一种桃及其近缘种植物的根癌病抗性鉴定方法
【专利摘要】本发明涉及一种桃及其近缘种植物的根癌病抗性鉴定方法，在桃树旺盛生长季节选取茎粗5～15mm一年生枝条，用锋利的裁纸刀在茎部从上向下刻8～10mm长、5～8mm宽、深及木质部的伤口，继而在伤口内平行切面夹入1～2片蘸有109cfu·mL?1致病农杆菌菌液的圆滤纸片，随后用封口膜在刻伤上部缠裹，将刻伤复位。进行自来水喷雾30分钟，制造合适的发病环境。接种后30～90天，用游标卡尺调查各接种部位的最大瘤径、接种位点上、下两端茎粗、计算瘤径比。根据瘤径比划分抗性等级，确定材料的根癌病抗性等级。该方法操作简单，利用刻伤皮层复位提高侵染效率，抗性评价考虑了待鉴定材料的种属及生长状态差异，能够比较准确地评价桃及其近缘种材料对根癌病的抗性等级。
【专利说明】
-种桃及其近缘种植物的根癌病抗性鉴定方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种植物病害抗性鉴定方法，具体为一种桃及其近缘种植物的根癌病 抗性鉴定方法。
【背景技术】
[0002] 桃及其近缘种植物主要为核果类果树，在生产上其根系常常遭受根癌农杆菌引起 的根癌病危害，造成巨大的经济损失。包括野生毛桃、李、杏、扁桃等近缘种果树之间普遍可 W相互嫁接，从中筛选抗根癌病的材料作为化木及化木育种材料具有重要意义。对于核果 类果树根癌病抗性鉴定，在接种方法上目前多通过根部刺伤或划伤后，饱和接种农杆菌溶 液，然后在生长季结束后，挖出根系，调查植株根系发病情况，或者通过刺伤枝条茎部，然后 注射农杆菌菌液，湿棉球包裹，创造农杆菌侵染条件等，运些方法存在着操作复杂，伤口或 针刺深度及接种量难W控制等缺点;在抗性指标评价方面，主要采用瘤径大小或质量、平均 瘤径大小等做为病级划分指标或抗性等级的确定，欠缺对接种前植物材料种属差异、植株 生长状态差异的考虑，其结果容易受到植物种属、生长状态差异的影响。
【发明内容】
[0003] 为了克服现有技术存在的不足，本发明提供了一种桃及其近缘种植物的根癌病抗 性鉴定方法，它通过简化接种操作、均一化接种量、制造发病关键期环境条件、采用瘤径生 长比作为抗性分级指标，为桃及其近缘种材料的根癌病抗性评价提供了新的方法，可用于 亲缘关系相近植物的根癌病抗性鉴定，筛选或评价抗性材料。
[0004] 本发明是W如下技术方案实现的： 一种桃及其近缘种植物的根癌病抗性鉴定方法，在5~9月份，选取待评价材料茎粗5~ 15mm-年生枝条，用锋利的裁纸刀在茎部从上向下刻8~10mm长、5~8mm宽、深及木质部的 伤口，在伤口内平行切面夹入1~2片薩有1〇9 C化.m[i致病农杆菌菌液的圆滤纸片，然后 用封口膜在刻伤上部包裹，将刻伤复位。每株接种5个位点，若在同一枝条上接种，接种位点 间距20mmW上。接种对照为薩有无菌水的滤纸片。接种后3小时内，对接种植株进行自来水 喷雾30分钟，在侵染关键期制造良好环境。接种后30~90天，用游标卡尺调查各接种部位的 最大瘤径、接种位点上下两端茎粗、计算瘤径比。根据瘤径比评价材料的根癌病抗性。
[0005] 具体按如下步骤进行： (1) 待测材料准备:在田间嫁接或栽培待测试桃及其近缘种材料，如在溫室鉴定可栽植 在适当容积的花盆中，进行±、肥、水及病虫害防治与管理，利用自然条件或溫室光溫条件 让其快速生长至满足接种条件； (2) 根癌农杆菌菌液的培养与标准带菌滤纸片的制备:将农杆菌致病菌株(如AT4-3)接 种于YEB液体培养基中，28°C下，200 rpm/min摇床培养约16h，培养好的菌液在5000 rpm/ min条件下离屯、10分钟，用含0.01%吐溫20的灭菌蒸馈水重悬，并调整浓度为1 X 109c化· mL -1，将直径5mm的灭菌滤纸片呈单片分散放置在培养皿中，在培养皿中倒入农杆菌菌液浸没 滤纸片5分钟，然后用胶头吸管弃去多余菌液，盖上培养皿盖备用； (3 )农杆菌接种:在5~9月份，选取待评价材料茎粗为5-15mm的一年生枝条，用锋利的 裁纸刀在茎部从上向下刻8~10mm长、5~8mm宽、深及木质部的伤口，在伤口内贴面夹入1~ 2片薩有109c化· mri致病农杆菌菌液的圆滤纸片，然后用封口膜在刻伤上部包裹将刻伤复 位。每株接种5个位点，若在同一枝条上接种，接种位点间距20mmW上，对照为接种薩有无菌 水的滤纸片； (4)接种后喷雾:接种后3小时内，对接种植株进行自来水喷雾30分钟，提高环境湿度； 巧)发病调查:接种后30~90天，用游标卡尺调查各接种部位的最大瘤径(肿瘤加枝条 直径）、接种位点上下两端茎粗(平均值为接种点枝条直径）、计算瘤径比（接种点肿瘤加枝 条直径与枝条直径比值）； (6) 抗性分级与评价:用单一植株最大瘤径比评价植株材料的根癌病抗性； (7) 个体分级标准与群体抗性分级： 0级，免疫:与对照无明显差异，接种部位突起<1.0mm，瘤径比(接种后产生的最大冠瘦 瘤直径与接种部位枝条直径比值)值为1，接种不发病； 1级，高抗:1<瘤径比《1.2; 2级，中抗:1.2<瘤径比《1.5; 3级，感病：1.5<瘤径比《2; 4级，中感:2<瘤径比《3; 5级，高感:瘤径比>3。
[0006] 对于群体评价，病情指数的计算如下： 病情指数=(Σ (各级感病苗数X相应病级)/调查苗总数X 5) X 100% 群体抗性分级如下： 免疫，病情指数为0; 高抗，〇<病情指数《20; 中抗，20<病情指数《40; 感病，40<病情指数《60; 中感，60<病情指数《80; 高感，病情指数>80; 该发明的有益效果为，该鉴定方法操作简单，利用刻伤的皮层将携带根癌农杆菌菌量 接近的滤纸圆片贴合在受伤组织部位中间，依靠植物自身伤口愈合过程进行保湿和促进病 原的侵染，不易因天气干旱等造成接种失败;抗性评级方法科学，利用瘤径比进行抗性分 级，考虑了植物材料因种属差异、生长状态差异引起的评级差异。另外，运种鉴定方法，对田 间或室内生长植株都适合。
【具体实施方式】
[0007] 实施举例:桃及其近缘种8个植株个体的根癌病抗性评价 (1)待测材料准备:3月初，在溫室用营养±作基质，在50L的花盆中栽培实生毛桃、实生 山桃、Fa、大久保、绛桃、西藏3号(光核桃）、蒙古扁桃、、新疆野扁桃等8种植株，使其正常生 长，并进行日常上肥水及病虫害管理； (2) 根癌农杆菌菌液的培养与标准带菌滤纸片的制备:将保存在-2(TC冰箱中的甘油与 YEB菌液混合的根癌农杆菌致病菌株AT4-3挑取少量，在超净台上接种于装有150ml Y邸液 体培养基的Ξ角瓶中，28°C下，200 rpm/min摇床培养约16h。培养好的菌液装入离屯、管在 5000 rpm/min条件下离屯、10分钟，菌体用含0.05%吐溫20的灭菌蒸馈水重悬，并调整浓度为 1 X 109c化· ml/i。将直径5mm的灭菌滤纸片呈单片分散放置在培养皿中，在培养皿中倒入农 杆菌菌液浸没滤纸片5分钟，然后用胶头吸管弃去多余菌液，盖上培养皿盖备用； (3) 根癌农杆菌接种:在6月初，选取待评价材料茎粗为5-15mm的一年生枝条，用锋利的 裁纸刀在茎部从上向下刻长8-lOmm、宽5-8mm、深及木质部的伤口，在伤口内贴面夹入1片薩 有109c化/ml AT4-3农杆菌菌液的滤纸片，然后用封口膜在刻伤上部包裹将刻伤复位。每株 接种5个位点。对照为接种薩有无菌水的滤纸片； (4) 接种后叶面喷雾:接种后1小时，对接种植株进行自来水喷雾30分钟，提高环境湿 度； 巧)发病调查:接种后60天，用游标卡尺调查不同测试材料各接种部位的最大瘤径(月中 瘤加枝条直径）、接种位点上下两端茎粗(平均值为接种点枝条直径）、计算瘤径比（接种点 肿瘤加枝条直径与接种点枝条直径比值）； (6) 抗性分级与评价:用单一植株最大瘤径比评价植株材料的根癌病抗性； (7) 个体分级标准与群体抗性分级： 0级，免疫:与对照无明显差异，接种部位突起<1.0mm，瘤径比(接种后产生的最大冠瘦 瘤直径与接种部位枝条直径比值)值为1，接种不发病； 1级，高抗:1<瘤径比《1.2; 2级，中抗:1.2<瘤径比《1.5; 3级，感病：1.5<瘤径比《2; 4级，中感:2<瘤径比《3; 5级，高感:瘤径比>3。
[0008] 对于群体评价，病情指数的计算如下： 病情指数=(Σ (各级感病苗数X相应病级)/调查苗总数X 5) X 100% 群体抗性分级如下： 免疫，病情指数为0; 高抗，〇<病情指数《20; 中抗，20<病情指数《40; 感病，40<病情指数《60; 中感，60<病情指数《80; 高感，病情指数>80; (8) 桃及其近缘种材料8个植株个体对根癌±壤杆菌AT4-3引起的根癌病抗性评价结果 见表1。
[0009] 表1桃等8种材料对根癌上壤杆菌AT4-3的抗性鉴定结果_
【主权项】
1. 一种桃及其近缘种植物的根癌病抗性鉴定方法，其特征在于:选取待评价材料茎粗5 ~15mm-年生枝条，用锋利的裁纸刀在莖部从上向下刻8~10mm长、5~8mm宽、深及木质部 的伤口，在伤口内平行切面夹入1~2片蘸有10 9 cfu · ml/1致病农杆菌菌液的圆滤纸片，然 后用封口膜在刻伤上部缠裹，将刻伤复位，每株接种5个位点，若在同一枝条上接种，接种位 点间距20mm以上，接种对照为蘸有无菌水的滤纸片;接种后3小时内，对接种植株进行自来 水喷雾30分钟，在侵染关键期制造良好环境;接种后30~90天，用游标卡尺调查各接种部位 的最大瘤径、接种位点上下两端茎粗、计算瘤径比，根据瘤径比评价材料的根癌病抗性。2. 根据权利要求1所述的一种桃及其近缘种植物的根癌病抗性鉴定方法，其特征在于： 它的具体步骤为： (1) 待测材料准备:在田间嫁接或栽培待测试桃及其近缘种材料，如在温室鉴定可栽植 在适当容积的花盆中，进行土、肥、水及病虫害防治与管理，利用自然条件或温室光温条件 让其快速生长至满足接种条件； (2) 根癌农杆菌菌液的培养与标准带菌滤纸片的制备:将农杆菌致病菌株接种于YEB液 体培养基中，28°C下，200 rpm/min摇床培养约16h，培养好的菌液在5000 rpm/min条件下离 心10分钟，用含0.01%吐温20的灭菌蒸馏水重悬，并调整浓度为1 X 109cfu · ml/1;将直径5mm 的灭菌滤纸片呈单片分散放置在培养皿中，在培养皿中倒入农杆菌菌液浸没滤纸片5分钟， 然后用胶头吸管弃去多余菌液，盖上培养皿盖备用； (3 )农杆菌接种:在5~9月份，选取待评价材料莖粗为5~15mm的一年生枝条，用锋利的 裁纸刀在茎部从上向下刻长8-10mm、宽5-8mm、深及木质部的伤口，在伤口内贴面夹入1~2 片蘸有1〇9 cfu ?ml/1致病农杆菌菌液的圆滤纸片，然后用封口膜在刻伤上部缠裹将刻伤复 位，每株接种5个位点，若在同一枝条上接种，接种位点间距20mm以上，接种对照为蘸有无菌 水的滤纸片； (4) 接种后喷雾:接种后3小时内，对接种植株进行自来水喷雾30分钟，提高环境湿度； (5) 发病调查:接种后30~90天，用游标卡尺调查各接种部位的最大瘤径、接种位点上 下两端茎粗、计算瘤径比； (6) 抗性分级与评价:用单一植株的最大瘤径比评价植株材料的根癌病抗性； (7) 个体抗性分级标准与群体抗性评价： 〇级，免疫:与对照无明显差异，接种部位突起<1.〇mm，瘤径比(接种后产生的最大冠癭 瘤直径与接种部位枝条直径比值)值为1，接种不发病； 1级，高抗:1<瘤径比彡1.2; 2级，中抗:1.2<瘤径比彡1.5; 3级，感病：1.5<瘤径比彡2; 4级，中感:2<瘤径比彡3; 5级，高感:瘤径比>3; 对于群体评价，病情指数的计算如下： 病情指数=(Σ (各级感病苗数X相应病级)/调查苗总数X 5) X 100% 群体抗性分级如下： 免疫，病情指数为〇; 高抗，〇<病情指数<20; 中抗，20<病情指数<40; 感病，40<病情指数<60; 中感，60<病情指数<80; 高感，病情指数>80。
【文档编号】C12R1/01GK106011222SQ201610343087
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年5月23日
【发明人】王新卫, 郝峰鸽, 王力荣, 朱更瑞, 方伟超, 陈昌文, 曹珂
【申请人】中国农业科学院郑州果树研究所