一种天然对氨基苯甲酸及其衍生物的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种天然对氨基苯甲酸及其衍生物的制备方法，通过液体发酵培养鸡枞菌，获取发酵物，然后从发酵物中分离纯化天然对氨基苯甲酸及其衍生物。本发明采用的天然对氨基苯甲酸及其衍生物制备方法，可以利用真菌菌种鸡枞菌Termitomyces albuminosus经液体发酵制得，培养基原料来源广泛，制备方法简单安全，且环境友好，容易实现工业化生产。CCTCC M 201626220160516
【专利说明】
-种天然对氨基苯甲酸及其衍生物的制备方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种天然对氨基苯甲酸及其衍生物的制备方法，属于生物医药领域。
【背景技术】
[0002] 对氨基苯甲酸，又名PABA等，是许多有机合成中一个重要前体及中间体，用于染料 和医药中间体，可用于生产活性红M-80，M-10B，活性红紫X-2R等染料W及制取氯基苯甲酸 生产药物对簇基节胺。对氨基苯甲酸可用作防晒剂，其衍生物对二甲氨基甲酸辛醋，是优良 的防晒剂。含有PABA结构单元的一些衍生物具有抗癌、抗肿瘤、抗乙型肝炎病毒等药理作 用。PABA还可参与叶酸的合成，其氨基酸衍生物可用于二氨叶酸还原酶，胸巧酸合成酶，法 尼基转移酶等酶抑制剂的合成，还可W作为合成具有抗糖尿病分子的活性片段。文献表明 具有PABA结构单元的一些化合物能能够修饰过氧化氨酶激活受体（peroxisome proliferator activated receptors，PPAR)，具有较好的PPAR激动活性，可用于缓解治疗 乳糖不难受症所导致的腹胀，腹痛。2-甲氧基-4-氨基苯甲酸为对氨基苯甲酸的衍生物，只 在苯环2位的碳上多了一个甲氧基，可用于制备肠胃药甲氧氯普胺。
[0003] 目前，对氨基苯甲酸及其衍生物2-甲氧基-4-氨基苯甲酸主要依靠化学合成。化学 合成常会用到大量的化学试剂，会造成环境污染。为寻找安全和环境友好的药物制备技术， 开展本发明的研究。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种天然对氨基苯甲酸及其衍生物的制备方法。
[0005] 本发明所述制备方法通过液体发酵培养鸡秋菌，获取发酵物，然后从发酵物中分 离纯化天然对氨基苯甲酸及其衍生物。
[0006] 具体包括如下： 1)真菌液体发酵:将鸡秋菌Termi iomjces a弘t/minos化鄉面菌种活化后，进行液体深 层发酵，培养基配方按重量比为：马铃馨5-40%，葡萄糖1-5%，余量为水，于0.1 Mpa和121 °C 灭菌30 min。采用恒溫摇床或各式发酵罐进行液体发酵，溫度设置22-30 °C，发酵7-30天； 所述菌株为鸡秋菌（化rmiiomjces )ZYB2016于2016年5月16日保藏于中国典 型培养物保藏中屯、，保藏编号为CCTCC Μ 2016262,地址为武汉大学。
[0007] 2)发酵产物处理:液体发酵结束后，除去菌丝体的发酵液用乙酸乙醋萃取，萃取 液经脱水、浓缩，得到有机粗提物浸膏； 3)天然对氨基苯甲酸及其衍生物的分离纯化:将2)所述的有机粗提物浸膏用甲醇溶 解，进行反相硅胶柱层析，用浓度为10-50%的甲醇水或丙酬水为洗脱剂，分管收集，将含有 目标组分的洗脱液浓缩得到亚组分。用甲醇将亚组分溶解，进行凝胶柱层析，用丙酬或甲醇 溶液洗脱，分管收集，将含有所述化合物的洗脱液合并，接着进行正相硅胶柱层析，W氯仿 装柱，干法上样，用氯仿：甲醇= 100:0.1-10的溶剂洗脱，得到对氨基苯甲酸及其衍生物。 [000引所述的衍生物包括2-甲氧基-4-氨基苯甲酸。
[0009] 本发明采用的天然对氨基苯甲酸及其衍生物制备方法，可W利用真菌菌种鸡秋菌 Termiiomjces a经液体发酵制得，培养基原料来源广泛，制备方法简单安全，且 环境友好，容易实现工业化生产。
【附图说明】
[0010] 图1所述对氨基苯甲酸的化学结构式。
[0011]图2所述2-甲氧基-4-氨基苯甲酸的化学结构式。
【具体实施方式】
[0012] 本发明提供的天然对氨基苯甲酸及其衍生物的制备方法，其步骤为： 1)液体培养及发酵产物处理:将真菌Termi iomjces a弘t/minostA·?斜面菌种先接种于装 有150mL马铃馨液体培养基的Ξ角瓶中活化，活化条件为转速230 r/min，培养溫度28 °C， 培养7天，再进行大批量的液体发酵，采用培养基配方为:每升水中含马铃馨200 g，葡萄糖 20 g，抑自然，0.1 Mpa，121 °C灭菌30 min,置于25-28 °C，180-230 r/min恒溫摇床中培 养。发酵15天后，用离屯、法将菌丝体与发酵液分离。发酵液用等体积的乙酸乙醋萃取，所得 萃取物用无水硫酸钢脱水，再用旋转蒸发仪于40°C条件下真空浓缩，得到有机粗提物浸膏。
[0013] 化合物分离：将1)所述的有机粗提物浸膏用甲醇溶解，进行反相硅胶柱层析，用 30%甲醇水洗脱，用化C检测具有对氨基苯甲酸的组分并合并，用旋转蒸发仪除去洗脱剂后 用甲醇溶解，再进行凝胶柱层析，W甲醇为洗脱剂，收集目标组分，接着进行正相硅胶层析， 氯仿装柱，干法上样，用氯仿：甲醇（100:1)洗脱得到化合物对氨基苯甲酸。
[0014] 对纯品进行核磁共振和质谱分析鉴定，根据核磁共振波谱数据，对化合物进行结 构鉴定，可确定该化合物。
[001引实施例1 用马铃馨葡萄糖培养基(每升水中含马铃馨200g，葡萄糖20 g，pH自然，0.1Mpa，12rC 灭菌30min)，将活化后的菌株Termiiomjces 液体发酵培养37 L，于28 °C摇床 培养15 d。菌体过滤后，发酵液浓缩至1 L，发酵液用乙酸乙醋萃取，乙酸乙醋部分用无水 硫酸钢脱水后浓缩，得到有机粗提物浸膏(3.1 g)。
[0016]将上一步骤中得到的3.1 g有机粗提物，用甲醇充分溶解，进行反相硅胶（170 g) 柱层析，用30%甲醇水洗脱2 L，流速为15 mL /min,每管收集280 mL，用旋转蒸发仪真空浓 缩后，分别取样进行薄层层析分析合并(展开剂为氯仿：甲醇= 10:1，显色剂为舰、10%硫酸 乙醇或舰化祕钟），得到含有目标化合物的组分(186 mg)。
[0017] 从上一步骤得到的组分（186 mg)，用甲醇溶解，进行凝胶（120g，Sephadex LH-20) 柱层析，甲醇洗脱，流速约为12 s/drop，每管收集4 mL，根据薄层层析检测合并得到组分 (90.2 mg)。
[0018] 从上一步骤得到的组分(90.2 mg)，用甲醇溶解，再进行反相硅胶（120 g)柱层析， 用30%甲醇水洗脱1 L，流速为15 mL /min,每管收集20 mL，每管旋转蒸发仪浓缩后，分管取 样进行薄层层析分析合并，得到含有目标化合物的组分(20.1 mg)。
[0019] 从上一步骤得到的组分(20.1 mg)进行正相硅胶层析(3 g硅胶），氯仿装柱，干法 上样，流动相为氯仿：甲醇（200 :1 )，洗脱体积为750 mL，薄层层析检测合并得到纯化合物 (14.8 mg)〇
[0020] 将上一步骤所得的化合物用気代甲醇溶解，转移到核磁管中，测定核磁共振波谱 州-醒3、1化-醒1?、册9(：、歷齡、古1护(：05￥)，并进行质谱和紫外光谱测定，并确定化合物结 构。
[0021] 从化合物的1h-醒R(5 6.67，δ 7.88和它们之间的截合常数1=9.3)和1化-醒如勺化 学位移值表明化合物中含有对位取代的苯环结构。另据UC-NMR化学位移值(170.3 S，163.5 S，133.1 dX2,123.0 S，116.2 dX 2)推测其为7个碳。根据高分辨质谱数据m/z :137.0233 [M] +，理论计算m/z:137.0477,结合NMR波谱数据推测分子式为C7化N02。化合物的紫外最大 吸收波长为252 nm (MeOH)。综合运些理化数据，确定化合物的结构为对氨基苯甲酸。
[0022] 实施例2 用马铃馨葡萄糖培养基(每升水中含马铃馨200g，葡萄糖20 g，pH自然，0.1Mpa，12rC 灭菌30min)，将活化后的菌株Termiiomjces 液体发酵培养37 L，于28 °C摇床 培养15 d。菌体过滤后，发酵液浓缩至1 L，发酵液用乙酸乙醋萃取，乙酸乙醋部分用无水 硫酸钢脱水后浓缩，得到有机粗提物浸膏(3.1 g)。
[0023] 将上一步骤中得到的3.1 g有机粗提物，用甲醇充分溶解，进行反相硅胶（170 g) 柱层析，用30%甲醇水洗脱2 L，流速为15血/min,每管收集280血，用旋转蒸发仪真空浓缩 后，分管取样进行薄层层析检测合并（展开剂为氯仿：甲醇= 10:1，显色剂为舰、10%硫酸乙 醇或舰化祕钟），得到含有目标化合物的组分(281.9 mg)。
[0024] 从上一步骤得到的组分（281.9 mg)，用甲醇溶解，进行凝胶（120g，Se地adex LH- 20)柱层析，甲醇洗脱，流速约为12 s/drop，每管收集4 mL，根据薄层层析检测合并得到组 分(138.6 mg)。
[0025] 从上一步骤得到的组分（138.6 mg)，用甲醇溶解，再进行反相硅胶（120 g)柱层 析，用30%甲醇水洗脱1 L，流速为15 mL/min，每管收集20 mL，用旋转蒸发仪真空浓缩后，分 管取样进行薄层层析(分析合并，得到含有目标化合物的组分(103.3 mg)。
[00%]从上一步骤得到的组分（103.3 mg)进行正相硅胶层析(3.5 g硅胶），氯仿装柱， 干法上样，流动相为氯仿：甲醇(200:1)，洗脱体积为1000 mL，薄层层析检测合并，得到纯化 合物(83.1 mg)。
[0027] 将上一步骤所得的化合物用気代甲醇溶解，转移到核磁管中，测定核磁共振波谱 州-醒3、1化-醒1?、册9(：、歷齡、古1护(：05￥)，并进行质谱和紫外光谱测定，并确定化合物结 构。
[0028] 从化合物的iH-匪R和1化-醒R的波谱数据表明化合物中含有取代的苯环结构（表 1)。又根据Uc-NMR的化学位移值（123.2 s，152.8 s，113.9 d，148.8 s，116.0 d，125.4 d， 170.2 s，56.5 q)推测其含有8个碳。根据高分辨质谱数据m/z: 167.0399 [M]%理论计算值 为m/z : 167.0582，结合NMR波谱数据推测该化合物的分子式为C姐9N03。化合物的紫外最大吸 收波长为216 nm (MeOH)。综合W上波谱数据，确定化合物的结构为2-甲氧基-4-氨基苯甲 酸。
[0029] 表1化合物的NMR波谱数据(気代甲醇，500 M)
w上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修 饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1. 一种天然对氨基苯甲酸及其衍生物的制备方法，其特征在于:通过液体发酵培养鸡 枞菌，获取发酵物，然后从发酵物中分离纯化天然对氨基苯甲酸及其衍生物。2. 根据权利要求1所述的一种天然对氨基苯甲酸及其衍生物的制备方法，其特征在于： 所述方法包括如下步骤： 1) 真菌液体发酵:将鸡纵菌rerffii ioffijces ai/wffiioosus斜面菌种活化后，进行液体深 层发酵，培养基配方按重量百分比为：马铃薯5-40%，葡萄糖1-5%，余量为水，于0.1 Mpa和 121 °C灭菌30 min;采用恒温摇床或各式发酵罐进行液体发酵，温度设置22-30 °C，发酵7-30天； 2) 发酵产物处理:液体发酵结束后，除去菌丝体的发酵液用乙酸乙酯萃取，萃取液经 脱水、浓缩，得到有机粗提物浸膏； 3) 天然对氨基苯甲酸及其衍生物的分离纯化:将2)所述的有机粗提物浸膏用甲醇溶 解，进行反相硅胶柱层析，用浓度为10-50%的甲醇水或丙酮水为洗脱剂，分管收集，将含有 目标组分的洗脱液浓缩得到亚组分;用甲醇将亚组分溶解，进行凝胶柱层析，用丙酮或甲醇 溶液洗脱，分管收集，将含有所述化合物的洗脱液合并，接着进行正相硅胶柱层析，以氯仿 装柱，干法上样，用氯仿：甲醇= 100:0.1-10的溶剂洗脱，得到对氨基苯甲酸及其衍生物。3. 根据权利要求1所述的一种天然对氨基苯甲酸及其衍生物的制备方法，其特征在于： 所述的衍生物包括2-甲氧基-4-氨基苯甲酸。4. 根据权利要求1所述的天然对氨基苯甲酸及其衍生物的制备方法，其特征在于:所述 菌株为鸡纵菌（^虹《#〇?尺65 3_//7^^/3〇5^/5)2￥132016，已于2016年5月16日保藏于中国典 型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC Μ 2016262。
【文档编号】C12P13/00GK106011190SQ201610325004
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月17日
【发明人】郑永标, 吴雅滨, 邹先文
【申请人】福建师范大学