一种与猪初生窝重和胎重相关的分子标记鉴定方法及应用
【专利摘要】本发明公开了一种与猪初生窝重和胎重相关的分子标记鉴定方法及应用,包括样品采集、猪基因组DNA的提取与检测、然后再用SNP芯片基因型判定及基因型数据的质控,以样本DNA为模板,加入PCR扩增引物对进行PCR扩增反应,反应产物纯化后与质谱芯片共结晶,用飞行质谱法检测并分型,检测目的基因的SNP位点,单核苷酸多态性的基因型和等位基因频率的计算是使用PopGene3.2实现的;SNP多态性与性状的关联分析使用SAS9.2软件,最后进行数据整理与分析。本发明的鉴定方法通过确定猪个体基因类型,从而辅助鉴定经产窝重和胎重。
【专利说明】
-种与猪初生窝重和胎重相关的分子标巧鉴定方法及应用
技术领域
[0001 ]本发明属于种猪生产研究技术领域,设及猪基因的产仔性状SNP分子标记研究,更 具体的说是一种与猪初生窝重和胎重相关的分子标记鉴定方法及应用。
【背景技术】
[0002] 我国养猪业历史悠久,猪种资源丰富,分布广泛,有着巨大的利用潜力和广阔的发 展前景。种猪生产是养猪业生产的基础,只有通过科学地饲养管理,种猪才能繁殖出数量 多、质量高的仔猪,才能提高养猪业的经济效益。
[0003] 随着我国经济持续快速的发展,人们的生活水平逐渐提高,对猪肉的需求量也越 来越高,因此,人们也越来越关注如何提高猪的繁殖性能。繁殖性能是猪的重要经济性状, 包括产仔数、初生重和初生窝重、断乳窝重、初产日龄和产仔间隔等。母猪繁殖力的选育对 于提高养猪生产整体效益起到至关重要作用,给养猪业带来巨大经济效益,是影响养猪业 生产效率的重要因素之一。
[0004] 母猪繁殖性状一个很重要的指标是能否生产出较重的初生重。平均初生重大,变 异系数小,说明窝整齐度好,对提高仔猪成活率非常有好处,平均初生重大也可W刺激母猪 多产奶。
[0005] 因此,对猪初生重相关基因的鉴定可为解释猪和其他哺乳动物胎儿生长发育的遗 传机制提供重要线索,并为猪的繁殖性状遗传改良提供理论依据。猪仔妊娠期,绒毛膜上皮 和子宫内膜上皮形成皱權,皱權折叠水平影响着胎盘的相对大小,胎盘的相对大小是影响 胎儿存活的主要因素之一,胎儿的存活率又与猪初生重具有重要的关系。寻找基因中的多 肤位点,通过与性状间的关联分析发现基因与性状间的关系是研究基因功能的一个重要手 段。
[0006] 前人研究表明,CYP19A1基因编码的产物在类固醇生成过程中参与了多种催化反 应,特别是在雄激素经过芳香化,转变成雌激素过程中起着重要的作用(Balthazart J et al.,1998)dCYP19A1的mRNA的表达与卵泡发育有关,若CYP19A1的表达量降低或抑制芳香 化酶活性都可能直接影响雄締二酬和睾酬转化成雌酬和雌二醇(Echternkamp S et al., 2012)。因此,CYP19A1基因在动物生长、发育和生殖过程中具有重要的调控作用,特别在卵 泡生长发育、成熟至排卵中性激素的合成转换过程中都发挥关键作用,而且CYP19A1基因 SNP位点的多态性改变和雌激素水平相关,进而激素水平来调控母猪繁殖效率。初生重作为 衡量母猪繁殖性状的一个重要指标,故我们探讨研究CYP19A1基因单核巧酸多态性位点与 窝重与胎重的相关性。
[0007] 目前,研究猪CYP19A1基因功能的报道很少,
【申请人】运用全基因组关联分析的方法 对运个基因的多态性与重要的繁殖性状进行了关联分析,并首次在猪基因组中找到的产仔 性状SNP分子标记及其单倍型。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷,提供一个与猪产仔性状相关的SNP分子 标记和运个SNP构成的鉴定及应用。本发明运用全基因组关联分析的方法寻找与猪产仔性 状相关的SNP分子标记,W此作为猪产仔性状相关的SNP分子标记及单倍型在标记辅助选择 中的应用。
[0009] 为实现上述目的,本发明公开了如下的技术内容: 一种与猪初生窝重和胎重相关的分子标记鉴定的特异性引物,其特征在于包括如下的 引物序列:
本发明进一步公开了采用特异性引物进行与猪初生窝重和胎重相关的分子标记鉴定 的方法,其特征在于按如下的步骤进行: (1) 样品采集:放于75%的酒精中并-20°C保存,待提DNA; (2) 猪基因组DNA的提取与检测: 1) 从猪组织中提取基因组总DNA; 2) 待DNA充分溶解后,用紫外分光光度计测定所提浓度,并琼脂糖凝胶电泳检测所提质 量; (3) SNP忍片基因型判定及基因型数据的质控: 1) 取化1原液进行电泳检测 2) 引物设计:根据SNP位点序列信息,使用sequenom公司的引物设计软件Assay designs. 1,设计PCR反应和单碱基扩展引物并合成;
每个SNP的化rward PCR引物、Rewerse PCR引物各取2.加1,混合成500ul体系; 3) PCR反应:
4) 上机检测: 将反应产物9ul稀释3倍,使用树脂进行脱盐,将脱盐处理后的样品点在样品祀上,自然 结晶,上机进行质谱检测,并收集数据,反应产物纯化后与质谱忍片共结晶,用飞行质谱法 检测并分型,检测目的基因的SNP位点,单核巧酸多态性的基因型和等位基因频率的计算是 使用化pGene3.2实现的;SNP多态性与性状的关联分析使用SAS9.2软件; (4)数据整理与分析 1)表型数据分析:利用SAS9.2统计分析软件,对猪初产产仔数测定值进行描述性统计 分析,包括计算该性状的平均值、标准差、最大值和最小值。
[0010] 2)单倍型分析:单核巧酸多态性的基因型和等位基因频率的计算使用化pGene3.2 实现。
[0011] 本发明更进一步公开了与猪初生窝重和胎重相关的分子标记鉴定方法在确定猪 个体基因类型辅助鉴定经产窝重和胎重方面的应用。实验结果显示:SNP(rs341891833)位 点明显对经产窝重和胎重有影响,CT基因型经产窝重和胎重显著高于CC基因型,所W在实 际的猪育种中,CT基因型猪具有更快的繁殖效率。综上所述,可W通过确定猪CYP19A1基因 rs341891833位点的核巧酸来确定猪个体为CT基因型还是CC基因型,从而辅助鉴定经产窝 重和胎重:CT基因型经产窝重和胎重显著高于CC基因型。
[0012] 本发明的鉴定方法通过确定猪个体基因类型,从而辅助鉴定经产窝重和胎重。 [OOU]本发明更加详细的描述如下: 本发明所述的SNP构成的单倍型的鉴定过程如下: 一、实验样品采集 来自山东某种猪场的375头大白猪,用于CYP19A1基因 SNP分型。逐个采集耳组织样,放 于75%的酒精中并-20°C保存,待提DNA。
[0014] 二、猪基因组DNA的提取与检测 (1)剪取适量的猪耳组织,剪碎将其放进1.5ml的Axgen管中。
[0015] (2)取50ml抓离屯、管,将终浓度为0.4mg/ml的蛋白酶K和裂解缓冲 液进行混合均匀,向装有猪耳朵组织的1.5ml的离屯、管中加入0.5ml裂解液进行裂解。
[0016] (3)离屯、管平行均匀的放置于恒溫杂交炉的摇板上。55度放置6个小时W上; (4)待样品充分裂解后,取出离屯、管,在每管中加入0.3ml饱和氯化钢溶液,进行颠倒充 分混合6-8次,然后放于冰上,冰浴15分钟; 巧)冰浴过后,12000巧m室溫离屯、15分钟,小屯、缓慢的将上清转移至新的1.5mlAxgen离 屯、管中(小屯、避免沉淀随上清一起倒出,保持倒的手法要一致,保持每管倒得上清在量上保 持相同); (6) 加入0.7ml的异丙醇(加入异丙醇的量随倒出的上清的量的变化而变化,二者等体 积)于各管,颠倒直至溶液中有絮状沉淀出现(若无絮状沉淀,可将溶液-20°C冰箱放置2小 时或4°C冰箱放置过夜);0 (7) 1200化pm室溫离屯、15分钟,去掉上清液体; (8) 在各离屯、管中加入0.5ml 70%乙醇,轻轻颠倒W充分冲洗上述沉淀出来的DNA; (9) 10000rmp离屯、30s,用200ul微量移液枪将离屯、管中的乙醇吸掉,将沉淀的DNA留在 管中; (10) 自然风干DNA10分钟; (11) 移液枪取0.1ml的TE缓冲液于各管中,将上述DM沉淀重新溶解,置其于55°C放置2 小时,定时摇晃数次,W使DNA充分溶解; (12) 待DNA充分溶解后,用紫外分光光度计测定所提浓度,并琼脂糖凝胶电泳检测所提 质量。
[0017 ] (13 )将DNA溶液放置4 C过夜,次日取1μ 1进行PCR。
[0018] S、SNP忍片基因型判定及基因型数据的质控 实验目的:通过电泳检测所提供DNA样品是否符合Sequenom的质量标准 实验材料:Loading buffer (TAKARA公司)邸染料1*TAE buffer琼脂糖 实验仪器:全自动凝胶成像系统(Bio-rad公司)电泳槽(Bio-rad公司) 实验方法:取化1原液进行电泳检测 实验结果分析:样品总体质量非常高,符合Sequenom的质量标准。
[0019] 2)引物设计:根据SNP位点序列信息,使用sequenom公司的引物设计软件Assay designs. 1,设计PCR反应和单碱基扩展引物并合成;
每个SNP的化rward PCR引物、Rewerse PCR引物各取2.加1,混合成500ul体系; PCR反应:
SAP消化:
上机检测: A) 将反应产物(共9ul)稀释3倍,使用树脂进行脱盐 B) 将脱盐处理后的样品点在样品祀上,自然结晶 C) 上机进行质谱检测,并收集数据 反应产物纯化后与质谱忍片共结晶,用飞行质谱法检测并分型,检测目的基因的SNP位 点,单核巧酸多态性的基因型和等位基因频率的计算是使用化pGene3.2实现的;SNP多态性 与性状的关联分析使用SAS9.2软件; 四、数据整理与分析 1)表型数据分析 利用SAS9.2统计分析软件,对猪初产产仔数测定值进行描述性统计分析,包括计算该 性状的平均值、标准差、最大值和最小值。
[0020] 2)单倍型分析 单核巧酸多态性的基因型和等位基因频率的计算是使用P〇pGene3.2实现的。利用 SAS9.2软件中的GLM过程分析SNP和产仔数性状的关联分析,固定效应模型如下: y二、比結 1+無,+己; y为繁殖性状的表型记录;μ为性状的总平均值;gi为基因型效应;mk为生产月份效应;e 为随机误差。数据W概率值和平均值±标准差表示,P值<0.05表示具有显著性差异。
[0021] 五、结果分析 表1
基因型检测结果表明:97头猪的基因型为CC基因型,278头猪的基因型为CT基因型。猪 CYP19A1基因在检测猪群中的等位基因频率及基因频率结果如表1所示:CC基因型频率为 0.259,口'基因型频率为0.741,口'的基因型频率高于0:,口'等位基因为优势基因。
[0022] 从表2可W看出,该多肤位点在375头大白猪中的CC基因型有97个,CT基因型有278 个。CYP19A1与经产窝重和胎重差异极显著。CT型大于CC型。
[0023] 利用SAS9.2软件对基因型和经产窝重和胎重进行统计分析,并做样本间多重比 较。结果如表2所示:SNP(rs341891833)位点明显对经产窝重和胎重有影响,CT基因型经产 窝重和胎重显著高于CC基因型,所W在实际的猪育种中,CT基因型猪具有更快的繁殖效率。
[0024] 综上所述,可W通过确定猪CYP19A1基因 rs341891833位点的核巧酸来确定猪个体 为CT基因型还是CC基因型,从而辅助鉴定经产窝重和胎重:CT基因型经产窝重和胎重显著 高于CC基因型。
[0025] CT基因型为猪CYP19A1基因第341891833位的核巧酸为C与T的杂合体; CC基因型为猪CYP19A1基因第341891833位的核巧酸为C的纯合体。
[0026]
【具体实施方式】
[0027] 下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明,本发明中所用的技术手段 均为本领域技术人员所公知的方法。另外,实施方案应理解为说明性的,而非限制本发明的 范围,本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言,在不背离本 发明实质和范围的前提下,对运些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也 属于本发明的保护范围。
[0028] 实施例1 一种与猪初生窝重和胎重相关的分子标记鉴定方法: (1) 样品采集:放于75%的酒精中并-20°c保存,待提DNA; (2) 猪基因组DNA的提取与检测: 1)从猪组织中提取基因组总DNA; 2)待DNA充分溶解后,用紫外分光光度计测定所提浓度,并琼脂糖凝胶电泳检测所提质 量; (3)SNP忍片基因型判定及基因型数据的质控: 1) 取化1原液进行电泳检测 2) 引物设计:根据SNP位点序列信息,使用sequenom公司的引物设计软件Assay designs. 1,设计PCR反应和单碱基扩展引物并合成;
每个SNP的化rward PCR引物、Rewerse PCR引物各取2.加1,混合成500ul体系; 3) PCR反应:
SAP消化:
4)上机检测: 将反应产物9ul稀释3倍,使用树脂进行脱盐,将脱盐处理后的样品点在样品祀上,自然 结晶,上机进行质谱检测,并收集数据,反应产物纯化后与质谱忍片共结晶,用飞行质谱法 检测并分型,检测目的基因的SNP位点,单核巧酸多态性的基因型和等位基因频率的计算是 使用化pGene3.2实现的;SNP多态性与性状的关联分析使用SAS9.2软件; (4)数据整理与分析 1)表型数据分析:利用SAS9.2统计分析软件,对猪初产产仔数测定值进行描述性统计 分析。
[0029] 实施例2 一种与猪初生窝重和胎重相关的分子标记鉴定方法: 1.引物设计: Ist-PCRP:正向引物(F) 2nd-PCRP:反向引物(R) WP_SEQ:单碱基延伸引物 WP_MASS:单碱基延伸引物质量 WP_DIR:单碱基延伸引物所在DNA链 F:正义链 R:反义链 2.实验流程: a. 首先将引物稀释好,引物稀释: (1)每个SNP,有Ξ条引物,将运Ξ条引物的编号标记在引物合成管的管盖上。
[0030] (2)Forward PCR引物、Rewerse PCR引物先离屯、空甩后加水,加水量与0D值相关 (引物管和引物设计表均有标识),每10D加36ul水。加水后室溫放置30min后震荡混匀备用。
[0031] (3)每个Well中多重SNP的化rward PCR引物、Rewerse PCR引物混合时计算方 法:每个SNP的化rward PCR引物、Rewerse PCR引物各取2.加1,混合成500ul体系。
[0032] 加水量(ul)=500-重数巧.5巧(重数:well中SNP个数) (4)证P引物的加水量计算 按照肥P质量分别稀释每管肥P,再将多重SNP的引物混合到500ul 每个证P体积(111)=500/重数 b. PCR扩增 PCR扩增采用多重PCR技术,在384孔板中进行,每个反应体系总体积为扣1 (1) 在一个新的2.0ml EP管中配制PCR master mix溶液;
(2) 将配制好的PCR master mix溶液震荡混匀后分置8连排的PCR管中备用,使用8通道 加样器,调节加样体积为化L,在384孔板的每个加样孔中加入PCR master mix液。该384孔 板即为PCR反应板。
[0033] (3)取出已经制备好的DNA样品96孔板,使用8通道加样器,调节加样体积为化L, 加至相对应的384PCR反应板,贴上封口膜,震荡混匀后空甩。
[0034] (4)将384孔板放置在兼容384孔板的PCR仪上,设定PCR反应条件: ?>NN 一 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 一一 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN>>NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN~V
c. PCR产物碱性憐酸酶处理 (1)在PCR反应结束后,384反应板取出并空甩。
[0035] (2)配制碱性憐酸酶处理反应液,SAP Mix;
(3)将配制好的SAP mix溶液震荡混匀后分置8连排的PCR管中备用,使用8通道加样器, 调节加样体积为化L,将SAP Mix加入384孔PCR反应板。贴上封口膜,震荡混匀后空甩。反应 体系总体积为7 μ1(其中PCR产物5 yl,SAP混合液2 μ1)。
[0036] (4)将384孔板放置在兼容384孔板的PCR仪上,设定PCR反应条件:
启动PCR仪进行单碱基延伸反应。
[0037] 单碱基延伸 (1)在碱性憐酸酶处理结束后,将384反应板取出后空甩,在进行单碱基延伸反应,反 应体系总体积9 μ1。
[003引 (2)配制单碱基延伸反应液,EXTEND Mix; .%-i、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、节、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、|||·
(3)将配制好的EXTEND mix溶液震荡混匀后分置8连排的PCR管中备用,使用8通道加样 器,调节加样体积为化L,将EXTEND Mix对应加入384孔反应板。对于每个反应孔,单碱基延 伸反应体系包含SAP处理后PCR产物化1及EXTEND Mix液化1,总体系9ul。
[0039] (4)将384孔板放置在兼容384孔板的PCR仪上,设定PCR反应条件:
启动PCR仪进行单碱基延伸反应。
[0040] 树脂纯化:将反应产物加16ul水进行稀释,稀释后使用树脂进行脱盐; f. 忍片点样:将脱盐处理后的样品点在样品祀上,自然结晶; g. 质谱检测:上机进行质谱检测,并收集数据。
【主权项】
1. 一种与猪初生窝重和胎重相关的分子标记鉴定的特异性引物,其特征在于包括如下 的引物序列: AGGTTGGAIGGMGCATGMGTTGeMTTG: Ist夺CRPa ::t正脔弓测:F) P .AG(]TT0GAIGA^ATA&Gl^ATGACMi愈^ :(纖弓働R) y GGGAiGGTTMSCCAGTGM^ ° UEP^SEQv - :_麵_ [物:)w EXTUSEQ^ 額 TT___T:GA&& EXTS^SEQ? : CGG^GCTT AACGG^TG AGfe2. 采用权利要求1所述的特异性引物进行与猪初生窝重和胎重相关的分子标记鉴定的 方法,其特征在于按如下的步骤进行: (1) 样品采集:放于75%的酒精中并-20 °C保存,待提DNA; (2) 猪基因组DNA的提取与检测: 1) 从猪组织中提取基因组总DNA; 2) 待DNA充分溶解后,用紫外分光光度计测定所提浓度,并琼脂糖凝胶电泳检测所提质 量; (3) SNP芯片基因型判定及基因型数据的质控: 1) 取2u 1原液进行电泳检测 2) 引物设计:根据SNP位点序列信息,使用sequenom公司的引物设计软件Assay design3.1,设计PCR反应和单碱基扩展引物并合成; 酿(? 幽麵C 頌(jA_TTG 幽 TTG:: Ist-PCRP^ 聊引細)、 MTGTTGGATGAGeMMGieMGlCAftCfe Snd-PCRP^ :頃弓丨物 CGGATGGTTAftCGGAGTGAGv 議麵延栖聊:)私 EXTUSEQ:^ :€_触财纖€驗1幽以 ΕΧΓ2_ΞΕ^ GgG^gGTTMCCCACTG^T^ 每个SNP的Forward PCR引物、Rewerse PCR引物各取2.5ul,混合成500ul体系; 3. PCR反应:4)上机检测: 将反应产物9ul稀释3倍,使用树脂进行脱盐,将脱盐处理后的样品点在样品靶上,自然 结晶,上机进行质谱检测,并收集数据,反应产物纯化后与质谱芯片共结晶,用飞行质谱法 检测并分型,检测目的基因的SNP位点,单核苷酸多态性的基因型和等位基因频率的计算是 使用P〇pGene3.2实现的;SNP多态性与性状的关联分析使用SAS9.2软件进行数据整理与分 析。3.权利要求2所述的与猪初生窝重和胎重相关的分子标记鉴定方法在确定猪个体基因 类型辅助鉴定经产窝重和胎重方面的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK106011245SQ201610376855
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月1日
【发明人】周荣, 李奎, 唐中林, 刘颖, 杨亚岚, 李训碧, 李千军
【申请人】中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 天津市畜牧兽医研究所