基于微流体芯片技术的5种根结线虫等温扩增检测引物序列及其应用
【专利摘要】本发明公开了基于微流体芯片技术的5种根结线虫等温扩增检测引物序列及其应用，特点是根据苹果根结线虫的rDNA?ITS、北方根结线虫的rDNA?ITS、花生根结线虫的IGS2序列、爪哇根结线虫的SCAR序列、以及南方根结线虫的RAPD序列各设计三对引物序列，建立等温扩增微流体芯片检测体系，完成苹果根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫、爪哇根结线虫，以及南方根结线虫的检测，其中各引物序列如SEQ ID NO.1?30所示，优点是检测物种数和样本数多、操作简单快捷，高灵敏度和特异性。
【专利说明】
基于微流体巧片技术的5种根结线虫等溫扩増检测引物序列 及其应用
技术领域
[0001]本发明设及根结线虫的检测，尤其是设及一种基于微流体忍片技术的5种根结线 虫等溫扩增检测引物序列及其应用。
【背景技术】
[0002]根结线虫(Meloidogyne spp.)是植物病原线虫中种类最多、分布最广、危害最严 重的类群之一。目前，已经得到鉴定的在中国境内有分布主要有23种，其中W南方根结线 虫、北方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫等4种线虫分布较广;象耳豆根结线虫因其 可克服Mi抗原基因的抗性且无法令穿刺己氏杆菌寄生等生物学特性，颇具研究价值。而苹 果根结线虫、山茶根结线虫为我国口岸检疫中截获的常见根结线虫(非中国种）。
[0003] 传统的根结线虫种类鉴定主要依据雌虫、雄虫和二龄幼虫的形态学特征分析结合 鉴别寄主测定等方法，然而根结线虫的形态特征常存在种内变异，对专业知识要求高，鉴别 寄主鉴定又费时。随着分子生物学技术的发展，同工酶电泳、限制性片段长度多态性、随机 扩增多态性DNA (random amplified polymor地ic DNA, RAPD)、实时巧光定量PCR等技术 应用到了根结线虫的检测与鉴定中。运些技术克服了线虫生长周期、寄主和地理来源等限 审IJ，在一定程度上增加了鉴定的准确性。然而，运些方法需配备PCR仪、凝胶成像系统等昂贵 精密的仪器，易接触到漠化乙锭化B)等致癌物，而且对于检测人员的专业知识要求较高。新 发展起来的基于等溫条件下的核酸扩增技术，W环介导等溫扩增技术(LAMP)为典型代表， 克服了热循环等造成的仪器的复杂程度，在微生物的即时快速检测中展示出一定的应用前 景。尽管针对单一病原的快速检测技术得到了快速发展，病原的检测与鉴定越发变得快速 和准确，但多病原的混合感染也已成为一种常态，多种病原针对同一宿主也可引起相似的 症状或体征变化。而在进出口物品的检验检疫中，同一进出口商品也往往需要检测多种病 原微生物。在此种情况下，运种同一检测手段的多次平行操作也在极大地限制着检测的时 效和工效。因此，基于多样本或多病原同步检测的高通量方法称为当下检测类技术开发的 重要领域。在此背景下发展起来的生物忍片技术，其具有的高通量、微型化，W及自动化等 特点，完美地迎合了多样本、多病原检测的需求，极大地推动了检测技术的发展。
[0004] 目前生物忍片北京国家工程研究中屯、将微流体忍片技术和等溫扩增技术联合应 用，开发了等溫扩增忍片检测控制系统，并已于2014年上市(如图1所示）。同时，设计完成了 1款等溫扩增忍片(碟式忍片），1张忍片有24个反应池，每个反应池的体积约1.4 yL，LAMP 反应在忍片的反应池中完成，大幅度地减少了反应体系的体积，适合多项指标并行检测(如 图1所示）。目前，该技术已成功应用于多重呼吸道病原菌、多重水产养殖病原微生物(细菌 和病毒），W及多重食源性病原菌的同步检测，国内外还未见报道将该技术应用于根结线虫 的检测与鉴定。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种检测速度快，检测物种多，检测灵敏度和 准确性高的基于微流体忍片技术的5种根结线虫等溫扩增检测引物序列及其应用。
[0006] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种基于微流体忍片技术的5种 根结线虫等溫扩增检测引物序列，根据苹果根结线虫的核糖体DNA的内转录间隔区序列 (rDNA-ITS)、北方根结线虫的核糖体DNA的内转录间隔区序列(rDNA-ITS)、花生根结线虫的 基因间隔区序列（IGS2)、爪哇根结线虫的SCAR序列、W及南方根结线虫的RAPD序列各设计 Ξ对引物序列，其中用于检测苹果根结线虫的引物序列是： Mma-F3：TGCTGCTGGATCATTACAC, Mma-B3: TCCTGGGCTCATTAAGTCT, Mma-FIP: CGACGTATCCTCCCAATCTTGTCGCAATGAGCCTTGTTATTG， Mma-BIP: CGACTCTCGTCGTGTAACGGGATGGCACAACTGCTCAG, Mma-LF：CGTGGAGTAGACGAAGAAATCT, Mma-LB：CTACGCTGGTGTCTGTGT； 用于检测北方根结线虫的引物序列是： Mha-F3:GGGTTTAAGACTTAATGAGCCT， Mha-B3:CGCTGCGTACCAACATTA， Mha-FIP:GCAGTTCGCACAAATTATCGCATTTTATCCTTGTCGGTGGATC， Mha-BIP:TTTGAATGCAAATTGCGGCACTAAAATGACCCTGAACCAGAC， Mha-LF:AGCTGCGTTCTTCATGGAT， Mha-LB：GGGTAGAACCCTTTGCCA； 用于检测花生根结线虫、爪哇根结线虫和南方根结线虫的通用引物序列是： Mar-F3： GCGGTATGGTCGTAATCAAT, Mar-B3：AATGACAGCTGATAACATACT, Mar-FIP：TTTCTCTCCACGAGTTTCTAGATTCGATGTTCGCTGTTCG, Mar-BIP：TCCTTTATTGACTCTCGCTGCAATCGGCTAAATTCCTGACAA, Mar-LF：AGCCCAATTTGAGTTTTCCTTT, Mar-LB：AAATTAATTTGGCTTCTGGCAA； 用于检测爪哇根结线虫的引物序列是： Mja-F3: ACACTGTTACGTATCAACTTGT， Μja-B3:TAAACCCAGCTAGGAACCA， Μja-FIP:CGATTTCCGACTTTTGAGCCATAATGACGAAGGTGTCGGA， Μja-BIP:TCGGAAATCGGAATTCCAGCCATTTTCCCCATTTATTCGCAAG， Mja-LF:CGATTTCCGACAGTTCCCA， Mja-LB：GGGGTAATAATGGGGTGTTGT； 用于检测南方根结线虫的引物序列是： Min-F3：TTTCCTCAATAGGACGGTATAC, Min-B3：ACGAACCGCGATATTTCAA, Min-FIP：AAAATCTGTTTCGGCACACCCTATCCAAGACCCAATGGC, Min-BIP:AAAAGCAAAAGACGAAGCACCAATACCAGGGATGTGCCTT， Min-LF:CCCTGGTTTCAGGACCTATG， Min-LB：GACGAAAATTCGGCAAAAAGC 〇
[0007] -种上述基于微流体忍片技术的5种根结线虫等溫扩增检测引物序列的应用，具 体检测步骤如下： 1) 碟式忍片的设计与点制 将微流体碟式忍片由原来的单样本24个反应池改进为二样本22个反应池，忍片分I和 II两个片区，每个片区11个反应池;在忍片点制过程中，首先将选好的苹果根结线虫、北方 根结线虫、花生根结线虫、爪哇根结线虫W及南方根结线虫的引物依次点至忍片各反应池， 并脱水处理，每个反应池内的引物包括F3/B3各0.2 pmol，FIP/BIP各1.6 pmol，LF/LB各0.4 pmol，W无菌水作为阴性对照，同时设置阳性内对照； 2) 配置反应体系 反应体系各成分的终浓度分别为：dNTPs 1.4mmol/L，Tris-HCl(pH 8.8) 20mmol/L， KCl 10mmol/L，MgS〇4 6.5mmol/L，（NH4)2S〇4 10mmol/L，Triton X-100 0.1%，l'EvaGreen染 料，8U Bst DM聚合酶大片段，加双蒸水补足反应体系，1个片区所需的反应体系为22 3) 碟式忍片上的LAMP反应 将上述反应体系22 pL与2 pL样品模板混合后，通过进样孔，一次性加入进微流体碟式 忍片，6000 rpm离屯、30 S，将液体均匀分散到各反应池，每个反应池内的体积约为1.化L，将 忍片放置在晶忍RTisocMp-A恒溫扩增微流控忍片核酸分析仪进行巧光信号的采集，反应 结果W巧光曲线的形式实时呈现，其中阳性结果WV'表示，阴性结果表示。
[000引 LAMP扩增反应的溫度为63°C，反应时间为60 min。
[0009]与现有技术相比，本发明的优点在于 1、 检测指标数多，本方法一次性可W检测并鉴定出苹果根结线虫、北方根结线虫、爪哇 根结线虫，W及南方根结线虫等4种线虫;使用单条线虫的基因组DNA，可完成对苹果根结线 虫、北方根结线虫、花生根结线虫、爪哇根结线虫，W及南方根结线虫的区别鉴定； 2、 检测样本数多:本方法在一次性可检测5种线虫的同时，还可W -次性检测2个样本； 3、 样品用量少:每个反应池的体积为1.4 yL，即每个检测指标所需的反应体积仅为 1.化L，大大节省反应试剂； 4、 样品的加样过程非常方便:本方法的样品加样过程非常简单，使用2(Κ)化量程的移液 枪可实现样本的一次性加样，即只需加样一次，即可实现上述5种线虫的同时检测； 5、 检测时间短:提取的DNA样本，加入忍片后，整个扩增反应时间为60 min,大幅度提高 了检测效率； 6、 灵敏度高：W单条线虫的基因组DNA为模板，本方法可W检测到单条线虫基因组DNA 的1/100-1/1000; 7、 特异性强:应用于每个线虫物种检测/鉴定的引物序列均是根据各自物种的目标基 因的8个不同保守区域设计，具有更强的特异性，且忍片独特的生产工艺可最大程度地避免 不同反应池间的交叉污染，降低检测结果的假阳性； 8、 结果判断简单:可通过出现的巧光曲线实时判读结果，也可W借助仪器配套的人工 智能判读软件判读； 9、 对人身和环境更加安全，检测过程中不设及EB等有毒试剂。
[0010] 综上所述，使用本发明的引物采用等溫扩增微流体忍片方法对根结线虫进行检 巧。，通过微流体忍片上进行的LAMP反应，实现实时巧光即时检测，或反应结束后终点判读， 实现多种根结线虫的快速检测，具有更好的便捷性，更高的快捷性、特异性和灵敏度，有利 于根结线虫的即时检测和快速鉴定，可满足对应检测机构和现场疫源地检测的需要。
【附图说明】
[0011] 图1为微流体碟式忍片的单样本碟式忍片简图； 图2为本发明改进后的微流体碟式忍片的二样本碟式忍片简图； 图3为苹果根结线虫微流体忍片等溫扩增检测方法的特异性实验结果;PC:阳性对照， W苹果根结线虫的曲NA(103 pg/yL)为模板； 图4为北方根结线虫微流体忍片等溫扩增检测方法的特异性实验结果;PC:阳性对照； W北方根结线虫的曲NA(103 pg/yL)为模板； 图5为花生根结线虫微流体忍片等溫扩增检测方法的特异性实验结果;PC:阳性对照； W花生根结线虫的曲NA(103 pg/yL)为模板； 图6为爪哇根结线虫微流体忍片等溫扩增检测方法的特异性实验结果;PC:阳性对照； W爪哇根结线虫的曲NA(103 pg/yL)为模板； 图7为南方根结线虫微流体忍片等溫扩增检测方法的特异性实验结果;PC:阳性对照； W南方根结线虫的曲NA(103 pg/yL)为模板； 图8为利用LAMP方法初步测定的用于微流体忍片等溫扩增检测的苹果根结线虫引物的 灵敏度结果，NC:蒸馈水；104、103、102、1〇1、1〇\ 1〇-1为苹果根结线虫基因组DNA浓度，单位： Pg/化； 图9为利用LAMP方法初步测定的用于微流体忍片等溫扩增检测的北方根结线虫引物的 灵敏度结果，1~6:分别^1.78'1〇3、1.78'1〇2、1.78'1〇1、1.78'10日、1.78'1〇-1、1.78'1〇-2口邑/ pL的北方根结线虫曲NA为模板，7: W蒸馈水为模板作为阴性对照； 图10为利用LAMP方法初步测定的用于微流体忍片等溫扩增检测的通用引物的灵敏度 结果，1~6:分别^2.33'1〇4、2.33'1〇3、2.33'1〇2、2.33'1〇1、2.33'10°、2.33'1〇-1口邑/111^勺花 生根结线虫为模板;7: W蒸馈水为模板作为阴性对照； 图11为利用LAMP方法初步测定的用于微流体忍片等溫扩增检测的通用引物的灵敏度 结果，1~6:分别^1.82'1〇4、1.82'1〇3、1.82'1〇2、1.82'1〇1、1.82'10°、1.82'1〇-1口邑/111^勺爪 哇根结线虫为模板，7: W蒸馈水为模板作为阴性对照； 图12为利用LAMP方法初步测定的用于微流体忍片等溫扩增检测的通用引物的灵敏度 结果，1~6:分别^7.8'1〇4、7.8'1〇3、7.8'1〇2、7.8'1〇1、7.8'10°、7.8'1〇-1口邑/口1^勺南方根结 线虫曲NA为模板，7: W蒸馈水为模板作为阴性对照； 图13为利用LAMP方法初步测定的用于微流体忍片等溫扩增检测的爪哇根结线虫引物 的灵敏度结果，1~5分别^1.82'1〇4、1.82'1〇3、1.82'1〇2、1.82'1〇1、1.82'10。9邑/111的爪哇 根结线虫为模板，6: W蒸馈水为模板作为阴性对照； 图14为利用LAMP方法初步测定的用于微流体忍片等溫扩增检测的南方根结线虫引物 的灵敏度结果，1~6:分别^7.8'1〇4、7.8'1〇3、7.8'1〇2、7.8'1〇1、7.8'10°、7.8'1〇-1口邑/口1^勺 南方根结线虫曲NA为模板，7: W蒸馈水为模板作为阴性对照； 图15为W浓度为Γ1〇0 pg/yL的苹果根结线虫曲ΝΑ为模板，微流体忍片等溫扩增检测 方法的灵敏度实验结果，PC:阳性对照； 图16为W浓度为1.78^10-1 pg/yL的北方根结线虫曲NA为模板，微流体忍片等溫扩增检 测方法的灵敏度实验结果，PC:阳性对照； 图17为^2.33/10<^9旨/111的花生根结线虫曲魁为模板，微流体忍片等溫扩增检测方法 的灵敏度实验结果，PC:阳性对照； 图18为Wl.82/l〇ipg/yL的爪哇根结线虫曲NA为模板，微流体忍片等溫扩增检测方法 的灵敏度实验结果，PC:阳性对照； 图19为^7.8^100 pg/yL的南方根结线虫曲NA为模板，微流体忍片等溫扩增检测方法 的灵敏度实验结果，PC:阳性对照； 图20为W花生根结线虫、爪哇根结线虫、南方根结线虫的混合曲NA为模板，微流体忍片 等溫扩增检测方法的多指标同步检测的结果；； 图21为W苹果根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫、爪哇根结线虫、南方根结线虫5 种根结的混合曲NA为模板，微流体忍片等溫扩增检测方法的多指标同步检测的结果；； 图22为W1/1000条苹果根结线虫2龄幼虫曲NA为模板，微流体忍片等溫扩增的灵敏度 结果;PC:阳性对照； 图23为W1/1000条北方根结线虫2龄幼虫曲NA为模板，微流体忍片等溫扩增的灵敏度 结果;PC:阳性对照； 图24为W1/1000条花生根结线虫2龄幼虫曲NA为模板，微流体忍片等溫扩增的灵敏度 结果;PC:阳性对照； 图25为W1/100条爪哇根结线虫2龄幼虫曲NA为模板，微流体忍片等溫扩增的灵敏度结 果;PC:阳性对照； 图26为W1/1000条南方根结线虫2龄幼虫曲NA为模板，微流体忍片等溫扩增的灵敏度 结果;PC:阳性对照。
【具体实施方式】
[0012] W下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[OOU]实施例1 等溫扩增微流体忍片检测根结线虫的方法的建立 1、引物设计:分别根据苹果根结线虫的核糖体DNA的内转录间隔区序列(rDNA-ITS)、北 方根结线虫的核糖体DNA的内转录间隔区序列(rDNA-ITS)、花生根结线虫的基因间隔区序 列（IGS2)、爪哇根结线虫的SCAR序列、W及南方根结线虫的RAPD序列各设计Ξ对引物序列， 建立等溫扩增微流体忍片检测体系，完成苹果根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫、爪 哇根结线虫，W及南方根结线虫的检测，其中， 用于检测苹果根结线虫的引物序列是： Mma-F3：TGCTGCTGGATCATTACAC, Mma-B3: TCCTGGGCTCATTAAGTCT, Mma-FIP: CGACGTATCCTCCCAATCTTGTCGCAATGAGCCTTGTTATTG， Mma-BIP: CGACTCTCGTCGTGTAACGGGATGGCACAACTGCTCAG, Mma-LF：CGTGGAGTAGACGAAGAAATCT, Mma-LB：CTACGCTGGTGTCTGTGT； 用于检测北方根结线虫的引物序列是： Mha-F3:GGGTTTAAGACTTAATGAGCCT， Mha-B3:CGCTGCGTACCAACATTA， Mha-FIP:GCAGTTCGCACAAATTATCGCATTTTATCCTTGTCGGTGGATC， Mha-BIP:TTTGAATGCAAATTGCGGCACTAAAATGACCCTGAACCAGAC， Mha-LF:AGCTGCGTTCTTCATGGAT， Mha-LB：GGGTAGAACCCTTTGCCA； 用于检测花生根结线虫、爪哇根结线虫和南方根结线虫的通用引物序列是： Mar-F3： GCGGTATGGTCGTAATCAAT, Mar-B3：AATGACAGCTGATAACATACT, Mar-FIP：TTTCTCTCCACGAGTTTCTAGATTCGATGTTCGCTGTTCG, Mar-BIP：TCCTTTATTGACTCTCGCTGCAATCGGCTAAATTCCTGACAA, Mar-LF：AGCCCAATTTGAGTTTTCCTTT, Mar-LB：AAATTAATTTGGCTTCTGGCAA； 用于检测爪哇根结线虫的引物序列是： Mja-F3: ACACTGTTACGTATCAACTTGT， Μja-B3:TAAACCCAGCTAGGAACCA， Μja-FIP:CGATTTCCGACTTTTGAGCCATAATGACGAAGGTGTCGGA， Μja-BIP:TCGGAAATCGGAATTCCAGCCATTTTCCCCATTTATTCGCAAG， Mja-LF:CGATTTCCGACAGTTCCCA， Mja-LB：GGGGTAATAATGGGGTGTTGT； 用于检测南方根结线虫的引物序列是： Min-F3：TTTCCTCAATAGGACGGTATAC, Min-B3：ACGAACCGCGATATTTCAA, Min-FIP：AAAATCTGTTTCGGCACACCCTATCCAAGACCCAATGGC, Min-BIP:AAAAGCAAAAGACGAAGCACCAATACCAGGGATGTGCCTT， Min-LF:CCCTGGTTTCAGGACCTATG， Min-LB：GACGAAAATTCGGCAAAAAGC 〇
[0014] 2.样品DM提取 线虫群体基因组DM的提取:取各群体的80-100条根结线虫的2龄幼虫，用组织基因组 DNA提取试剂盒（Tissue DNA Kit D3396-01，0mega Bi〇-Tek，USA)提取基因组DNA，将提取 的DNA溶解于50化dd出0中，用Nano化op 2000分光光度计测定浓度，用作微流体忍片等溫 扩增的模板，-30°C胆存备用。
[0015] 单条2龄幼虫线虫基因组DNA的提取，具体步骤如下：将单条线虫放入预先加有10 化d地2〇的离屯、管中，-80°C冷冻过夜。85°C溫育5 min后加入2化蛋白酶Κ(1〇 mg/mL)和8 化 10X化sy Taq Buffer,震荡混合后5000 g离屯、1 min，56°C溫育1 h，95°C 15 min。所得 基因组DNA用作微流体忍片等溫扩增的模板，-3(TC胆存备用。
[0016] 3.碟式忍片的设计与点制 碟式忍片采用的是北京博奥晶典生物技术有限公司的微流体碟式忍片，并将其改进为 二样本22个反应池（即2* 11型）（如图2所示）。忍片分I和II两个片区。每个片区包括反应池、 缓冲池、主通道、进（出）样孔。忍片点制前，首先自主设计并确定各检测引物与反应池之间 的对应关系（表1)，过程中，首先将选好的各根结线虫的引物依次点至忍片各反应池，并脱 水处理。每个反应池内的引物包括F3/B3各0.2 pmol，FIP/BIP各1.6 pmol，LF/LB各0.4 pmoLW不含DNA的无菌水作为阴性对照，同时设置阳性内对照W保证试剂、忍片点制、仪器 运行无误。通过空压机(北京北仪兴源涛机电设备有限公司）对忍片进行冲压，保证忍片的 密闭性。
[0017] 表1等溫扩增微流体忍片各指标排布
[0018] 4.配置反应体系：反应体系各成分的终浓度分别为：dNTPs 1.4mmol/L，Tris- 肥1(抑 8.8) 20mmol/L，KCl 10mmol/L，MgS〇4 6.5mmol/L，（NH4)2S〇4 lOmmol/L'Triton X- 100 0.1%，I'EvaGreen (Biotium Inc., California, USA)染料，8U Bst DM 聚合酶大片 段（New lingland Biolabs)，F3/B3各0.2 pmol，FIP/BIP各1.6 pmol，LF/LB各0.4 pmol，加 双蒸水补足反应体系，1个片区所需的反应体系为22 pL。
[0019] 5.碟式忍片上的LAMP反应:将上述反应体系22化与2化样品模板混合后，通过 进样孔，一次性加入进忍片，6000 rpm离屯、30 S，将液体均匀分散到各反应池，每个反应池 内的体积约为1.化L。将忍片放置在晶忍RTisochip-A恒溫扩增微流控忍片核酸分析仪(北 京博奥晶典生物技术有限公司）上，进行LAMP反应。该仪器会采用末端检测法的方式进行巧 光信号的采集，反应结果W巧光曲线的形式实时呈现，亦可在反应结束后由该仪器自行完 成结果判定，其中阳性结果W"+"表示，阴性结果表示。LAMP扩增反应的溫度为63°C， 反应时间为60 min。
[0020] 实施例2 使用本发明的引物进行根结线虫微流体忍片等溫扩增检测的特异性测定 采用上述实施例1的步骤2线虫群体基因组DNA的提取方法，提取各线虫的基因组DNA。 利用所设计的引物，分别w苹果根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫、爪哇根结线虫w 及南方根结线虫等5个种的基因组DNA(103 pg/yL)为模板，按上述实施例1的步骤3、4和5进 行微流体忍片等溫扩增反应，验证引物的特异性，蒸馈水作为阴性对照。结果如图3-图7所 示，针对除花生根结线虫W外的4个种设计的特异性LAMP引物皆能特异地扩增出各自的目 标种。花生根结线虫的判断可结合爪哇根结线虫的引物、南方根结线虫的引物，W及花生、 爪哇和南方根结线虫3个物种的通用引物完成，即通用引物扩增阳性，而爪哇根结线虫和南 方根结线虫的引物扩增均为阴性时，判定花生根结线虫检测阳性。同时发现一张忍片上，同 个指标的阳性扩增时间基本趋于一致。
[0021] 实施例3 使用本发明的引物进行根结线虫微流体忍片等溫扩增检测的灵敏度测定 采用上述实施例1的步骤2线虫群体基因组DNA的提取方法，提取各线虫的基因组DNA， 并进行10倍梯度稀释。首先，选择各物种的引物，W不同浓度的线虫基因组DNA为模板，在 PCR管中进行实时巧光LAMP反应，初步确定各自引物的检测灵敏度;其次，W各个种PCR管中 LAMP灵敏度浓度及继续稀释10倍后的曲NA为模板，按上述实施例1的步骤3、4和5进行忍片 上的LAMP反应，确定其灵敏度。结果如图9-19所示，使用本发明提供的引物进行管中LAMP反 应(图9- 13所示)和微流体忍片反应（图14- 19所示)时获得的灵敏度是一致的，因此，微流 体忍片检测的灵敏度依次为：苹果根结线虫1 pg/yL、北方根结线虫0.18 pg/yL、花生根结 线虫2.33 pg/yL、爪哇根结线虫18.2 pg/yL、南方根结线虫7.8 pg/yL。
[0022] 实施例4 用本发明等溫扩增微流体忍片技术进行多指标同步检测的测定。
[0023] 采用上述实施例1的步骤2线虫群体基因组DNA的提取方法，提取各线虫的基因组 DNA，并进行10倍梯度稀释。将5种根结线虫的基因组DNAW不同组合进行混合，混合使用的 基因组DNA浓度是比忍片灵敏度浓度提高5倍。组合1:花生根结线虫、爪哇根结线虫、南方根 结线虫（如图20所示）；组合2:苹果根结线虫、山茶根结线虫、北方根结线虫、象耳豆根结线 虫、花生根结线虫、爪哇根结线虫、南方根结线虫（如图21所示）。混合后的基因组DNA为模 板，依据实施例1步骤4和步骤5,进行微流体忍片的LAMP反应。结果如图20-21所示，在模板 浓度为5倍灵敏度浓度的条件下，各模板间未出现互相干扰的情况，两组样本均能获得预期 的扩增。其中象耳豆根结线虫的LAMP等溫扩增方法参见文献：Evaluation of loop- mediatedisothermal amplification (LAMP) assays based on 5S rDNA-IGS2 regions for detecting Meloidogyne enterolobii;，J. H. Niuabc, H. Jiana*, Q. X. Guoa, C. L. Qiena, X. Y. Wanga, Q. Liua and Y. D. Guoc'Plant Pathology (2012) 61, 809-819;山茶根结线虫的LAMP等溫扩增方法参见文献：山茶根结线虫的LAMP-LFD快速检测 方法，农业生物技术学报，蔡怡，周前进，顾建锋，陈先锋，陈炯，2016年01月17日。
[0024] 实施例5 使用本发明的引物进行根结线虫微流体忍片等溫扩增检测的单虫灵敏度的测定 采用上述实施例1的步骤2单条2龄幼虫线虫基因组DNA的提取方法，提取各线虫的基因 组DNA，并进行10倍梯度稀释，并W此为模板，按上述实施例1的步骤3、4和5进行忍片上的 LAMP反应。结果如图22-26所示，5个种的单条2龄幼虫在一定的基因组DNA浓度下均可利用 微流体忍片等溫扩增方法进行检测，单条虫体的检测灵敏度分别为:苹果根结线虫、北方根 结线虫、花生根结线虫W及南方根结线虫可检测到1/1000条2龄幼虫的基因组DNA，爪哇根 结线虫可检测到1/100条2龄幼虫的基因组DNA。
[0025] 实施例6 用本发明的的引物建立的基于微流体忍片技术的等溫扩增检测根际±壤中的根结线 虫 1.样本收集 收集中国5个省份（山东，云南，福建，海南，江苏）不同植物（番茄 esculentwn)去觀減，罗巧Jibipodocaijms macro曲 yllus)，絮礙(Xamellia sasanqim)) 的根际±壤样品共54份。
[0026] 2.线虫分离及虫体基因组DNA提取 先用贝尔曼漏斗法将±壤样品中的线虫进行分离，W传统形态学方法进行鉴定，然后 依据上述实施例1的步骤2单条2龄幼虫线虫基因组DNA的提取方法，提取各线虫的基因组 DNA。
[0027] 3.微流体忍片上进行等溫扩增LAMP反应 W本实施例步骤2获取的基因组DNA为模板，按上述实施例1的步骤3、4和5进行忍片上 的LAMP反应。
[0028] 结果表明，用贝尔曼漏斗法将根结线虫分离之后，通过形态学方法鉴定出阳性样 本16个，检测到的根结线虫包括南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫、北方根结线 虫、象耳豆根结线虫;未检测到山茶根结线虫和苹果根结线虫。利用该忍片体系成功从田间 样品中检测出17个阳性样本，与传统方法鉴定结果一致的有15个样本。（表2)。表2利用传 统的形态学方法和等溫扩增微流体忍片对实际样品中根结线虫的检测结果
[0029] 上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通 技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护 范围。
【主权项】
1.一种基于微流体芯片技术的5种根结线虫等温扩增检测引物序列，其特征在于根据 苹果根结线虫的核糖体DNA的内转录间隔区序列(rDNA-ITS)、北方根结线虫的核糖体DNA的 内转录间隔区序列(rDNA-ITS)、花生根结线虫的基因间隔区序列（IGS2)、爪哇根结线虫的 SCAR序列、以及南方根结线虫的RAPD序列各设计三对引物序列，其中用于检测苹果根结线 虫的引物序列是： Mma-F3:TGCTGCTGGATCATTACAC， Mma-B3: TCCTGGGCTCATTAAGTCT, Mma-FIP: CGACGTATCCTCCCAATCTTGTCGCAATGAGCCTTGTTATTG， Mma-BIP: CGACTCTCGTCGTGTAACGGGATGGCACAACTGCTCAG, Mma-LF:CGTGGAGTAGACGAAGAAATCT， Mma-LB：CTACGCTGGTGTCTGTGT； 用于检测北方根结线虫的引物序列是： Mha-F3:GGGTTTAAGACTTAATGAGCCT， Mha-B3:CGCTGCGTACCAACATTA， Mha-FIP:GCAGTTCGCACAAATTATCGCATTTTATCCTTGTCGGTGGATC， Mha-BIP:TTTGAATGCAAATTGCGGCACTAAAATGACCCTGAACCAGAC， Mha-LF:AGCTGCGTTCTTCATGGAT， Mha-LB：GGGTAGAACCCTTTGCCA； 用于检测花生根结线虫、爪哇根结线虫和南方根结线虫的通用引物序列是： Mar-F3： GCGGTATGGTCGTAATCAAT, Mar-B3：AATGACAGCTGATAACATACT, Mar-FIP：TTTCTCTCCACGAGTTTCTAGATTCGATGTTCGCTGTTCG, Mar-BIP：TCCTTTATTGACTCTCGCTGCAATCGGCTAAATTCCTGACAA, Mar-LF：AGCCCAATTTGAGTTTTCCTTT, Mar-LB：AAATTAATTTGGCTTCTGGCAA； 用于检测爪哇根结线虫的引物序列是： Mja-F3: ACACTGTTACGTATCAACTTGT， Mja-B3:TAAACCCAGCTAGGAACCA， Mja-FIP:CGATTTCCGACTTTTGAGCCATAATGACGAAGGTGTCGGA， Mja-BIP:TCGGAAATCGGAATTCCAGCCATTTTCCCCATTTATTCGCAAG， Mja-LF：CGATTTCCGACAGTTCCCA, Mja-LB：GGGGTAATAATGGGGTGTTGT； 用于检测南方根结线虫的引物序列是： Min-F3:TTTCCTCAATAGGACGGTATAC， Min-B3：ACGAACCGCGATATTTCAA, Min-FIP:AAAATCTGTTTCGGCACACCCTATCCAAGACCCAATGGC， Min-BIP：AAAAGCAAAAGACGAAGCACCAATACCAGGGATGTGCCTT, Min-LF:CCCTGGTTTCAGGACCTATG， Min-LB：GACGAAAATTCGGCAAAAAGC 〇2. -种根据权利要求1所述的基于微流体芯片技术的5种根结线虫等温扩增检测引物 序列的应用，其特征在于具体检测步骤如下： 1) 碟式芯片的设计与点制 将微流控碟式芯片由原来的单样本24个反应池改进为二样本22个反应池，芯片分I和 II两个片区，每个片区11个反应池;在芯片点制过程中，首先将选好的苹果根结线虫、北方 根结线虫、花生根结线虫、爪哇根结线虫以及南方根结线虫的引物依次点至芯片各反应池， 并脱水处理，每个反应池内的引物包括F3/B3各0.2 pmol，FIP/BIP各1.6 pmol，LF/LB各0.4 pmol，以无菌水作为阴性对照，同时设置阳性内对照； 2) 配置反应体系 反应体系各成分的终浓度分别为：dNTPs 1.4mmol/L，Tris-HCl(pH 8.8) 20mmol/L， KC1 10mmol/L，MgS〇4 6.5mmol/L，（NH4)2S〇4 10mmol/L，Triton X-100 0.1%,1'EvaGreen染 料，8U Bst DNA聚合酶大片段，加双蒸水补足反应体系，1个片区所需的反应体系为22 uL; 3) 碟式芯片上的LAMP反应 将上述反应体系22 uL与2 uL样品模板混合后，通过进样孔，一次性加入进微流控碟式 芯片，6000 rpm离心30 s，将液体均匀分散到各反应池，每个反应池内的体积约为1.4yL;将 芯片放置在晶芯RTisochip-A恒温扩增微流控芯片核酸分析仪进行荧光信号的采集，反应 结果以荧光曲线的形式实时呈现，其中阳性结果以"+"表示，阴性结果以表示。3. 根据权利要求1所述的基于微流体芯片技术的5种根结线虫等温扩增检测方法，其特 征在于:LAMP扩增反应的温度为63°C，反应时间为60 min。
【文档编号】C12N15/11GK106011246SQ201610380126
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月1日
【发明人】陈炯, 周前进
【申请人】宁波大学