一种无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法
【专利摘要】本发明公开了一种无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法，其特征在于：包括，构建重组质粒，获得重组大肠杆菌，配制培养基，制备种子液，发酵。与前期已报道的生物法合成乙醇酸相比，本发明中所提到的乙醇酸发酵技术方案在没有敲除大肠杆菌BL21(DE3)中任何基因的情况下提高了乙醇酸的产量及产率。以葡萄糖为唯一碳源，GL1、GL3、GL2摇瓶发酵产率分别为0.109g/g，0.155g/g，0.248g/g，通过发酵条件优化，GL2上罐发酵时产量达到4.275g/L，产率为0.427g/g。
【专利说明】
-种无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体设及一种无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸 产率的方法。
【背景技术】
[0002] 乙醇酸（glycolicacid，glycolate)又称径基乙酸（Hy化oxyaceticacid)、甘醇酸， 是最简单的α-径基酸。它在化妆品，制药，纺织和制革等行业得到了广泛的应用。
[0003] 已知多种使用相应的α-径基腊作为原料W及微生物作为催化剂用于制备α-径基 酸的方法。所产生的α-径基酸的例子包括:乙醇酸、乳酸、2-径基异下酸、2-径基-2-苯丙酸、 苦杏仁酸、2-径基-3，3-二甲基-4-下内醋和4-甲硫下酸。运些产物是使用微生物合成的，例 如属于诺卡氏菌属(Nocardia)、芽抱杆菌属(Bacillus)、短杆菌属(Brevibacterium)、金杆 菌属(Aureobacterium)、假单胞菌属（Pseudomonas)、乳酪杆菌属Kaseobacter)、产碱杆菌 属（41。日11肖日11日3)、不动杆菌属（4(3；[]1日1:〇6日(31日1')、肠杆菌属化]11日1'〇6日(31日1')、节杆菌属 (Arthrobacter)、埃希氏杆菌属化scherichia)、微球菌属（Micrococcus)、链霉菌属 (Streptomyces)、黄杆菌属（Flavobacterium)、气单胞菌属（Aeromonas)、枝动杆菌属 (Mycoplana)、纤维单胞菌属（Cellulomonas)、欧文氏菌属化rwinia)、假丝酵母属 (Candida)、无芽抱杆菌属（Bacteridium)、曲霉属（Aspergillus)、青霉属（Penicillium)、 旋抱腔菌属（Cochliobolus)、镶抱菌属(F'usarium)、红假单胞菌属(Miodopseudomonas)、红 球菌属（Rhodococcus)、棒状杆菌属（Corynebacterium)、细杆菌属（Microbacterium)、 Obsumbacterium和戈登氏菌属（Gordons)的那些微生物（相应于US5,223,416的JP-A-4- 99495、肝-A-4-99496 和肝-A-4-218385;相应于 US5，234，826 的肝-A-4-99497;相应于 US5， 296，373 的肝-A-5-95795JP-A-5-21987;相应于 US5，326，702 的肝-A-5-192189;相应于 EP- A-0610048 的肝-A-6-237789;相应于 EP-A-0610049 的 JP-A-6-284899;相应于 US5，508，181 的肝-A-7-213296)。
[0004] 目前乙醇酸的主要生产方式是化学合成，但是该方法的产品收率并不高。此外，在 乙醇酸的化学合成过程中需要加入大量的有毒有害的甲醒，并且整个生产过程对环境污染 非常大。为了解决上述问题，人们将目光聚焦到生物合成乙醇酸的道路上，且做了大量的基 础工作。目前报道的主要生物合成乙醇酸的方法有微生物酶催化法和全生物合成方法。主 要的微生物酶催化法包括利用微生物产腊水解酶水解乙醇腊产乙醇酸W及微生物产甘油 氧化酶氧化乙二醇产乙醇酸。全生物合成乙醇酸的方法包括:利用乙二醇作为底物生产乙 醇酸及利用大肠杆菌W葡萄糖为底物全生物合成乙醇酸。W葡萄糖为底物全生物合成乙醇 酸具有底物廉价，操作简单，产品纯度高等突出优点。尽管研究人员已经在大肠杆菌中实现 了利用葡萄糖全生物合成乙醇酸，但是该方法得到的乙醇酸产率较低，在没有敲除基因的 情况下，目前已报道的乙醇酸的最高产率为0.157g/g。
【发明内容】
[0005] 本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面W及简要介绍一些较佳实施 例。在本部分W及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略W避免使本部 分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而运种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
[0006] 鉴于上述和/或现有乙醇酸合成中存在的问题，提出了本发明。
[0007] 因此，本发明目的是解决现有技术中的不足，提供一种无基因敲除提高大肠杆菌 中乙醇酸产率的方法。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种无基因敲除提高大肠杆 菌中乙醇酸产率的方法，其特征在于，包括，利用基因组提取试剂盒提取大肠杆菌D册α基因 组，并W此为模板进行PCR扩增目的基因，在35~37°C条件下，Ndel和化〇1双酶切PCR扩增的 目的基因1.5~2.化，PCR产物纯化试剂盒纯化，在35~37°C条件下，Ndel和化〇1双酶切质粒 pCOLDuet-11.5~2.化，利用胶回收试剂盒回收载体片段，用T4连接酶处理目的基因片段与 载体片段，在35~37°C培养箱内培养过夜，验证后完成重组质粒的构建，并进行重组大肠杆 菌的制备，将甘油保藏的菌种接种于LB液体培养基中，在35~37°C、220~28化/min条件下 摇瓶过夜，将过夜培养的种子液离屯、，并用M9培养基重悬菌体，进行摇瓶发酵或上罐发酵， 得到含有乙醇酸的发酵液。
[0009] 作为本发明所述无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法的一种优选方案， 其中：所述目的基因包括yc抓或aceAK。
[0010] 作为本发明所述无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法的一种优选方案， 其中：所述用T4连接酶处理目的基因片段与载体片段，包括，用T4连接酶在15~20°C处理目 的基因片段与载体片段7~10小时，将上述连接反应液加入JM109化转感受态中冰上放置25 ~35min，40~42°C热激80~100s，加入S0C液体培养基，35~37°C摇床解育0.8~1.2h，W45 ~55ug/mL涂布卡那抗性平板。
[0011] 作为本发明所述无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法的一种优选方案， 其中：所述验证后完成重组质粒的构建，包括，挑取菌落进行PC閲金证，并将疑似正确菌落转 接入LB液体培养基，培养12~16h，利用质粒小提试剂盒提取质粒，Nco I和趾01酶切验证，得 到重组质粒P JNU-1、P JNU-2、P JNU-3。
[0012] 作为本发明所述无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法的一种优选方案， 其中：所述重组大肠杆菌的制备，包括，将重组质粒加入到化2UDE3)化转感受态中，混合均 匀，冰上放置25~35min，40~42 °C热激80~100s，加入S0C液体培养基，35~37 °C摇床解育 0.8~1.2h，W45~55ug/mL涂布卡那抗性平板，37 °C培养箱培养过夜，挑取单菌落进行PCR 验证，并将验证正确的重组大肠杆菌W45~55ug/mL接种于含有硫酸卡那霉素的LB液体培 养基中，摇瓶培养过夜，用12~15%的甘油冷冻保藏。
[0013] 作为本发明所述无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法的一种优选方案， 其中：所述摇瓶发酵包括，将种子液W1~3 %的接种量接种于摇瓶发酵培养基中，使其初始 0D600为0.1，在35~37 °C、220~280r/min条件下培养至0D600为0.8时加入ImMIPTG诱导表 达，并将培养条件改为28~32 °C、220~28化/min培养。
[0014] 作为本发明所述无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法的一种优选方案， 其中：所述摇瓶发酵培养基成分包括4~lOg/L葡萄糖、1 . 5~2.5mMMgS〇4、0.08~ 0.12mMCaCl2或40~60ug/ml硫酸卡那霉素中的一种或几种，其余成分为M9盐溶液。
[0015] 作为本发明所述无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法的一种优选方案， 其中：所述上罐发酵包括，W1~3%的接种量接种于发酵罐中，在35~40°C下培养至0D600 为0.7~0.9时加220~280ng/mlaTc，揽拌转速为350~450r/min，通气量0.8~1.2vvm，1.8 ~2.2MNaOH维持抑为6.8~7.2。
[0016] 本发明的有益效果：与化学法相比，生物法合成乙醇酸首先产品的回收更加方便 简单，而且极大程度地降低了对环境的污染程度。与前期已报道的生物法合成乙醇酸相比， 本发明中所提到的乙醇酸发酵技术方案在没有敲除大肠杆菌化2UDE3)中任何基因的情况 下，优选优化了重组质粒的构建体系、重组大肠杆菌的制备条件W及发酵过程中的工艺参 数，极大地提高了乙醇酸的产量及产率。W葡萄糖为唯一碳源，GL1、GL3、GL2摇瓶发酵产率 分别为0 . l〇9g/g，0.155g/g，0.248g/g，通过发酵条件优化，GL2上罐发酵时产量达到 4.275g/L，产率为0.427g/g。
【附图说明】
[0017] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用 的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本 领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可W根据运些附图获得其它 的附图。其中：
[001引图1为乙醇酸合成途径。
[0019]图2为pJNU-1质粒图谱。
[0020] 图3为pJNU-2质粒图谱。
[0021] 图4为pJNU-3质粒图谱。
[0022] 图5为pJNU-1质粒酶切验证图谱。
[0023] 图6为pJNU-3质粒酶切验证图谱。
【具体实施方式】
[0024] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对 本发明的【具体实施方式】做详细的说明。
[0025] 在下面的描述中阐述了很多具体细节W便于充分理解本发明，但是本发明还可W 采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可W在不违背本发明内涵的 情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
[0026] 其次，此处所称的"一个实施例"或"实施例"是指可包含于本发明至少一个实现方 式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的"在一个实施例中"并非均指 同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
[0027] 实施例1:重组质粒pJNU-1构建及重组大肠杆菌GL1的制备 [002引 1、目的基因 yc抓和aceAK的获得
[0029] 利用基因组提取试剂盒提取大肠杆菌DH5a基因组，并W此为模板进行PCR扩增目 的基因。
[0030] 2、目的基因与载体连接
[0031] Nde巧日趾oI37°C双酶切PCR扩增的基因片段yc抓2小时，PCR产物纯化试剂盒纯化， Nde I和化ο 137 °C双酶切质粒pCOLDuet-12小时，利用胶回收试剂盒回收载体片段。
[0032] T4连接酶处理目的基因片段与载体片段，16°C处理8小时，将上述连接反应液加入 100U1JM109化转感受态中冰上放置30min，42°C热激90s，加入ImLSOC液体培养基，37°C摇床 解育化，涂布卡那抗性平板(50ug/mL)n37°C培养箱培养过夜，挑取单菌落进行PCR验证，并 将疑似正确菌落转接LB液体培养基，培养12-1化，利用质粒小提试剂盒提取质粒，用Ndel和 化〇1酶切验证。验证正确的质粒用化〇1和EcoRI37°C双酶切2小时，同时化〇1和EcoRI37°C双 酶切PCR扩增的基因片段aceAK2小时。后续连接转化实验步骤同上，用趾0巧此coRI酶切验 证。
[0033] 3、重组大肠杆菌GL1的获得
[0034] 取重组质粒pJNU-llOul，加入到lOOul的化2UDE3)化转感受态中，混合均匀，冰上 放置30min，42°C热激90s，加入ImLSOC液体培养基，37°C摇床解育化，涂布卡那抗性平板 (50ug/mL)D37°C培养箱培养过夜，挑取单菌落进行PCR验证。并将验证正确的重组大肠杆菌 接种于含有硫酸卡那霉素(50ug/mL)的LB液体培养基中，摇瓶培养过夜，用15 %的甘油冷冻 保臧，备用。
[0035] 引物设计如下：
[0036]
[0037] 扩增目的基因的PCR体系：模板5ul，引物F15ul，引物R15ul，PrimeSTARMax DNAPolymerase250ul，d地2〇定容至500ul。
[003引 PCR 反应条件：98^5111111，98^53,55^53,72。(：1111111(：34个循环），72。(：10111111。
[0039] 实施例2:重组质粒pJNU-2的构建及重组大肠杆菌GL2的制备
[0040] 1、目的基因 yc抓的获得
[0041] 利用基因组提取试剂盒提取大肠杆菌DH5a基因组，并W此为模板进行PCR扩增目 的基因。
[00创 2、目的基因 yc抓与载体连接
[0043] Nde巧日趾oI37°C双酶切PCR扩增的基因片段yc抓2小时，PCR产物纯化试剂盒纯化， Nde I和化0137 °C双酶切质粒pCOLDuet-12小时，利用胶回收试剂盒回收载体片段。
[0044] 3、Τ4连接酶处理目的基因片段与载体片段，16°C处理8小时，将上述连接反应液加 入lOOul JM109化转感受态中冰上放置30min，42 °C热激90s，加入ImLSOC液体培养基，37 °C摇 床解育化，涂布卡那抗性平板(50ug/mL)。37 °C培养箱培养过夜，挑取单菌落进行PCR验证， 并将疑似正确菌落转接LB液体培养基，培养12-1化，利用质粒小提试剂盒提取质粒，用Ndel 和趾ol酶切验证，获得pCOLDuet-1-ycdW。目的基因 aceAK、启动子ptet、终止子片段的获得 及与载体的连接。W大肠杆菌D册α基因组为模板进行PCR扩增目的基因 aceAK，WpGLY-2为 模板进行PCR扩增启动子ptet及终止子片段，PCR产物纯化试剂盒纯化，用Ncol和PfoI37°C 双酶切pCOLDuet-1-yc抓2小时，利用胶回收试剂盒回收载体片段。
[0045] 将上述得到的4个片段利用Gibson组装体系构建重组质粒pJNU-2,具体实施方法 如下：
[0046] 1、配制6mL5 X isobuffer
[0047] 3mllMTris-HCl，150ul2MMgCl2,240ul100 mMdNTP，300ullMDTT(二硫苏糖醇）， 1.5评EG-8000,3000ul100 mMNAD(烟酷胺腺嚷岭二核巧酸），加 dd出0至6ml。
[004引 2、配制1.2mlGibson组装混合液
[0049] 320ul5 X isobuffer，0.64ull0u/ulT5exonuclease，30ul2u/ Lphusionpolymerase，160ul40u/ulTaqligase，方日 dd出0至1.2ml。
[0化0] 取15ulGibson组装混合液及上述四个片段个lOOng至20ul，50°C反应1小时，进行 化转，转入JM109中。转化方法同上。挑取单菌落PCR验证。EcoRI酶切验证。
[0化1] 3、重组大肠杆菌GL2的获得
[0化2] 取重组质粒pJNU-210ul，加入到lOOul的化2UDE3)化转感受态中，混合均匀，冰上 放置30min，42°C热激90s，加入ImLSOC液体培养基，37°C摇床解育化，涂布卡那抗性平板 (50ug/mL)D37°C培养箱培养过夜，挑取单菌落进行PCR验证。并将验证正确的重组大肠杆菌 接种于含有硫酸卡那霉素(50ug/mL)的LB液体培养基中，摇瓶培养过夜，用15 %的甘油冷冻 保臧，备用。
[0053]引物设计如下 [0化4]
[0化5]实施例3:重组质粒pJNU-3构建及重组大肠杆菌GL3的制备
[0化6] 1、目的基因 yc抓和aceAK的获得
[0057] 化〇1和化〇1双酶切质粒pJNU-1，切胶回收片段(70-4425bp)，获得目的基因 yc抓和 过ceAKo
[005引2、目的基因与载体连接
[0059] Ncol和趾〇1酶切质粒pRS抑uet-1，利用胶回收试剂盒回收载体片段。T4连接酶处 理目的基因片段与载体片段，16°C处理8小时，将上述连接反应液加入100U1JM109化转感受 态中冰上放置30min，42 °C热激90s，加入ImLSOC液体培养基，37 °C摇床解育化，涂布卡那抗 性平板(50ug/mL)。37 °C培养箱培养过夜，挑取菌落进行PCR验证，并将疑似正确菌落转接LB 液体培养基，培养12-1化，利用质粒小提试剂盒提取质粒，Ncol和化〇1酶切验证。
[0060] 3、重组大肠杆菌GL3的制备
[0061 ] 取重组质粒pJNU-310ul，加入到lOOul的化2UDE3)化转感受态中，混合均匀，冰上 放置30min，42°C热激90s，加入ImLSOC液体培养基，37°C摇床解育化，涂布卡那抗性平板 (50ug/mL)D37°C培养箱培养过夜，挑取单菌落进行PCR验证。并将验证正确的重组大肠杆菌 接种于含有硫酸卡那霉素(50ug/mL)的LB液体培养基中，摇瓶培养过夜，用15 %的甘油冷冻 保臧，备用。
[00创引物设计如下：
[0063]
[0064] 实施例4:重组大肠杆菌GL1，GL2摇瓶发酵及结果分析
[0(?日]培养基:M9盐溶液+8g/L葡萄糖+2mMMgS〇4+0. lmMCaCl2+50ug/ml硫酸卡那霉素。
[0066] 种子液制备:甘油保藏的菌种于平板上划线，挑取单菌落接种于盛有50ml的LB液 体培养基的250ml锥形瓶中，37°C、250r/min摇瓶过夜。
[0067] 发酵条件:过夜培养的种子液离屯、，并用M9培养基重悬菌体，接种于摇瓶发酵培养 基中，使其初始0D600为0.1。37°(：、250以111111培养至00600为0.8左右时加入相应的诱导剂诱 导表达--ImMIPTG(异丙基硫代半乳糖巧)诱导化l，lmMIPTG、250ng/mlaTc(脱水四环素盐 酸盐)诱导化2,改为30°C、250r/min培养。
[0068] 结果分析:发酵过程中每4h取一次样，800化/min离屯、2min将发酵液与菌体分离， 0.22um滤膜处理发酵液，用于进行HPLC(高效液相色谱法）检测，册LC检测中流动相为 5mM此S〇4,柱溫为50°CdGL1乙醇酸产量为0.877g/L，产率为0.109g/g，GL2乙醇酸产量为 1.988g/L，产率为0.248g/g。
[0069] 实施例5 :GL3摇瓶发酵及结果分析
[0070] 培养基:M9盐溶液+4g/L葡萄糖+2mMMgS04+0.1mMCaCl2+50ug/ml硫酸卡那霉素。
[0071] 种子液制备:甘油保藏的菌种接种于盛有50ml的LB液体培养基的250ml锥形瓶中， 37°C、250r/min 摇瓶过夜。
[0072] 发酵条件:过夜培养的种子液离屯、，并用M9培养基重悬菌体，接种于摇瓶发酵培养 基中，使其初始0D600为0.1。37°C、250r/min培养至0D600为0.8左右时加入lmMIPTG诱导表 达，改为30 °C、250r/min培养。
[0073] 结果分析:发酵过程中每4h取一次样，800化/min离屯、2min将发酵液与菌体分离， 0.22um滤膜处理发酵液，用于进行HPLC(高效液相色谱法）检测，册LC检测中流动相为 1.25mM出S〇4，柱溫为32 °C dGL3乙醇酸产量为0.628g/L，产率为0.157g/g。
[0074] 实施例6 :GL2上罐发酵及结果分析
[00巧]培养基:M9盐溶液+8g/L葡萄糖+2mMMgS〇4+0. lmMCaCl2+50ug/ml硫酸卡那霉素
[0076] 种子液制备:甘油保藏的菌种于平板上划线，挑取单菌落接种于盛有50ml的LB液 体培养基的250ml锥形瓶中，37°C、250r/min摇瓶过夜。次日取500ul菌液转接于eOmlLB液体 培养基中，37°C、250r/min培养至0D600达到0.5-0.6时，接种于化发酵罐中。
[0077] 发酵条件：2 %接种量，37 °C培养至0D600为0.8左右时加 250ng/mlaTc、lmMIPTG30 °C诱导，揽拌转速4(K)r/min，通气量1 vvm，2MfeOH维持抑为6.8~7.2。
[0078] 结果分析:发酵过程中每4h取一次样，800化/min离屯、2min将发酵液与菌体分离， 0.22um滤膜处理发酵液，用于进行HPLC(高效液相色谱法）检测，册LC检测中流动相为 5mM出S化，柱溫为50°C dGL2上罐发酵乙醇酸产量为4.275g/L，产率为0.427g/g。
[0079] 由此可见，本发明中所提到的乙醇酸发酵技术方案在没有敲除大肠杆菌化21 (DE3)中任何基因的情况下提高了乙醇酸的产量及产率。W葡萄糖为唯一碳源，GL1、GL3、 GL2摇瓶发酵产率分别为0.109旨八，0.155旨八，0.248旨八，通过发酵条件优化，61^2上罐发酵 时产量达到4.275g/L，产率为0.427g/g。
[0080] 上述说明已经充分掲示了本发明的【具体实施方式】。需要指出的是，熟悉该领域的 技术人员对本发明的【具体实施方式】所做的任何改动均不脱离本发明的权利要求书的范围。 相应地，本发明的权利要求的范围也并不仅仅局限于前述【具体实施方式】。
【主权项】
1. 一种无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法，其特征在于:包括， 提取大肠杆菌DH5a基因组，并以此为模板进行PCR扩增目的基因，在35~37°C条件下， Ndel和Xhol双酶切PCR扩增目的基因1.5~2.5h; PCR产物纯化，在35~37°C条件下，Ndel和Xhol双酶切质粒pCOLDuet-11.5~2.5h，回收 载体片段，用T4连接酶处理目的基因片段与载体片段，在35~37°C培养箱内培养，验证后完 成重组质粒的构建，并进行重组大肠杆菌的制备； 将菌种接种培养，在35~37°C、220~280r/min条件下培育，将培育后的种子液离心，并 重悬菌体，进行发酵，得到含有乙醇酸的发酵液。2. 根据权利要求1所述的无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法，其特征在于： 所述目的基因包括ycdW和/或aceAK。3. 根据权利要求1或2所述的无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法，其特征在 于:所述用T4连接酶处理目的基因片段与载体片段，包括，用T4连接酶在15~20°C处理目的 基因片段与载体片段7~10小时，将上述连接反应液加入JM109化转感受态中冰上放置25~ 35min，40~42°C热激80~100s，加入S0C液体培养基，35~37°C摇床孵育0.8~1.2h，以45~ 55ug/mL涂布卡那抗性平板。4. 根据权利要求1所述的无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法，其特征在于： 所述验证后完成重组质粒的构建，包括，挑取菌落进行PCR验证，并将疑似正确菌落转接入 培养基，培养12~16h，然后提取质粒，酶切验证，得到重组质粒pJNU-1、pJNU-2、pJNU-3。5. 根据权利要求1、2或4中任一项所述的无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方 法，其特征在于:所述重组大肠杆菌的制备，包括，将重组质粒加入到BL21(DE3)化转感受态 中，混合均匀，冰上放置25~35min，40~42°C热激80~100s，加入S0C液体培养基，35~37°C 摇床孵育〇. 8~1.2h，以45~55ug/mL涂布卡那抗性平板，37°C培养箱培养过夜，挑取单菌落 进行PCR验证，并将验证正确的重组大肠杆菌以45~55ug/mL接种于含有硫酸卡那霉素的LB 液体培养基中，摇瓶培养过夜，用12~15%的甘油冷冻保藏。6. 根据权利要求1、2或4中任一项中所述的无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的 方法，其特征在于:所述发酵包括摇瓶发酵，所述摇瓶发酵包括，将种子液以1~3 %的接种 量接种于摇瓶发酵培养基中，使其初始0D600为0.1，在35~37°C、220~280r/min条件下培 养至0D600为0.8时加入ImMIPTG诱导表达，并将培养条件改为28~32°C、220~280r/min培 养。7. 根据权利要求6所述的无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法，其特征在于： 所述摇瓶发酵培养基，其成分包括4~10g/L葡萄糖、1.5~2.5mMMgS〇4、0.08~0.12mMCaCl 2 或40~60ug/ml硫酸卡那霉素中的一种或几种，其余成分为M9盐溶液。8. 根据权利要求1、2、4或7中任一项中所述的无基因敲除提高大肠杆菌中乙醇酸产率 的方法，其特征在于:所述发酵包括上罐发酵，所述上罐发酵包括，以1~3 %的接种量接种 于发酵罐中，在35~40°C下培养至0D600为0.7~0.9时加220~280ng/mlaTc，搅拌转速为 350~450r/min，通气量0 · 8~1 · 2vvm，1 · 8~2 · 2MNaOH 维持pH为 6 · 8~7 · 2 〇
【文档编号】C12R1/19GK106011185SQ201610480579
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月27日
【发明人】邓禹, 张晓娟, 马宁
【申请人】江南大学