与CD3C上游引物应有一部分可W互补结合的重叠序列。 [001引引物序列如下:
[0019] CD8aF:5 '-CCGGAATTCACCACGACGCCAGCGCCGC-3'
[0020] CD8aR:5 '-ACCAGCACCCAAAAATCACAGGCGAAGTCCAGCCCCCT-3,
[0021] CD28F:5 '-GACTTCGCCTGTGATTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGG-3,
[00。] CD28R:5 '-CTTTCTGCCCCGTTTGGAGCGATAGGCTGCGAAGTCGC-3,
[OOU ] CD137F:5 '-GCAGCCTATCGCTCCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCT-3,
[0024] CD137R:5 '-GCTGAACTTCACTCTCAGTTCACATCCTCCTTCTTCTTC-3'
[002引 CD化F:5 '-GGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAG-3,
[0026] CD化R:5 '-ATTTGCGGCCGCTTAGCGAGGGGGCAGGGCCT-3,
[0027] 二、外周血单个核细胞的获得、激活:
[00%] a.用肝素钢抗凝管采集成人外周血10ml,缓慢将其加入到事先分装好的Ficoll溶 液中(体积比约为2:1),2000巧m离屯、20min;
[0029] b.移液管缓慢吸去上层血浆后,收取白膜层细胞PBMC,10ml生理盐水,150化pm离 屯、5min,重复洗涂一次并计数;
[0030] C.将PBMC用含 10%FBS、1000IU/ml 化-2的RPMI1640培养基重悬并稀释至 1X10*V ml-1.5 X lOVml,取2ml稀释液加入至事先用包被液包被好的6孔板中(所述包被液为0.5ml PBS,其中含有化g/ml 0KT3、2000U/mlIFN- 丫和lOOOU/ml比-化),刺激20-2化。
[0031] S、mRNA的提取及RT反应:
[0032] 取步骤二激活后的PBMC 150化pm离屯、5min后弃上清,用1ml预冷的化izol冰上裂 解细胞,抽提RNA,并进行反转录成cDNA。
[0033] 四、WcDNA为模板,用引物CD8aF/CD8aR、CD28F/CD28R、CD137F/CD137R和CD3CF/ CD3邹分别进行PCR扩增,获得CD8a较链区、CD28跨膜区-胞内区、CD137胞内区及CD3C基因, 胶回收纯化后依次进行重叠延伸PCR(overlap extension PCR)W获得含CD8a较链区、CD28 跨膜区-胞内区、CD137胞内区及CD3C基因的拼接基因序列,将得到的拼接基因进行纯化与 PMD19-T simple载体进行连接,并将连接产物转化大肠杆菌D册α感受态细胞,经扩增后提 取质粒进行基因测序,测序正确的质粒命名为CD8aHinge-CD28-CD137-CD3C-T simple,进 行保存备用。
[0034] 五、在CD8a信号肤基因上游添加 kozak序列W增加目的基因的表达量,同时在 kozak序列前加入Nhe I酶切位点,在CD8a信号肤基因下游依次加入BamH I和EcoRI酶切位 点,合成得到单链CDSaLeader DNA序列;
[0035] 六、用限制性内切酶Nhe巧日Not I对pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro载体进行双酶切, 1 %琼脂糖凝胶回收线性载体;
[0036] 用限制性内切酶EcoR巧日Not I对质粒CD8aHinge-CD28-CD137-CD3C-T simple进 行双酶切,胶回收CD8aHinge-CD28-CD137-CD3C片段;
[0037] 将步骤五合成的单链CDSaLeader DNA序列进行退火形成双链,退火条件为95°C 5min、62°C10min,退火缓冲液为annealing bufferdOmM t;ris,50mM 化抓TA),退 火后进行纯化,得到CDSaLeader双链DM序列,两端分别为含粘性末端的化e巧蛇coRI的酶 切位点。
[0038] 屯、将步骤六获得的 pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro 线性载体、CD8 地 inge-CD28-CD137- CD3C片段及CDSaLeader片段利用T4DNA连接酶进行Ξ段式连接,载体与片段的摩尔比为1: (3-10),D8aHinge-CD28-CD137-CD3C片段与CDSaLeader片段的摩尔比为1:1,经鉴定正确后 4°C保存备用,即得到用于表达嵌合抗原受体及双特异性嵌合抗原受体的通用型慢病毒载 体。
[0039] 本发明的有益效果:
[0040] 本发明成功制备CD8a信号肤、CD8a较链区、CD28跨膜区-胞内区、CD137胞内区及 CD3C胞内区基因,并通过overlapPCR的方法将其进行拼接,拼接后的基因连入慢病毒表达 载体。该载体加入运些嵌合抗原受体(CAR)所需元件后,针对不同肿瘤类型只需在此基础上 克隆不同抗原的抗体序列并插入其中即可获得嵌合抗原受体(CAR)。
[0041] 1.本发明是将设计好的基因插入到慢病毒表达载体中,利用293T细胞在辅助质粒 的作用下,进行慢病毒颗粒的包装,基因插入后未影响载体的复制,且慢病毒依然可W正常 包装。
[0042] 2.本发明所包装的慢病毒在M0I值为300时可W成功感染T淋己细胞,并且目的基 因可W在τ细胞中稳定的表达。
[0043] 3.本发明所制备的通用性载体可W通过BamH I和EcoRI酶切位点及其相应的同尾 酶进行多种单链抗体序列(ScFv)和双特异性抗体序列(Bi sFv)的连接,从而构建出多种特 异性CAR及化n-CAR。
[0044] 4、启动子为CMV启动子,是公认的启动真核基因表达的最有力量的启动子,被广泛 应用于构建高效真核表达载体,用于基因工程、基因治疗和DNA免疫。
[0045] 5、载体上引入的化ro抗性基因可W使感染的细胞具有嚷岭霉素抗性,而阴性细胞 贝阿被嚷岭霉素杀死,从而实现了感染后阳性CAR-T细胞的筛选,此筛选方法快速、安全、利 于应用。
[0046] 6、载体本身所含有的5/LTR和^LTR可W使目的基因整合到宿主细胞的基因组内, 跟随宿主细胞的基因复制而进行复制,从而实现目的基因的稳定表达。
【附图说明】
[0047] 图1为实施例1中制备好的最终质粒中目的基因 PCR鉴定结果;
[0048] 图2为实施例1中感染后的T细胞中目的基因表达情况检测。
【具体实施方式】
[0049] 本发明技术方案不局限于W下所列举【具体实施方式】,还包括各【具体实施方式】间的 任意组合。
[0050]
【具体实施方式】一:本实施方式通用型慢病毒载体WpCDH-CMV-MCS-EFl-Puro质粒 为骨架,向质粒骨架的多克隆位点MCS处插入W下元件:CDSaLeader DNA序列、CD8a较链区、 CD28跨膜区-胞内区、CD137胞内区和CD3C;其中CDSaLeader DNA序列如序列表中SEQ ID N0:1所示,CD8a较链区如序列表中SEQ ID N0:2所示,CD28跨膜区-胞内区如序列表中SEQ ID N0:3所示,CD137胞内区如序列表中沈Q ID N0:4所示,CD3C如序列表中沈Q ID N0:5所 /J、- 〇
[0051] 本实施方式构建含信号序列、胞外较链区、膜结合区和胞内信号转导区,胞内信号 转导区含有CD3C序列和共刺激分子信号序列(costimulato巧molecule,CM)序列,将它们 同时连接到pCDH_Vector的MCS,构建出可W连接不同抗体序列,且具有分泌表达功能的通 用型载体,方便了多种CAR及化n-CAR的研究及应用。
【具体实施方式】 [0052] 二:本实施方式通用型慢病毒载体的制备方法,具体步骤如下:
[005;3] -、引物设计:
[0054] 设计CD8a较链区、CD28跨膜区-胞内区、CD137胞内区及CD3C的上游引物和下游引 物,分别命名为:CD8aF/CD8aR、CD28F/CD28R、CD 137F/CD137R、CD3CF/CD3CR;
[0055] 二、外周血单个核细胞的获得、激活:
[0056] 采集成人外周血,提取外周血单个核细胞,将外周血单个核细胞(PBMC)用含10% FBS和lOOOIU/ml比-2的RPMI1640培养基重悬并稀释至1 X 106/πα-1.5 X lOVml,取2ml稀释 液加入至事先用包被液包被好的6孔板中,刺激20-2化。
[0化7] S、mRNA的提取及RT反应:
[0058]提取步骤二激活后的PBMC的RNA,并进行反转录成cDNA;
[0059]四、WcDNA为模板,用引物CD8aF/CD8aR、CD28F/CD28R、CD137F/CD137R和CD3CF/ CD3邹分别进行PCR扩增,获得CD8a较链区、CD28跨膜区-胞内区、CD137胞内区及CD3C基因, 胶回收纯化后依次进行重叠延伸PCRW获得含CD8a较链区、CD28跨膜区-胞内区、CD137胞内 区及CD3C基因的拼接基因序列,将得到的拼接基因进行纯化与PMD19-T simple载体进行连 接,并将连接产物转化大肠杆菌D册α感受态细胞,经扩增后提取质粒进行基因测序,测序正 确的质粒命名为CD8aHinge-CD28-CD137-CD3C-Tsimple,进行保存备用;
[0060] 五、在CD8a信号肤基因上游添加 kozak序列W增加目的基因的表达量,同时在 kozak序列前加入Nhe I酶切位点,在CD8a信号肤基因下游依次加入BamH I和EcoRI酶切位 点,合成得到单链CDSaLeader DNA序列;
[0061 ] 六、用限制性内切酶Nhe巧日Not I对pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro载体进行双酶切, 1 %琼脂糖凝胶回收线性载体;
[0062] 用限制性内切酶EcoR 巧日Not I对质粒CD8aHinge-CD28-CD137-CD3C-T simple进 行双酶切,胶回收CD8aHinge-CD28-CD137-CD3C片段;
[0063] 将步骤五合成的单链CDSaLeader DNA序列进行退火形成双链,退火后进行纯化, 得到CDSaLeader双链DNA序列;
[0064] 屯、将步骤六获得的 pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro 线性载体、CD8 地 inge-CD28-CD137- CD3C片段及CDSaLeader片段利用T4DNA连接酶进行Ξ段式连接,经鉴定正确后4°C保存备 用,即得到用于表达嵌合抗原受体及双特异性嵌合抗原受体的通用型慢病毒载体。
【具体实施方式】 [0065] Ξ:本实施方式与二不同的是:步骤一中引物CD8aF序 列为:5 ' - CCGGAATTCACCACGACGCCAGCGCCGC-3 ',引物CD8aF序列为:5'- ACCAGCACCCAAAAATCACAGGCGAAGTCCAGCCCCCT-3'。其它与二相同。
【具体实施方式】 [0066] 四:本实施方式与二或Ξ不同的是:步骤一中引物 CD28F序列为:5'-GACTTCGCCTGTGATTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGG-3' ;引物CD28R序列为:5'- CTTTCTGCCCCGTTTGGAGCGATAGGCTGCGAAGTCGC-3'。其它与二或Ξ相同。
【具体实施方式】 [0067] 五:本实施方式与二至四之一不同的是:步骤一中引 物CD137F序列为:5'-GCAGCCTATCGCTCCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCT-3' ;引物CD137R序列为: 5 ' -GCTGAACTTCACTCTCAGTTCACATCCTCCTTCTTCTTC-3 '。其它与二至四之一相 同。
【具体实施方式】 [0068] 六:本实施方式与二至五之一不同的是:步骤一中引 物CD化F序列为:5 ' -GGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAG-3 ' ;引物CD化R序列为: 5' -ATTTGCGGCCGCTTAGCGAGGGGGCAGGGCCT-3'。其它与二至五之一相同。
【具体实施方式】 [0069] 屯:本实施方式与二至六之一不同的是:步骤二所述 包被液为含有化g/ml 0KT3、2000U/mlIFN-丫和lOOOU/ml比-化的PBS缓冲液。其它与具体实 施方式二至六之一相同。
【具体实施方式】 [0070] 八:本实施方式与二至屯之一不同的是:步骤二所述 提取外周血单个核细胞的方法具体为:
[0071 ] a.将10ml成人外周血加入到事先分装好的Ficoll溶液中,200化pm离屯、20min;其 中外周血与Ficoll溶液的体积比为2:1;
[0072] b .移液管吸去上层血浆后,收取白膜层细胞PBMC,10ml生理盐水,150化pm离屯、 5min,重复洗涂一次并计数。其它与【具体实施方式】二至屯之一相同。
【具体实施方式】 [0073] 九:本实施方式与二至八之一不同的是:步骤六所述 退火条件为95°C5miη、62°C lOmin,退火缓冲液为annealing buffer(lOmM tris , 50mM Nacl,ImM邸TA)。其它与二至八之一相同。
【具体实施方式】 [0074] 十:本实施方式与二至九之一不同的是:步骤屯中载 体与片段的摩尔比为1: (3-10),所述片段为CD8aHinge-CD28-CD137-CD3C片段和CD8a Leader片段的混合物,其中D8地inge-CD28-CD137-CD3C片段与CDSaLeader片段的摩尔比为 1:1。其它与二至九之一相同。
[0075] 为验证本发明的有益效果,进行W下试验:
[0076] 实施例1:
[0077] 本实施例通用型慢病毒载体的制备方法,选择的基因为人CD8a引导链序列、CD8a 较链区、CD28跨膜区-胞内区、CD137胞内区及CD3C,具体构建步骤如下:
[007引一、引物设计:
[0079] 设计CD8a较链区、CD28跨膜区-胞内区、CD137胞内区及CD3C的上游引物和下游引 物,分别命名为:CD8aF/CD8aR、CD28F/CD28R、CD 137F/CD137R、CD3CF/CD3CR。
[0080] 引物具体要求为:
[0081 ] a.CDSa较链区上游引物添加 EcoR I酶切位点,CD3C下游添加 Not I酶切位点;
[0082] b.CDSa较链区下游引物与CD28跨膜区-胞内区上游引物应有一部分可W互补结合 的重叠序列;
[0083] C.CD28跨膜区-胞内区下游引物与CD137胞内区上游引物应有一部分可W互补结 合的重叠序列;
[0084] d.CD137胞内区下游引物与CD3C上游引物应有一部分可W互补结合的重叠序列。 [00化]引物序列如下:
[00 化]CD8aF:5 '-CCGGAATTCACCACGACGCCAGCGCCGC-3'
[0087] CD8aR:5 '-ACCAGCACCCAAAAATCACAGGCGAAGTCCAGCCCCCT-3,
[0088] CD28F:5,-GACTTCGCCTGTGATTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGG-3,
[0089] CD28R:5 '-CTTTCTGCCCCGTTTGGAGCGATAGGCTGCGAAGTCGC-3,
[0090] CD137F:5 '-GCAGCCTATCGCTCCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCT-3,
[0091] CD137R:5 '-GCTGAACTTCACTCTCAGTTCACATCCTCCTTCTTCTTC-3 '
[009。 CD化F:5 '-GGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAG-3,
[00巧]CD化R:5 '-ATTTGCGGCCGCTTAGCGAGGGGGCAGGGCCT-3,
[0094] 二、外周血单个核细胞的获得、激活:
[0095] a.用肝素钢抗凝管采集成人外周血10ml,缓慢将其加入到事先分装好的Ficoll溶 液中(体积比为2:1) ,2000巧m离屯、20min;
[0096] b.移液管缓慢吸去上层血浆后,收取白膜层细胞PBMC,10ml生理盐水,150化pm离 屯、5min,重复洗涂一次并计数;
[0097] C.将PBMC用含 10%FBS、1000IU/ml 化-2的RPMI1640培养基重悬并稀释至 1X10*V ml-1.5 X lOVml,取2ml稀释液加入至事先用包被液包被好的6孔板中(所述包被液为0.5ml PBS,其中含有化g/ml 0KT3、2000U/mlIFN- 丫和lOOOU/ml比-化),刺激20-2化。
[0098] S、mRNA的提取及RT反应:
[0099] 取步骤二激活后的PBMC 150化pm离屯、5min后弃上清,用1ml预冷的化izol冰上裂 解细胞,抽提RNA,并进行反转录成cDNA。
[0100] 四、WcDNA为模板,用引物CD8aF/CD8aR、CD28F/CD28R、CD137F/CD137R和CD3CF/ CD3邹分别进行PCR扩增,获得CD8a较链区、CD28跨膜区-胞内区、CD137胞内区及CD3C基因, 胶回收纯化后依次进行重叠延伸PCR(overlap extension PCR)W获得含CD8a较链区、CD28 跨膜区-胞内区、CD137胞内区及CD3C基因的拼接基因序列,将得到的拼接基因进行纯化与 PMD19-T simple载体进行连接,并将连接产物转化大肠杆菌D册α感受态细胞,经扩增后提 取质粒进行基因测序,测序正确的质粒命名为CD8aHinge-CD28-CD137-CD3C-T simple,进 行保存备用。
[0101] 1、利用〔08〇。/〔08〇3、〔028。/〔0281?、〔0137。/〔01371?、〔03巧/〔03邹引物,^?81〔3 cDNA为模板,分别PCR扩增CD8a较链区、CD28跨膜区-胞内区、CD137胞内区及CD3C胞内区基 因,其PCR扩增体系为: PBMC cDNA 2 μΙ_. I 〇χPC民 buffer 2 μL^ lOir.M dNTP 1 μL^
[0102] ΙΟμιη i:游引物 1 ]iL Ι Ομιη下游引物 1睐 Extaq 酶 0.2 μL., d(JH2〇 12.8 μι.
[0103] PCR 扩增条件为:95。[5111111,95。[4536。,60。[306。3,72。[3036。,35个循环,72。[ 7min0
[0104] 2、0ver-lap PC則尋CD8a較链区基因与CD28跨膜区-胞内区基因融合:
[0105] 将PCR反应获得的CD8a较链区基因与CD28跨膜区-胞内区基因片段进行2%的琼脂 糖凝胶分析并纯化回收后进行基因融合,体系如下: 10XPCR buffer 5 μΙ> lOmM clNTP 5 μL CD8a较链区基因 3.3 yL (50唯) CD28跨膜区-胞内区基因 2.7yL (50ng)
[0106] lOpmCDSaF 引物 2 阵 10,LimCD28民引物 2 故Taq 酶 0.5 加 Η?0 29.5 μL
[0107]混匀后进行 PCR 扩增。循环参数为:95°C7min,95°C45sec,60°C30ecs,72°C45sec, 15个循环,72°C7min。扩增结束后,将PCR产物进行1.5%的琼脂糖凝胶分析并纯化回收后与 CD137胞内区基因融合。
[010引3、CD8a较链区-CD28跨膜区-胞内区基因与CD137胞内区基因融合具体参数及反应 条件同步骤2。
[0109] 4、CD8a较链区-CD28跨膜区-胞内区-CD137胞内区基因与CD3C胞内区基因融合具 体参数及反应条件同步骤2。
[0110] 五、在CD8a信号肤基因上游添加 kozak序列W增加目的基因的表达量,同时在 kozak序列前加入化e I酶切位点,在CD8a信号肤基因下游依次加入BamH I和EcoR I酶切位 点,合成得到单链CDSaLeader DNA序列;
[0111] 六、用限制性内切酶Nhe巧日Not I对pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro载体进行双酶切, 1 %琼脂糖凝胶回收线性载体;
[0112] 用限制性内切酶EcoR 巧日Not I对质粒CD8aHinge-CD28-CD137-CD3C-T simple进 行双酶切,胶回收CD8aHinge-CD28-CD137-CD3C片段;
[0113] 将步骤五合成的单链CDSaLeader DNA序列进行退火形成双链,退火条件为95°C 5min、62°C10min,退火缓冲液为annealing bufferdOmM t;ris,50mM 化抓TA),退 火后进行纯化,得到CDSaLeader双链DNA序列,两端分别为含粘性末端的Nhe巧此coR I的 酶切位点。
[0114] 屯、将步骤六获得的 pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro 线性载体、CD8 地 inge-CD28-CD137- CD3C片段及CDSaLeader片段利用T4DNA连接酶进行Ξ段式连接,载体与两个片段的摩尔比 为1:6,D8地inge-CD28-CD137-CD3C片段与CDSaLeader片段的摩尔比为1:1,经鉴定正确后4 °(:保存备用,即得到用于表达嵌合抗原受体及双特异性嵌合抗原受体的通用型慢病毒载 体。
[0115] 八、慢病毒的包装及T淋己细胞的感染
[0116] 将密度为lX105cells/ml 2ml的293T细胞接种于6孔板,18-2地后用脂质体进行 转染,转染后48h收获慢病毒,具体步骤为:a.约23加1化ti-MEM稀释2.7ug pCDH-CMV-MCS- EFl-Puro-目的基因+ 1.76ug pMDL(Gal/Pol)+0.95ug pVSVG+0.68ug pREV至250ul; b.235ul Opti-MEM稀释 15ul lipofectamine2000;c.5min后,将a、b步溶液混合,室溫静止 30min; d.从6孔板中吸出1ml培养基,然后滴加入500ul质粒和脂质体混合物,6-1化后,移除 含有DNA-脂质体复合物的培养基,代之W正常培养液DMED+10%FBS(从此刻开始算时间), 4化后收级含有慢病毒的培养上清;
[0117] 慢病毒浓缩及滴度测定:a.用0.45皿滤器过滤上清液于过滤杯中,将过滤杯插到 滤过液收集管中,4000 X g离屯、10-15min,将病毒浓缩液移出,分装后,-80°C保存;b.取其中 一支进行病毒生物学滴度测定。具体操作为:将慢病毒依次10倍稀释后加入到事先准备的 293T细胞中,感染4她后加入扣g/ml的puromycin,继续培养2天,通过计算感染后的活细胞 数量来判断滴度数值。
[011引 T淋己细胞的感染及目的基因的表达:a.取10ml-20ml外周血,用Ficol分离PBMC, 将PBMCWl-2X10シml的密度接种于T75培养瓶中,第0天加入2000IU/mL的IFN-r刺激,第l 天加入400ng/ml anti-CD3及4000IU/mL比-2使T细胞激活;b.激活培养2-3天后离屯、收集T 细胞,PBS洗涂两次后用500-1000IU/mL化-2培养基稀释到5*l0Vml,接种于6孔板,每孔 2ml; c.向Τ细胞中加入慢病毒,(MOI值为300),用封口膜封好6孔板边缘,900g离屯、化后,37 °C5%C02培养感染4小时,置换新鲜培液并继续37Γ培养;d.收获未感染的T细胞及感染后 培养4她、14d的T细胞,提取RNA进行表达情况检测。
[0119] 图1为制备好的最终质粒中目的基因 PCR鉴定结果;
[0120] 图2为感染后的T细胞中目的基因表达情况检测。其中Μ为Makera为未感染的T细 胞,2为感染后48h的T细胞,3为感染后14d的T细胞。
[0121] 图2中可见,未感染的T细胞不能表达目的基因,感染4她后可W表达目的基因,说 明感染成功;感染14d后还可W检测到目的基因的表达,说明基因可W整合至I"细胞基因组, 能够稳定表达。
[0122] 本方法成功制备CD8a信号肤、CD8a较链区、CD28跨膜区-胞内区、CD137胞内区及 CD3C胞内区基因,并通过overlapPCR的方法将其进行拼接,拼接后的基因连入慢病毒表达 载体。该载体加入运些嵌合抗原受体(CAR)所需元件后,针对不同肿瘤类型只需在此基础上 克隆不同抗原的抗体序列并插入其中即可获得嵌合抗原受体。构建出可W连接不同抗体序 列,且具有分泌表达功能的通用型载体,方便了多种CAR及化n-CAR的研究及应用。
【主权项】
1. 一种通用型慢病毒载体,其特征在于该慢病毒载体以pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro质粒 为骨架,向质粒骨架的多克隆位点MCS处插入以下元件:⑶8aLeader DNA序列、⑶8α铰链区、 CD28跨膜区-胞内区、CD137胞内区和0)3ζ;其中CD8aLeader DNA序列如序列表中SEQ ID N0:1所示,CD8a铰链区如序列表中SEQ ID N0:2所示,CD28跨膜区-胞内区如序列表中SEQ ID N0:3所示,CD137胞内区如序列表中SEQ ID N0:4所示,0)3ζ如序列表中SEQ ID N0:5所 不。2. 如权利要求1所述的通用型慢病毒载体的制备方法,其特征在于该方法 具体步骤如下: 一、 引物设计: 设计⑶8a铰链区、⑶28跨膜区-胞内区、CD137胞内区及⑶3ζ的上游引物和下游引物,分 别命名为:CD8aF/CD8aR、CD28F/CD28R、CD 137F/CD137R、CD3GF/CD3GR; 二、 外周血单个核细胞的获得、激活: 采集成人外周血,提取外周血单个核细胞,将外周血单个核细胞用含10 %FBS和 1000IU/ml IL-2的RPMI1640培养基重悬并稀释至1 X 106/ml-l. 5 X 106/ml,取2ml稀释液加 入至事先用包被液包被好的6孔板中,刺激20-28h。 三、 mRNA的提取及RT反应: 提取步骤二激活后的PBMC的RNA,并进行反转录成cDNA; 四、 以cDNA为模板,用引物CD8aF/CD8aR、CD28F/CD28R、CD137F/CD137R和CD3GF/CD3GR 分别进行PCR扩增,获得⑶8a铰链区、⑶28跨膜区-胞内区、CD137胞内区及⑶3ζ基因,胶回收 纯化后依次进行重叠延伸PCR以获得含⑶8α铰链区、CD28跨膜区-胞内区、CD137胞内区及 ⑶3ζ基因的拼接基因序列,将得到的拼接基因进行纯化与PMD19-T simple载体进行连接, 并将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,经扩增后提取质粒进行基因测序,测序正确 的质粒命名为CD8aHinge-CD28-CD137-CD3G-Tsimple,进行保存备用; 五、 在⑶8a信号肽基因上游添加 kozak序列以增加目的基因的表达量,同时在kozak序 列前加入Nhe I酶切位点,在⑶8α信号肽基因下游依次加入BamH I和EcoR I酶切位点,合成 得到单链⑶8aLeader DNA序列; 六、 用限制性内切酶Nhe I和Not I对pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro载体进行双酶切,1 %琼 脂糖凝胶回收线性载体; 用限制性内切酶EcoR I和Not I对质粒CD8aHinge-CD28-CD137-CD3C-T simple进行双 酶切,胶回收CD8aHinge-CD28-CD137-CD3G 片段; 将步骤五合成的单链⑶SaLeader DNA序列进行退火形成双链,退火后进行纯化,得到 CD8aLeader 双链 DNA 序列; 七、 将步骤六获得的 pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro 线性载体、CD8aHinge-CD28-CDl 37-〇)3ζ 片段及⑶SaLeader片段利用T4DNA连接酶进行三段式连接,经鉴定正确后4°C保存备用,即 得到用于表达嵌合抗原受体及双特异性嵌合抗原受体的通用型慢病毒载体。3. 根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于步骤一中引物CD8aF序列为:5'_ CCGGAATTCACCACGACGCCAGCGCCGC-3,,引物CD8aF序列为 i-ACCAGCACCCAAAAATCACAGGCGAAGTCCAGCCCCCT-3,。4. 根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于步骤一中引物CD28F序列为:5'_ GACTTCGCCTGTGATTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGG-3 ' ;引物CD28R序列为:5 ' -CTTTCTGCCCCGTTTGGAGCGATAGGCTGCGAAGTCGC-3 '。5. 根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于步骤一中引物CD137F序列为:5'-GCAGCCTATCGCTCCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCT-3 ' ;引物CD137R序列为:5 ' -GCTGAACTTCACTCTCAGTTCACATCCTCCTTCTTCTTC-3 '。6. 根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于步骤一中引物CD3GF序列为:5'_ GGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAG-3 ' ;引物CD3GR序列为:5 ' -ATTTGCGGCCGCTTAGCGAGGGGGCAGGGCCT-3 ' 〇7. 根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于步骤二所述包被液为含有lμg/mlOKT3、 2000U/mlIFN- γ 和 1000U/mlIL-la的PBS缓冲液。8. 根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于步骤二所述提取外周血单个核细胞的 方法具体为: a. 将10ml成人外周血加入到事先分装好的Ficoll溶液中,2000rpm离心20min;其中外 周血与Ficoll溶液的体积比为2:1; b. 移液管吸去上层血浆后,收取白膜层细胞PBMC,10ml生理盐水,1500rpm离心5min,重 复洗涤一次并计数。9. 根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于步骤六所述退火条件为95°C5min、62°C lOmin,退火缓冲液为annealing buffer。10. 根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于步骤七中载体与片段的摩尔比为1: (3-10),所述片段为CD8aHinge-CD28-CD137-CD3C片段和CD8aLeader片段的混合物,其中D8 aHinge-CD28-CD137-CD3C 片段与 CD8aLeader 片段的摩尔比为1:1。
【文档编号】C12N15/867GK106011174SQ201610594668
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月26日
【发明人】刘春香, 张怡, 芦慧颖, 石佳宁, 刘艳青
【申请人】黑龙江天晴干细胞股份有限公司
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