一种以农林业木质纤维素生物质为原料制备人造淀粉、纤维素乙醇及单细胞蛋白的方法
【专利摘要】本发明公开了一种以农林业木质纤维素生物质为原料制备人造淀粉、纤维素乙醇及单细胞蛋白的方法，属于酶催化制备与微生物联合发酵的领域。该方法以农林业生物质中的纤维素及其衍生物为底物，在酵母和多酶共存的反应体系中，通过酵母发酵和体外多酶体系进行高效催化，将纤维素同时转化为人造淀粉、纤维素乙醇和单细胞蛋白；本发明通过体系与过程优化，将包含来源于植物α?1,4?葡聚糖磷酸化酶和纤维二糖磷酸化酶的多酶复合体在酵母表面进行展示，并添加人工调配的纤维素水解酶混合酶，从而建立酵母与多酶体系的联产反应体系。本发明方法可同时实现人造淀粉、纤维素乙醇、单细胞蛋白的规模化工业生产。
【专利说明】
-种从农林业木质纤维素生物质为原料制备人造淀粉、纤维 素乙醇及单细胞蛋白的方法
技术领域
[0001] 本发明设及农林业生物质的资源利用领域，具体设及对农林业生物质的生物转化 利用。
【背景技术】
[0002] 随着经济的迅速发展，中国面临着可持续发展与环境保护等多方面的严峻压力。 目前中国境内多数地方饱受雾靈污染，经分析，田地间賴杆焚烧产生的有害气体及颗粒物 是夏秋季节各地雾靈天气的重要污染源，据统计，国内每年田间焚烧賴杆超过1.5亿吨，由 此产生的污染物极大的加剧了雾靈天气的形成。近几年来，为了解决賴杆焚烧问题，各地在 政府的支持下，研究开发了多种賴杆处理和循环利用的新技术，包括饲料加工，焚烧发电， 加工为替代煤炭的生物质能源，制造沼气，加工成有机肥等，但运些技术普遍科技含量较 低，生产成本过高，不能大规模应用W解决賴杆焚烧问题。
[0003] 科学研究发现农作物賴杆中含有许多有机营养物质，是自然界存在量巨大的可再 生资源。我国年产农作物賴杆达5亿吨，其中，除少部分賴杆被用作牛羊等反当动物的饲料 或还田作肥料外，大部分被焚烧、废弃，即造成了资源的巨大浪费，也对环境产生污染。因 此，研究利用賴杆中的有机物质生物转化生产单细胞蛋白、酒精、甘油等产品，变废为宝，对 解决人类面临的能源短缺、蛋白质短缺、环境污染等问题具有重大意义。
[0004] 我国是人口大国，粮食安全是我国基本国策。"国W民为本，民W食为天"，粮食不 仅是关系国计民生最基本的生活资料，更是国家经济安全的重要战略物资。但是目前中国 耕地的生产能力已经接近极限。为满足粮食需求，2014年中国进口量各类谷物和大豆9000 万吨，粮食自给率已经跌到87%。未来粮食增产主要将依靠科技创新。如果能将賴杆中的纤 维素(β-1,4-葡聚糖)转化为淀粉(α葡聚糖），将极大的有助于解决中国的粮食危机问题。
[0005] 乙醇是一种重要的可再生基础工业原料和能源，发展燃料乙醇对于调整我国能源 结构，节约石油资源，从战略上减轻我国对石油进口的依赖程度，提高国家能源供应的安全 具有重要意义。生物乙醇行业目前进入第二代生物乙醇发展阶段。由于第一代生物乙醇W 玉米、甘薦等为原料，引起人们对粮食供应的担忧，能源化工企业开发了第二代生物乙醇。 第二代生物乙醇也称纤维素乙醇，W农林废弃物中所含的纤维素为原料，包括玉米賴杆、玉 米忍、小麦和水稻賴杆、甘薦渣等。纤维素乙醇原料可再生，既不影响粮食供应，也可W充分 利用现有乙醇汽油的基础设施，是公认的绿色能源。但事实上过去几年中，纤维素乙醇在全 球范围内都进展缓慢。根据美国2010年宣布的可再生燃料标准(RFS)，到2022年，美国须生 产160亿加仑/年纤维素乙醇，2011年的目标是2.5亿加仑，可实际上2011年美国纤维素乙醇 的产量仅约660万加仑(2万吨）。中国国内目前仅有一些纤维素乙醇商业化示范装置投产运 行。阻碍纤维素乙醇获得迅速发展的主要因素是成本，在现有的技术条件下，即使加上补 贝占，纤维素乙醇也不具市场竞争力。急需新技术来突破纤维素乙醇商业化瓶颈。
[0006] 单细胞蛋白又称生物菌体蛋白或微生物蛋白，是指酵母菌、真菌、霉菌、非致病性 细菌等单细胞微生物体内所产生的菌体蛋白质，含量为40%~80%。单细胞蛋白饲料不仅蛋白 质含量高，还含有脂肪、碳水化合物、核酸、维生素和无机盐，W及动物机体所必需的各种氨 基酸，特别是植物饲料中缺乏的赖氨酸、蛋氨酸和色氨酸含量较高，生物学价值大大优于植 物蛋白饲料，是饲料添加剂W及人造蛋白食物的重要来源(Mycoprotein)。
[0007] 而农作物賴杆中的纤维素在一定条件下可转化成人造淀粉、乙醇、单细胞蛋白，因 此受到各国科学家的重视。刘剑虹等人研究了酸处理玉米賴杆生物转化单细胞蛋白（《天津 商学院学报》，第21卷第3期，"酸处理玉米賴杆生物转化单细胞蛋白的研究"）;朱均均等人 研究了玉米賴杆生物炼制燃料乙醇(《林产化学与工业》，2011年06期，"玉米賴杆生物炼制 燃料乙醇的研究"）。
[0008] 但现有技术中并未见有关于W农林业纤维素生物质(包括賴杆)为原料，利用微生 物发酵和多酶体系催化反应联合制备人造淀粉、纤维素乙醇和单细胞蛋白的工艺方法及相 关研究。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是利用农林业生物质中的纤维素生产人造淀粉，反应中冗余的葡萄 糖将被工业酵母利用生产乙醇，同时W反应残渣中的酵母为来源提取单细胞蛋白。
[0010] 为实现上述目的，本发明提供一种W农林业生物质为原料发酵制备人造淀粉、纤 维素乙醇及单细胞蛋白的方法，该方法中通过利用微生物发酵和体外多酶体系催化反应联 合发酵的方法，催化农林业生物质中提取的纤维素及其衍生物，从而得到人造淀粉、纤维素 乙醇和单细胞蛋白。该方法具有产物产率和转化率高，生产成本低，无污染等优点。
[0011] 为实现上述目的，本发明所公开的技术方案是:一种W农林业木质纤维素生物质 为原料制备人造淀粉、纤维素乙醇及单细胞蛋白的方法，所述方法包括如下步骤： (1) 原料纤维素提取:将农林业木质纤维素生物质经过预处理得到大量原料纤维素;所 述农林业木质纤维素生物质包括賴杆、木屑； (2) 原料纤维素分解:将原料纤维素作为底物，向其中加入纤维素酶，使原料纤维素分 解，得到纤维二糖、纤维寡糖及少量葡萄糖； (3) 微生物和酶催化体系：向步骤(2)中得到的纤维二糖与纤维寡糖中同时加入酵母、 多酶体系得到联合催化体系;在该联合催化体系中，首先，多酶体系中的酶将所述纤维二糖 转化为葡萄糖-1-憐酸与葡萄糖;然后，葡萄糖-1-憐酸在多酶体系中酶的作用下继续转化 为人造淀粉;葡萄糖被酵母发酵生产纤维素乙醇，在发酵过程中，酵母进行自身繁殖，增殖 的酵母作为单细胞蛋白的来源； (4) 产物提取:将步骤(3)的体系通过适当分离得到人造淀粉、通过蒸馈得到纤维素乙 醇、同时离屯、得到单细胞蛋白。
[0012] 本方案中，葡萄糖被酵母发酵生产纤维素乙醇，并且发酵过程中，酵母自身繁殖W 作为单细胞蛋白的来源;微生物和酶催化后的体系可W通过添加有机溶剂沉淀获得人造淀 粉、通过蒸馈活动获得纤维素乙醇、通过超滤等蛋白纯化方法获得单细胞蛋白。所述人造淀 粉产物包括直链淀粉(α-1,4-葡聚糖，100%)、或支链淀粉(α-1,6-葡聚糖，100%)、或W上两 种淀粉的任意比例的混合物。
[0013] 优选的，所述步骤（1)中的原料纤维素包括再生非结晶纤维素 （regenerated amor地ous cellulose,RAC)、各种经预处理的木质纤维素、利用CO化IF方法处理生物质得 到的纤维素及纤维素衍生物、利用稀酸预处理生物质得到的纤维素及纤维素衍生物。
[0014]优选的，所述步骤(2)中的纤维素酶采用的是去除β-葡萄糖巧酶等外切葡萄糖巧 酶的木霉纤维素酶。
[0015]优选的，所述木霉纤维素酶是混合酶制剂，包括内切葡聚糖酶(endoglucanases， EGs;EC3.2.1.4)和纤维二糖水解酶(cellobiohydrolases，CBHs;EC3.2.1.91)，其中内 切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶的混合比例是0.2-2。本发明中，步骤(2)中的纤维素酶包括 内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶(cellobiohy化olases，CBHs;EC3.2.1.91)，不含β-葡萄 糖巧酶等外切葡萄糖巧酶。
[0016] 优选的，可向所述木霉纤维素酶中添加细菌来源的内切葡聚糖酶和纤维二糖水解 酶，如，枯草杆菌纤维素酶家族5内切酶、梭状芽胞杆菌的纤维酶家族48二糖水解酶;或向所 述木霉纤维素酶中添加真菌来源的内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶。
[0017] 优选的，所述去除外切葡萄糖糖巧酶的木霉纤维素酶，含有内切葡聚糖酶和纤维 二糖水解酶；内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶的混合比例是0.2-5:1,酶用量是1-20 mg每 克纤维素;优选的5 mg每克纤维素。
[0018] 优选的，所述步骤(3)中的酵母采用的酵母菌株为S288C、PJ69、KF-7等酵母菌株中 的至少一种;反应0〇6日日为0.5。
[0019] 优选的，所述步骤（3 )中的多酶体系中包括纤维二糖憐酸化酶（C e 110 b i 0 S e phosphorylase，CBP; EC 2.4.1.20)和日-1,4-葡聚糖憐酸化酶（日1911日-邑111。曰]1 phospho巧lase，PGP; EC 2.4.1.1)。优选的，所述多酶体系中还含有淀粉分支酶。淀粉分支 酶是将合成的直链淀粉中α-1,4-葡聚糖的一部分转移到该α-1,4-葡聚糖链中的某个葡萄 糖残基6位上形成分支的枝链淀粉。
[0020] 本发明方法中纤维二糖憐酸化酶和α-1,4-葡聚糖憐酸化酶的用量均在0. Ι? ο.5mg/mL 之间 。优选的， α-1,4-葡聚糖憐酸化酶 (GP) 优选为来源于 ± 豆的 α-1,4-葡聚糖憐 酸化酶(PGP)。
[0021 ]优选的，本发明多酶体系中需加入无机憐酸缓冲溶液;所述无机憐酸缓冲溶液中 包括如下成分中的至少一种二价阳离子:儀离子、锋离子、儘离子。优选的，所述缓冲溶液的 用量为10-50 mM。进一步优选的，各成分的用量为:无机憐酸根8-10 mM，儀离子5-8 mM，锋 离子或儘离子0.5 -2 mM;更优选的，憐酸钢缓冲液的pH值为5.0-8.0。
[0022] 优选的，所述多酶体系中的纤维二糖憐酸化酶、α-1,4-葡聚糖憐酸化酶W游离态 形式或固定在载体上的形式存在。即，本发明方法中，纤维二糖憐酸化酶和α-1,4-葡聚糖憐 酸化酶可W W游离态形式添加入反应溶液，也可W-者或者两者固定在载体上。优选为，W 两者固定在载体上的形式存在于多酶体系中。更优选为两者固定在酵母表面上进行展示。
[0023] 优选的，所述步骤(3)的联合催化体系的反应条件是25-45Γ溫度条件下反应2- 100小时。进一步优选为，在35-42Γ溫度条件下反应30-36小时。
[0024] 本发明中用于分解原料纤维素的纤维素酶还可W是经过人工调配的无或低β-葡 萄糖巧酶的纤维素水解酶混合酶。如：先将原料纤维素与商业化纤维素酶（例如诺维信 Cellic CTec2)混合，然后离屯、，去上清，得到纤维素酶和纤维素的混合物;所述纤维素酶和 纤维素的混合物中的纤维素酶不含β-葡萄糖巧酶等外切葡萄糖巧酶。
[0025] 本发明方法中首先将賴杆、木屑等农林业生物质经过预处理获得大量易于后续处 理的原料纤维素，然后将原料纤维素为底物，向其中加入纤维素酶将其进行分解，继而向其 中加入酵母菌株和多酶体系，在25-42Γ溫度条件下反应2-100小时，最终得到相应的Ξ种 产物。反应结束后，获得的人造淀粉将是纯的直链淀粉，此时可加入分支酶（Branching Enzyme)将直链淀粉转化为支链淀粉。优选的分支酶的用量为1 U/mL。
[0026] 在本发明方法中，反应包括:经过内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶的作用，原料纤 维素分解为纤维二糖与纤维寡糖等多糖，纤维二糖在纤维二糖憐酸化酶(CBP)进一步作用 下生成等量摩尔数的葡萄糖-1-憐酸(G-1-P)和葡萄糖，葡萄糖-1-憐酸再经过α-1,4-葡聚 糖憐酸化酶(PGP)作用，生成直链淀粉。直链淀粉在分支酶的作用下可进一步形成支链淀 粉。上述反应中冗余的葡萄糖经过工业酵母菌株作用生产乙醇。整个联产过程没有糖底物 的损耗，所W该联产体系能够得到很高的转化率。而高得率和高转化率可W大大降低最终 产物的分离成本。W反应残渣中的酵母为来源提取单细胞蛋白用做饲料，可W进一步提高 反应的经济效益。
[0027] 本发明所述纤维素衍生物还包括纤维素经过预处理后的产物、纤维多糖或纤维二 糖中的任意一种； 其中，纤维素预处理方法有多种，例如酸水解法、酶水解法、物理法等;本发明所述纤维 素经过预处理后的产物，优选为纤维素经过浓憐酸处理(C0SLIF法，美国专利US 8,784， 566,张 W恒等)后的产物。
[0028] 本发明多酶反应体系中的任何一种酶还可W为任何一种具有同等功能的酶所替 换，优选为通过蛋白质工程改造所获得的具有同等功能的突变酶。
[0029] 本发明还公开了一种W农林业木质纤维素为原料制备人造淀粉和纤维素乙醇的 方法，所述方法包括如下步骤：（1)原料纤维素提取:将农林业木质纤维素生物质经过预处 理得到大量原料纤维素;所述农林业木质纤维素生物质包括賴杆、木屑；（2)原料纤维素分 解:将原料纤维素作为底物，向其中加入纤维素酶，使原料纤维素分解，得到纤维二糖、纤维 寡糖及少量葡萄糖；（3)微生物和酶催化体系：向步骤(2)中得到的纤维二糖与纤维寡糖中 同时加入酵母、多酶体系得到联合催化体系;在该联合催化体系中，首先，多酶体系中的酶 将所述纤维二糖转化为葡萄糖-1-憐酸与葡萄糖;然后，葡萄糖-1-憐酸在多酶体系中酶的 作用下继续转化为人造淀粉;葡萄糖被酵母发酵生产纤维素乙醇；（4)产物提取:将步骤(3) 的体系通过适当分离得到人造淀粉、通过蒸馈得到纤维素乙醇。
[0030] 本发明还公开了一种W农林业木质纤维素为原料制备人造淀粉和单细胞蛋白的 方法，所述方法包括如下步骤：（1)原料纤维素提取:将农林业木质纤维素生物质经过预处 理得到大量原料纤维素;所述农林业木质纤维素生物质包括賴杆、木屑；（2)原料纤维素分 解:将原料纤维素作为底物，向其中加入纤维素酶，使原料纤维素分解，得到纤维二糖、纤维 寡糖及少量葡萄糖；（3)微生物和酶催化体系：向步骤(2)中得到的纤维二糖与纤维寡糖中 同时加入酵母、多酶体系得到联合催化体系;在该联合催化体系中，首先，多酶体系中的酶 将所述纤维二糖转化为葡萄糖-1-憐酸与葡萄糖;然后，葡萄糖-1-憐酸在多酶体系中酶的 作用下继续转化为人造淀粉;葡萄糖被酵母发酵生产纤维素乙醇，在发酵过程中，酵母进行 自身繁殖，增殖的酵母作为单细胞蛋白的来源； (4)产物提取:将步骤(3)的体系通过适当分离得到人造淀粉、同时离屯、得到单细胞蛋 白。
[0031] 本发明为利用微生物发酵和体外多酶体系联产催化的方法，将农林业生物质中提 取的纤维素及纤维素衍生物转化为人造淀粉、纤维素乙醇和单细胞蛋白。而人造淀粉是一 种全新的替代性粮食来源，是生物经济的基础原料，也是重要的医药和工业原料。纤维素乙 醇则是一种重要的可再生基础工业原料和能源。
[0032] 本发明技术方案与现有技术相比，具有W下有益效果： (1) 原材料取材于废弃生物质(賴杆、木屑等），来源丰富且价格低廉。 (2) 通过联产来生产Ξ种产物:人造淀粉、纤维素乙醇和单细胞蛋白，成本控制的优势 显著，经济可行性高，解决目前单独生产纤维素乙醇效益差的难题。
[0033] (3)生产周期短，特别是人造淀粉生产周期只需要1周甚至更短的时间，远低于传 统农林业作物生长周期（3个月~1年），意味着在极端情况下（自然灾害甚至战争)联产技 术可W短时间内大量生产人造粮食，W应对可能的粮食短缺。
[0034] (4)生产过程绿色环保，不占用农林业耕地，耗水、耗能低，不需要化肥，除草剂，杀 虫剂等;适应目前国家大力发展绿色产业的需求。
[0035] 本发明技术可能导致现代农林业的新革命--从种植单年生的粮食作物到种植多 年生的高产非粮植物，W此为人造粮食来源。
[0036] 本发明方法具有简便，原料利用率高、产物产率高，生产成本低，污染低等优点，可 W实现人造淀粉、纤维素乙醇和单细胞蛋白的规模化生产。
[0037] 本发明所设及到的术语及定义 除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通 技术人员通常所了解相同的含义。
[0038] 术语"微生物发酵反应"意指W微生物为催化剂进行的体内化学反应。
[0039] 术语"酶催化反应"意指在生物催化剂-酶作用下进行的化学反应。
[0040] 术语"葡萄糖多聚物"意指葡萄糖分子聚合而成的淀粉或纤维素。
[0041]
【附图说明】
[0042] 图1为本发明中农林业生物质纤维素转化为人造淀粉、纤维素乙醇和单细胞蛋白 人造的联产催化途径的示意图；其中，CBP:纤维二糖憐酸化酶;PGP:a-l ,4-葡聚糖憐酸化 酶。
[0043] 图2:图2a为反应溫度为30°C的产物分析图；图2b为反应溫度为50°C的产物分析 图。图中黑线为未经处理的商业化纤维素酶的HPLC产物分析曲线，红线为经处理的商业化 纤维素酶(移除葡萄糖巧酶等外切纤维素酶)的HPLC产物分析曲线。
[0044] 图3 是pYDl-Scaf3，pYDl-CBP-RfDoc-His，pYDl-His-CtDoc-PGP质粒示意图。
[0045] 图4是实验例2中的蛋白质纯化的结果。
[0046] 图5是人造淀粉分析检测图。
[0047]
【具体实施方式】
[0048] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域 技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可W对本发明技术方案的细节和 形式进行修改或替换，但运些修改或替换均落入本发明的保护范围。
[0049 ]请参考附图1至附图5，本发明实施例包括： 实施例1: 一种W农林业木质纤维素生物质为原料制备人造淀粉、纤维素乙醇及单细胞 蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：（0原料纤维素提取:将农林业木质纤维素生物质经 过预处理得到原料纤维素;所述农林业木质纤维素生物质包括賴杆、木屑；（2)原料纤维素 分解:将原料纤维素作为底物，向其中加入纤维素酶，使原料纤维素分解，得到纤维二糖、纤 维寡糖及少量葡萄糖；（3)微生物和酶催化体系：向步骤(2)中得到的纤维二糖与纤维寡糖 中同时加入酵母、多酶体系得到联合催化体系;在该联合催化体系中，首先，多酶体系中的 酶将所述纤维二糖转化为葡萄糖-1-憐酸与葡萄糖;然后，葡萄糖-1-憐酸在多酶体系中酶 的作用下继续转化为人造淀粉;葡萄糖被酵母发酵生产纤维素乙醇，在发酵过程中，酵母进 行自身繁殖，增殖的酵母作为单细胞蛋白的来源；（4)产物提取:步骤(3)的体系通过适当分 离得到人造淀粉、通过蒸馈得到纤维素乙醇、同时离屯、得到单细胞蛋白。
[0050] 本实施例中，步骤（1)中的原料纤维素包括再生非结晶纤维素(RAC)、各种经预处 理的木质纤维素、利用C0化IF方法处理生物质得到的纤维素及纤维素衍生物、利用酸解方 法处理后的玉米賴杆等生物质得到的纤维素及纤维素衍生物。
[0051] 本实施例中，步骤(2)中的纤维素酶采用的是去除β-葡萄糖巧酶等外切葡萄糖巧 酶的木霉纤维素酶;所述木霉纤维素酶是混合酶制剂，包括内切葡聚糖酶和纤维二糖水解 酶，所述内切葡聚糖酶包括BsCel5和TrCel5A;所述纤维二糖水解酶包括CpCel9和CpCel48。
[0052] 本实施例中，步骤(3)中的酵母采用的酵母菌株为S288C、PJ69、KF-7等酵母菌株中 的至少一种;反应0D600为0.5。
[0053] 本实施例中，步骤(3)中的多酶体系中包括纤维二糖憐酸化酶、α-1,4-葡聚糖憐酸 化酶和无机憐酸缓冲溶液，其中，无机憐酸缓冲溶液包括如下成分中的至少一种:儀离子、 锋离子、儘离子。其中儀离子是二价儀离子。
[0054] 实施例2:本实施例中所述的W农林业木质纤维素生物质为原料制备人造淀粉、纤 维素乙醇及单细胞蛋白的方法中，可向所述木霉纤维素酶中添加细菌来源的内切葡聚糖酶 和纤维二糖水解酶，如，枯草杆菌纤维素酶家族5内切酶、梭状芽胞杆菌的纤维酶家族48二 糖水解酶;或向所述木霉纤维素酶中添加真菌来源的内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶。
[0055] 实施例3:本实施例与实施例1的不同之处在于，本实施例中，步骤(3)的联合催化 体系的反应条件是25-45Γ溫度条件下反应10-100小时。
[0056] 实施例4:本实施例与实施例1的不同之处在于，本实施例中，所述多酶体系中的纤 维二糖憐酸化酶、α-1,4-葡聚糖憐酸化酶W游离态形式或固定在载体上的形式存在。
[0057] 实施例5:-种W农林业木质纤维素生物质为原料制备人造淀粉、纤维素乙醇及单 细胞蛋白的方法，在该方法中，W重生的非晶形的纤维素 （pretreated Avicel regenerated amor地ous cellulose，RAC)为底物，底物的量为10-50g/L，向其中加入经过 人工调配的用量为20-50mg/g底物的商业纤维素水解酶混合酶(无或低beta糖巧酶），用量 为0.2mg/mL的纤维二糖憐酸化酶，用量为0.2mg/mL的α-1，4-葡聚糖憐酸化酶和反应起始 0D600为0.5的酵母，在30-45 °C进行联产催化反应，反应时间36h，最终人造淀粉的转化率为 33%~36%(wt/wt)，平均聚合度为200糖单元;纤维素乙醇的转化率为~28%(wt/wt)，干燥后 反应残渣粗蛋白含量为3.6 g/ml。
[0058] 实施例6:本实施例W玉米賴杆等生物质为底物联产催化将纤维素转化为人造淀 粉、纤维素乙醇和单细胞蛋白。具体操作是：WC0化IF方法处理后的玉米賴杆等生物质为底 物，底物浓度为40 g/L，向其中加入经过人工调配的用量为20-50mg/g底物商业纤维素水解 酶混合酶(无或低be化糖巧酶），用量为0.2 mg/mL的纤维二糖憐酸化酶，用量为0.2 g/L的 曰-1,4-葡聚糖憐酸化酶和酵母，在25-45Γ进行联产催化反应，反应36小时时间，最终人造 淀粉的转化率为26%(w/w)，平均聚合度为150糖单元;生物乙醇的转化率为15%(w/w)，干燥 后反应残渣粗蛋白含量为2.3 g/mL。
[0059] 实施例7:本实施例通过联产催化方法将纤维素转化为人造淀粉、纤维素乙醇和单 细胞蛋白。具体操作如下：W酸解方法处理后的玉米賴杆等生物质为底物，底物的浓度为40 g/L，向其中加入经过人工调配的用量为20-50 mg/g底物的商业纤维素水解酶混合酶，用量 为0.2 mg/mL的纤维二糖憐酸化酶，用量为0.2 mg/mL的α-1,4-葡聚糖憐酸化酶和酵母，在 40°C进行联产催化反应，反应36小时时间，最终人造淀粉的转化率为15%(w/w)，平均聚合度 为150糖单元;生物乙醇的转化率为13%(w/w)，干燥后反应残渣粗蛋白含量为1.6 g/mL。
[0060] 实施例8:-种W农林业木质纤维素为原料制备人造淀粉和纤维素乙醇的方法，所 述方法包括如下步骤:（1)原料纤维素提取:将农林业木质纤维素生物质经过预处理得到原 料纤维素;所述农林业木质纤维素生物质包括賴杆、木屑；（2)原料纤维素分解:将原料纤维 素作为底物，向其中加入纤维素酶，使原料纤维素分解，得到纤维二糖、纤维寡糖及少量葡 萄糖；（3)微生物和酶催化体系：向步骤(2)中得到的纤维二糖与纤维寡糖中同时加入酵母、 多酶体系得到联合催化体系;在该联合催化体系中，首先，多酶体系中的酶将所述纤维二糖 转化为葡萄糖-1-憐酸与葡萄糖;然后，葡萄糖-1-憐酸在多酶体系中酶的作用下继续转化 为人造淀粉;葡萄糖被酵母发酵生产纤维素乙醇；（4)产物提取:步骤(3)的体系通过适当分 离得到人造淀粉、通过蒸馈得到纤维素乙醇。
[0061] 实施例9: 一种W农林业木质纤维素为原料制备人造淀粉和单细胞蛋白的方法，所 述方法包括如下步骤:（1)原料纤维素提取:将农林业木质纤维素生物质经过预处理得到原 料纤维素;所述农林业木质纤维素生物质包括賴杆、木屑；（2)原料纤维素分解:将原料纤维 素作为底物，向其中加入纤维素酶，使原料纤维素分解，得到纤维二糖、纤维寡糖及少量葡 萄糖；（3)微生物和酶催化体系：向步骤(2)中得到的纤维二糖与纤维寡糖中同时加入酵母、 多酶体系得到联合催化体系;在该联合催化体系中，首先，多酶体系中的酶将所述纤维二糖 转化为葡萄糖-1-憐酸与葡萄糖;然后，葡萄糖-1-憐酸在多酶体系中酶的作用下继续转化 为人造淀粉;葡萄糖被酵母发酵生产纤维素乙醇，在发酵过程中，酵母进行自身繁殖，增殖 的酵母作为单细胞蛋白的来源；（4)产物提取:步骤(3)的体系通过适当分离得到人造淀粉、 同时离屯、得到单细胞蛋白。
[00创实验例： 实验材料 祀了2013载体，齡￥日旨日]1，]\1日山3〇]1，胖1; 大肠杆菌表达菌化2UDE3)，Invitrogen，化!· 1 sbad，CA; 酵母菌株为工业菌株S288C，从美国ATCC公司购买； 本发明中的大部分酶(除了纤维二糖憐酸化酶，α-1，4-葡聚糖憐酸化酶)能在Novozyme (诺维信）、Sigma等公司购买得到;但是都可W按照基因工程方法通过原核表达获得； 纤维素酶从Novozyme(诺维信)公司购买，产品编号为50013; α淀粉酶从Sigma公司购买，产品编号为10065; Avicel，微晶形纤维素，从Sigma公司购买，产品编号为11365。
[0063] 实验例1.移除葡萄糖巧酶的混合纤维素酶能显著提高将纤维素转化为纤维二糖 的得率 通过一个体外多酶催化体系将纤维素转化为纤维二糖（图1)，人造纤维二糖是生产人 造淀粉与乙醇的前体，因此纤维二糖的生产效率直接决定了下游产品的生产效率。
[0064] 此纤维素水解酶混合酶体系关键酶包括：（1)内切葡聚糖酶（endoglucanases， EGs; EC 3.2.1.4)，将可溶性纤维素水解成还原性的寡糖;所述内切葡聚糖酶包括(但不局 限于）BsCel5和TrCel5A，其中BsCel5来源于公acinus 属于糖巧水解酶第5家 族；TrCelSA来源于 SjOjO. ; (2)纤维二糖水解酶（cellobiohy化olases，CBHs ; EC 3.2.1.91)，将寡糖水解成纤维二糖;所述纤维二糖水解酶包括(但不局限于)CpCel9， CpCel48和T;rCel7ADCpCel9和CpCel48均来源于C Josiric/it/m 如jio/ermenians 分属纤维 二糖水解酶第9家族和第48家族;TrCel7A来源于Γ WcAoc/ erma巧。
[0065] 此纤维素水解酶混合酶另一种来源：经过人工调配的商业纤维素水解酶混合酶 (无或低beta糖巧酶）。如:将商业纤维素酶(诺维信50013 20mg/g Avicel)和Avicel (10 g/L)在冰水浴上混合，放置于冰水浴中5分钟，在4°C离屯、，去上清。沉淀为纤维素和能与纤 维素结合的纤维素酶的混合物。该处理能够去除商业化纤维素酶中几乎所有的葡萄糖巧 酶，运样可W避免葡萄糖巧酶水解纤维二糖生成大量的葡萄糖，从而使主要的水解产物是 纤维二糖和纤维多糖。
[0066] 本实验采用微晶形纤维素 Avicel为底物。
[0067] 具体实验内容： 实验组1:在一个0.5毫升的反应体系中含有50 mmol的憐酸钢缓冲液(pH 6.0)，内切葡 聚糖酶BsCel5和TrCel5A各0.2 mg/血，纤维二糖水解酶中CpCel48和CpCel9各0.1 mg/ mL, T;rCel7A 0.4 mg/mL, lOg/L的Avicel,在30°C进行催化反应，反应36个小时。产物通过 HPLC进行分析检测。
[006引实验组2:在一个0.5毫升的反应体系中含有50 mmol的憐酸钢缓冲液(pH 6.0)， lOg/L的Avicel,移除了葡萄糖巧酶等外切纤维素酶的商业化纤维素酶（诺维信50013， 20mg/g Avicel)，在30°C进行催化反应，反应36个小时。产物通过HPLC进行分析检测，检测 结果见图2a)。
[0069]将实验组1与实验组2结果对比，见表1，对比发现，与含有葡萄糖巧酶等外切纤维 素酶的纤维素多酶体系相比较，不含有葡萄糖巧酶等外切纤维素酶的多酶体系能显著提高 产物纤维二糖的生成(提高35%);与此同时，另一个产物葡萄糖则大幅下降63%，说明移除葡 萄糖巧酶后，纤维素的降解反应向生成纤维二糖的方向进行。
[0070] 实验组3:在一个0.5毫升的反应体系中含有50 mmol的憐酸钢缓冲液(pH 6.0)，内 切葡聚糖酶BsCel5h和TrCel5A各0.2 mg/mL,纤维二糖水解酶中CpCel48和CpCel9各0.1 mg/mL, T;rCel7A 0.4 mg/mL, lOg/L的Avicel，在30°C进行催化反应，反应36个小时。产物 通过HPLC进行分析检测。
[0071] 实验组4:在一个0.5毫升的反应体系中含有50 mmol的憐酸钢缓冲液(pH 6.0)， lOg/L的Avicel，移除了葡萄糖巧酶等外切纤维素酶的商业化纤维素酶（诺维信50013， 20mg/g Avicel)，在50°C进行催化反应，反应36个小时。产物通过HPLC进行分析检测，检测 结果见图化。
[0072] 将实验组3与实验组4结果对比，见表2,结果发现，反应溫度从30°C提高到50°C后， 与含有葡萄糖巧酶等外切纤维素酶的纤维素多酶体系相比较，不含有葡萄糖巧酶等外切纤 维素酶的多酶体系能显著提高产物纤维二糖的生成(提高3.5倍）；与此同时，另一个产物葡 萄糖则大幅下降，仅为前者的19%，说明溫度对纤维二糖的生产影响显著。
[0073] 表 1
实验例2.酵母与体外多酶催化将纤维二糖转化为直链淀粉和乙醇 通过一个酵母与体外多酶联产催化体系将纤维二糖转化为直链淀粉和乙醇（图1)。酵 母菌株为S288C;关键酶包括：（1)纤维二糖憐酸化酶(cellobiose地OS地or}dase，CBP; EC 2.4.1.20)，将纤维二糖水解成葡萄糖和葡萄糖-1-憐酸，纤维二糖憐酸化酶来源于 CJosiri山't/ffl iAermoceJJt/m ; (2)日-1,4-葡聚糖憐酸化酶（alpha-glucan 曲OS地or}dase， 曰-1，4-GP; EC 2.4.1.1)，将葡萄糖-1-憐酸单体与麦芽糊精如-1，4糖巧键结合，组装成直 链淀粉。日-1,4-葡聚糖憐酸化酶来源于Solanum Uiberosum。运些基因组DNA都可从ATCC的 官方网站(WWW. atcc.org)上获得。
[0074] 纤维二糖憐酸化酶与α-1,4-葡聚糖憐酸化酶的相应基因分别用不同的引物从相 应的基因组DNA中通过PCR获取，并通过Simple Cloning(化U，C.，et al. (2012)的方法 克隆至pYDl载体(Novagen, Madison, WI，图3)中，获得相应的表达载体口￥01-〔8口-1^)〇(3- 則3,9￥01-^3-(：10〇(3-?6?。运两个质粒都转化至大肠杆菌表达菌化21(063) (Invihogen, Carlsbad, CA)中，并进行蛋白质表达与纯化，蛋白质纯化的结果如图4所 示。图4表示：纤维二糖憐酸化酶（CBP)、a-l，4-葡聚糖憐酸化酶（a-PGP)和桥梁蛋白 Scaffodin(Scaf)的SDS表达检测（第1，2,3列）<XBP和PGP携带特异的dockrin结构域，可W 与Scaf蛋白上的cohesin结构域牢固结合，从而帮助CBP和PGP结合到Scaf上。
[0075] 本实验采用重生的非晶形的纤维素 RAC为底物。
[0076] 实验组1:在一个0.5毫升的反应体系中含有50mM的憐酸钢缓冲液(pH 6.0)，20g/L 的RAC，酵母菌株反应ODsgg为0.5;纤维二糖憐酸化酶和α-1，4-葡聚糖憐酸化酶均为0.2mg/ ml。
[0077] 对照组1:该反应体系与实验组1相比，不添加酵母，其余条件不变。
[0078] 实验组1与对照组1的联产催化反应的条件均是在40°C反应36小时。
[0079] 在该实验例中，人造淀粉的定性和定量分析可W通过舰显色反应，NMR和FTIR检测 方法。图5a中，1号管为RAC溶液与舰的混合溶液(无显色反应），2号管为经RA邱華解转化的人 造直链淀粉与舰的混合溶液，人造直链淀粉与舰发生显色反应，所W呈现蓝色。图加中，人 造直链淀粉样品经NMR分析，得到与淀粉标准样品一致的曲线模式。图5c中，来源于纤维素 的人造直链淀粉溶液经有机相(乙醇)沉淀后，再冷冻干燥后的产物，约0.5克。
[0080] 实验组1与对照组1的结果对比见表3.结果显示，反应体系不添加酵母，终产物没 有乙醇的生成，纤维素糖原转化率、直链淀粉的浓度和得率均较低。反应体系添加酵母，终 产物有乙醇的生成，得率约为28%(wt/wt)，并且纤维素糖原降解率、直链淀粉的浓度和得率 均有所提高。原因在于纤维二糖憐酸化酶酶解纤维二糖时，生成葡萄糖作为副产物，其中的 葡萄糖是纤维二糖憐酸化酶的有效抑制因子，集聚的葡萄糖会抑制反应继续向纤维二糖憐 酸解的方向进行。通过反应体系中添加酵母，酵母利用葡萄糖生产乙醇，就解除了葡萄糖的 抑制反应，可W进一步促进纤维二糖的憐酸解，提高最终获得的直链淀粉的产量。
[0081] 该实验例中，人造淀粉的单体聚合度为~200。干燥后反应残渣粗蛋白含量为 3.6g/ml。
[0082] 表 3
实验例3.纤维二糖憐酸化酶与葡聚糖憐酸化酶固定在酵母表面，利用此催化体系将 纤维素转化为直链淀粉与乙醇 实验例2中，纤维二糖憐酸化酶与葡聚糖憐酸化酶是W游离态形式添加于反应体系中， 本实验尝试将纤维二糖憐酸化酶与葡聚糖憐酸化酶固定在一个载体上，优选为固定在酵母 表面。
[0083] 纤维二糖憐酸化与α-1,4-葡聚糖憐酸化酶的相应基因，W及来源于C如別ri扣? iAermoceJJt/m和7?t/minococct/s /Jaw/aciaos的dockerin序列分别用不同的引物从相应 的基因组DNA中通过PCR获取，并通过Simple Cloning(化U，C.，et al. 2012 )的方法克 隆至pYDl载体上(Novagen，Madison, WI，图3)中，获得相应的表达载体口￥01-〔8口-3巧〇(3- His，pYDl-His-CtDoc-PGP。酵母表面展示载体pYDl-Scaf3含有Ξ个分别来源于 Clostridium thermoce11 urn,Ruminococcus flavefaciens与Clostridium ceJJt/Jorarans的cohensin序列，pYDl-Scaf3的载体构建也采用前述的Simple Cloning方 法。运Ξ个质粒都转化至大肠杆菌表达菌化21(DE3) (Invitrogen, Carlsbad, CA)中，并 进行蛋白质表达与纯化，蛋白质纯化的结果如图4所示。
[0084] pYDl-Sca巧通过热击法转入酵母。酵母0D6日日为0.5，固定化纤维二糖憐酸化酶和 α-1，4-葡聚糖憐酸化酶均为0.2mg/ml。蛋白在酵母表面展示的结果如图1所示。
[0085] 本实验采用重生的非晶形的纤维素 RAC为底物。
[0086] 实验组1:在一个0.5毫升的反应体系中含有50mM的憐酸钢缓冲液(pH 6.0)，20g/L 的RAC，酵母菌株反应ODs日日为0.5; 对照组1:该对照组与实验组1相比，反应体系中为游离态的纤维二糖憐酸化酶和曰-1， 4-葡聚糖憐酸化酶，均为0.2mg/ml，其余条件不变。
[0087] 实验组1与对照组1的联产催化反应的条件均是在40°C反应36小时。
[0088] 实验组1与对照组1的结果见表4。结果表明，与游离态的多酶体系相比较，固定在 酵母表面的多酶体系能提高直链淀粉的产量和得率，对乙醇的产量和得率也略有帮助。原 因是同一酶联反应途径的多酶固定在相邻的位置时，能提供酶联反应的空间效应，即反应 途径中的中间产物能更快速的被临近的酶所利用，提高整个反应途径的速率和产物的得 率。
[0089] 本实验例3中，干燥后反应残渣粗蛋白含量均为~3.5g/ml。
[0090] 表 4
' 实验例4.利用酵母/多酶体系，联合催化多种生物质底物I ' 本实验底物有:重生的非晶形的纤维素 RAC，浓度为20g/l;利用C0化IF方法处理后的玉 米賴杆(Rollin, JA., etal. (2011)，浓度为40旨凡;经过稀酸(diluted acid)预处理的 玉米賴杆从美国可再生能源实验室获得，浓度为40g/L。
[0091] 纤维二糖憐酸化酶，葡聚糖憐酸化酶W及酵母表面错定蛋白Scaf3的转化与表达 同实验例3,蛋白在酵母表面上固定的操作同实验例3。
[0092] 实验组1:在一个0.5毫升的反应体系中含有50 mmo 1的憐酸钢缓冲液(pH=6.0)，酵 母菌株反应ODsgg为0.5;固定化纤维二糖憐酸化酶和α-1，4-葡聚糖憐酸化酶均为0.2mg/ml， 反应底物为20g/L的RAC; 实验组2:在一个0.5毫升的反应体系中含有50 mmol的憐酸钢缓冲液(pH=6.0)，酵母菌 株反应ODsgg为0.5;固定化纤维二糖憐酸化酶和α-1，4-葡聚糖憐酸化酶均为0.2mg/ml，反应 底物为40g/L的C0化IF-玉米賴杆； 实验组3:在一个0.5毫升的反应体系中含有50 mmol的憐酸钢缓冲液(pH=6.0)，酵母菌 株反应ODsgg为0.5;固定化纤维二糖憐酸化酶和α-1，4-葡聚糖憐酸化酶均为0.2mg/ml，反应 底物为40g/L的酸解玉米賴杆。
[0093] 上述Ξ个实验组的联产催化反应的条件均是在40°C反应36小时。
[0094] Ξ个实验组的实验结果见表5,结果表明，w CO化IF方法和酸解处理后的玉米賴 杆的纤维素糖原降解率均不如RAC，相应的，W此巧巾玉米賴杆为底物生产的直链淀粉和乙 醇浓度或得率均弱于WRAC为底物的相应指标。此巧巾玉米賴杆底物相比较，酸解玉米賴杆 的乙醇得率则相对更好一些。
[00巧]表5
' 实验例5.调整酶与酵母的浓度比例，可W获得不同的产物比例胃 ' 在前述实验例的基础上，本实验例通过调整酶与酵母的浓度比例，可W获得不同的产 物比例。
[0096] 本实验底物:重生的非晶形的纤维素 RAC，浓度为20g/L。
[0097] 纤维二糖憐酸化酶，葡聚糖憐解酶W及酵母错定蛋白Scaf3的转化与表达同实验 例3,蛋白在酵母表面上展示的操作同实验例3。
[009引实验组1:在一个0.5毫升的反应体系中含有50 mmol的憐酸钢缓冲液(pH=6.0)，酵 母菌株反应OD600为0.5;固定化纤维二糖憐酸化酶(CBP)和α-1，4-葡聚糖憐酸化酶(PGP)的 浓度为0. 05mg/ml;反应底物为20g/L的RAC。
[0099] 实验组2:在一个0.5毫升的反应体系中含有50 mmol的憐酸钢缓冲液(pH=6.0)，酵 母菌株反应OD600为0.5;固定化纤维二糖憐酸化酶(CBP)和α-1，4-葡聚糖憐酸化酶(PGP)的 浓度为0.2mg/ml;反应底物为20g/L的RAC。
[0100] 实验组3:在一个0.5毫升的反应体系中含有50 mmol的憐酸钢缓冲液(pH=6.0)，酵 母菌株反应OD600为0.5;固定化纤维二糖憐酸化酶(CBP)和α-1，4-葡聚糖憐酸化酶(PGP)的 浓度为0.5mg/ml;反应底物为20g/L的RAC。
[0101] 分别调整^个实验组的〔8?与?6?蛋白酶浓度为:0.05111旨/1111、0.2111旨/1111、0.5111邑/ ml，进行反应。Ξ个实验组的联产催化反应的条件均是在40°C反应36小时。
[0102] 结果表明，当Ξ个实验组的反应数据结果见表6。可见，CBP与PGP蛋白酶浓度是前 述实验例的25%时(0.05mg/ml)时，联产反应是倾向于乙醇生产的。运是因为浓度较低的CBP 与PGP分解纤维二糖的速率下降，造成纤维二糖的冗余，一方面影响了直链淀粉产物的合 成，另一方面也影响了纤维素糖原的降解。
[0103] 当Ξ个实验组的CBP与PGP蛋白酶浓度是前述实验例的2.5倍时(0. 5mg/ml)，蛋白 浓度的增加对纤维素糖原降解率与直链淀粉浓度的效果并不显著，表明WRAC为底物时，增 加 CBP与PGP蛋白酶所产生的溢出效果已经饱和。增加 CBP与PGP蛋白酶对WC0化IF方法和酸 解处理后的玉米賴杆为底物的增强效果需进一步分析。
[0104] 从表6中可得，不同蛋白酶浓度下单细胞蛋白产物的浓度变化不大，表明酵母对葡 萄糖的利用效率受CBP与PGP蛋白酶的影响较小。
[0105] 不同蛋白酶浓度下3种产物（直链淀粉、生物乙醇与单细胞蛋白）的比例如表7所 /J、- 〇
[0106] 表6
实验例6.支链淀粉的合成 前述实验例中人造淀粉均为直链淀粉(α-1,4-葡聚糖），本实验例通过添加分支酶将直 链淀粉进一步转化为支链淀粉(含α-1，6分支的葡聚糖）。
[0107] 本实验底物:重生的非晶形的纤维素 RAC，浓度为20g/L。
[0108] 纤维二糖憐酸化酶，葡聚糖憐酸化酶W及酵母展示蛋白Scaf3的转化与表达同实 验例3,蛋白在酵母表面上展示的操作同实验例3。
[0109] 分支酶（Branching Enzyme)来源于 K iArio ra山3i/ict/s。
[0110] 具体实验内容：在一个0.5毫升的反应体系中含有50 mmol的憐酸钢缓冲液(pH 6.0)，不含葡萄糖巧酶的商业纤维素酶为20 mg/g Avicel，酵母菌株反应OD600为0.5;固定 化纤维二糖憐酸化酶和α-1，4-葡聚糖憐酸化酶均为0.2mg/ml，分支酶为lU/ml，反应底物为 20g/L的RAC。所述联产催化反应的条件是在40°C反应36小时。
[0111] 反应结束后，最终人造淀粉(直链淀粉+支链淀粉)的终浓度是5.8g/L，得率为35%， 详见图5。图5是人造淀粉的检测示意图，其中图5a: 1号试管:人造淀粉合成反应液上清;2号 试管:人造淀粉合成反应液上清+舰液，深蓝色表明有直链淀粉合成;3号试管:人造淀粉合 成反应液上清+分支酶+舰液，深蓝色稱去表明直链淀粉转化为支链淀粉。图5b:人造淀粉 醒R分析。人造淀粉样品经NMR分析，得到与淀粉标准样品一致的曲线模式。图5c:乙醇沉淀 并冷冻干燥后的人造淀粉粉末。
[0112] 根据化kata Η 1996年文献所述的方法来确定人造的葡聚糖是否有分支结构，W 及人造的葡聚糖的平均单元链的长度。结果证实人造的葡聚糖具有分支结构，平均单元链 的长度为20左右。结果表明在多酶复合体中除了纤维二糖憐酸化酶和葡聚糖憐解酶，再加 入分支酶能从纤维素生产具有分支结构的葡聚糖。
【主权项】
1. 一种以农林业木质纤维素生物质为原料制备人造淀粉、纤维素乙醇及单细胞蛋白的 方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： (1) 原料纤维素提取:将农林业木质纤维素生物质经过预处理得到原料纤维素;所述农 林业木质纤维素生物质包括秸杆、木肩； (2) 原料纤维素分解:将原料纤维素作为底物，向其中加入纤维素酶，使原料纤维素分 解，得到纤维二糖、纤维寡糖及少量葡萄糖； (3) 微生物和酶催化体系：向步骤(2)中得到的纤维二糖与纤维寡糖中同时加入酵母、 多酶体系得到联合催化体系;在该联合催化体系中，首先，多酶体系中的酶将所述纤维二糖 转化为葡萄糖-1-磷酸与葡萄糖;然后，葡萄糖-1-磷酸在多酶体系中酶的作用下继续转化 为人造淀粉;葡萄糖被酵母发酵生产纤维素乙醇，在发酵过程中，酵母进行自身繁殖，增殖 的酵母作为单细胞蛋白的来源； (4) 产物提取:步骤(3)的体系通过适当分离得到人造淀粉、通过蒸馏得到纤维素乙醇、 同时离心得到单细胞蛋白。2. 根据权利要求1所述的以农林业木质纤维素生物质为原料制备人造淀粉、纤维素乙 醇及单细胞蛋白的方法，其特征在于，步骤（1)中的原料纤维素包括再生非结晶纤维素、各 种经预处理的木质纤维素、利用COSLIF方法处理生物质得到的纤维素及纤维素衍生物、利 用稀酸预处理生物质得到的纤维素及纤维素衍生物。3. 根据权利要求1所述的以农林业木质纤维素生物质为原料制备人造淀粉、纤维素乙 醇及单细胞蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的纤维素酶采用的是去除β-葡萄糖苷 酶等外切葡萄糖苷酶的木霉纤维素酶。4. 根据权利要求3所述的以农林业木质纤维素生物质为原料制备人造淀粉、纤维素乙 醇及单细胞蛋白的方法，其特征在于，所述木霉纤维素酶是混合酶制剂，包括内切葡聚糖酶 和纤维二糖水解酶，其中内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶的混合比例是0.2-2。5. 根据权利要求4所述的以农林业木质纤维素生物质为原料制备人造淀粉、纤维素乙 醇及单细胞蛋白的方法，其特征在于，可向所述木霉纤维素酶中添加细菌来源的内切葡聚 糖酶和纤维二糖水解酶，如，枯草杆菌纤维素酶家族5内切酶、梭状芽胞杆菌的纤维酶家族 48二糖水解酶；或向所述木霉纤维素酶中添加真菌来源的内切葡聚糖酶和纤维二糖水解 酶。6. 根据权利要求1所述的以农林业木质纤维素生物质为原料制备人造淀粉、纤维素乙 醇及单细胞蛋白的方法，其特征在于，所述步骤（3)中的酵母采用的酵母菌株为S288C、 PJ69、KF-7等酵母菌株中的至少一种。7. 根据权利要求1所述的以农林业木质纤维素生物质为原料制备人造淀粉、纤维素乙 醇及单细胞蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的多酶体系中包括纤维二糖磷酸化酶 和α-1，4-葡聚糖磷酸化酶。8. 根据权利要求1所述的以农林业木质纤维素生物质为原料制备人造淀粉、纤维素乙 醇及单细胞蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(3)多酶体系中包括淀粉分支酶。9. 根据权利要求8所述的以农林业木质纤维素生物质为原料制备人造淀粉、纤维素乙 醇及单细胞蛋白的方法，其特征在于，所述多酶体系中加入无机磷酸缓冲溶液，所述无机磷 酸缓冲溶液中包括如下成分中的至少一种二价阳离子:镁离子、锌离子、锰离子。10. 根据权利要求7中所述的以农林业木质纤维素生物质为原料制备人造淀粉、纤维素 乙醇及单细胞蛋白的方法，其特征在于，所述多酶体系中的纤维二糖磷酸化酶、α-1，4_葡聚 糖磷酸化酶以游离态形式或固定在载体上的形式存在。11. 根据权利要求1所述的以农林业木质纤维素生物质为原料制备人造淀粉、纤维素乙 醇及单细胞蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(3)的联合催化体系的反应条件是25-45Γ 温度条件下反应2-100小时。12. -种以农林业木质纤维素为原料制备人造淀粉和纤维素乙醇的方法，其特征在于， 所述方法包括步骤（1)、（2)、（3)、（4)，其中步骤（1)、（2)、（3)的操作与权利要求1中的步骤 (1)、（2)、（3)相同；所述步骤(4)将所述步骤(3)的体系通过适当分离得到人造淀粉，并通过 蒸馏得到纤维素乙醇。13. -种以农林业木质纤维素为原料制备人造淀粉和单细胞蛋白的方法，其特征在于， 所述方法包括步骤（1)、（2)、（3)、（4)，其中步骤（1)、（2)、（3)的操作与权利要求1中的步骤 (1)、（2)、（3)相同；所述步骤(4)将所述步骤(3)的体系通过适当分离得到人造淀粉、同时离 心得到单细胞蛋白。
【文档编号】C12N1/16GK106011198SQ201610425023
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月16日
【发明人】张以恒, 马晖, 张伟, 游淳, 徐欣欣, 马延和
【申请人】桐庐唐赢生物科技有限公司