Sfrp3基因启动子甲基化检测的引物和检测方法

文档序号:10645291阅读:881来源:国知局
Sfrp3基因启动子甲基化检测的引物和检测方法
【专利摘要】本发明公开了SFRP3基因启动子区多CG位点甲基化检测的引物和方法包括:(1)扩增SFRP3基因启动子区的正、反向兼并引物SEQ NO 1和SEQ NO 2;(2)上述引物扩增的目标序列包括至少8个CG位点;(3)针对石蜡切片DNA片段化严重,而亚硫酸氢盐修饰饱和状态下仍呈现有效模板浓度低的问题,将Touch?down PCR扩增和Sanger测序相结合,可显著提高检测灵敏度。本发明具有特异性高,准确度高以及低污染风险等优点,可检测肿瘤患者手术石蜡切片SFRP3基因启动子区多个CG位点甲基化,结果可指导医生进行相关疾病的预后评估。
【专利说明】
SFRP3基因启动子甲基化检测的引物和检测方法
技术领域
[0001] 本发明属生命科学和生物技术领域,是一种检测SFRP3基因启动子甲基化状态的 引物和检测方法。
【背景技术】
[0002] Wnt信号通路在胚胎发育、组织内稳态及肿瘤发生和发展等生物学行为中发挥重 要作用,许多因素影响Wnt信号的表达。分泌型卷曲相关蛋白(SFRPs)家族是重要的Wnt括抗 因子,它们在胞外与Wnt或其受体Fz结合抑制Wnt信号的传递。分泌型卷曲相关蛋白3 (SFRP3)作为最早发现的SFRPs成员,其启动子甲基化导致的沉默与恶性肿瘤的发生和发展 密切相关,故SFRP3通常被认为是一种抑癌基因,SFRP3被观察到促进癌细胞的生长、侵袭, 并抑制其调亡。
[0003] SFRP3的异常表达往往致使疾病的发生。过度表达可导致屯、室肌细胞调亡、肢带肌 萎缩症2A、风湿性关节炎和骨关节炎等。SFRP3还与脂肪生成、肥胖症及能量与葡萄糖平衡 有关。在恶性肿瘤中SFRP3及其家族其他成员启动子区异常甲基化导致的表达下调,表明其 功能减弱或丧失使Wnt途径异常激活导致肿瘤发生,反映了它们可能的抑癌基因特性。
[0004] SFRPs启动子甲基化对结直肠癌、腺瘤、异常隐窝病灶及结直肠癌细胞系PK0、 HCT116、SW480都有影响。在黑色素瘤细胞系中发现SFRP3的启动子CpG岛甲基化,去甲基化 药物 5-aza-2 ' -deoxyc}ftidine 可使 SFRP3 重新表达。
[0005] 在其30%的前列腺癌标本和LNCaP(前列腺癌细胞)、PC-3(前列腺癌细胞KDU145 (人前列腺癌细胞K22RV1(前列腺癌细胞)前列腺癌细胞系中发现了 SFRP3的甲基化现象, 且在雄激素非依赖型的前列腺癌细胞中,SFRP3表现出抑制癌细胞生长和侵袭的作用,同样 说明SFRP3可能是前列腺癌的抑癌基因,甲基化导致的沉默与前列腺癌的发生有关。
[0006] 目前对于SFRP3启动子甲基化检测的常规方法有:甲基化特异性PCR(MSP)、亚硫酸 氨盐焦憐酸测序、甲基化敏感性高分辨率烙解曲线分析(MS-HRM),甲基化特异性PCR(MS- PCR)等。其中MSP法是使用PCR扩增检测来判断样本是否存在甲基化,该法实用且普遍,但假 阳性较高,稳定性较差;亚硫酸氨盐焦憐酸测序因其操作繁琐,因此不适合大批量检测;MS- HRM是通过将单碱基序列的差异转变成烙解曲线的差异,从而判断是否存在甲基化,运种方 法对仪器的要求颇高,需要带HRM模块的巧光定量PCR仪,同时该法只能分析检测片段整体 甲基化状态,而不能明确每个CG位点的甲基化状态;MS-PCR是基于PCR开发的技术,主要是 在检测中加入了 TaqMan探针,从而保证了较高的灵敏度和准确度,但其对于多个甲基化位 点的检测,也只能做到整体化分析,同时探针成本较高,因此该法较适用于少数位点大量样 本检测。
[0007] 本发明采用Touch-down PCR扩增和Sanger测序法SFRP3启动子甲基化检测,针对 石蜡切片DNA片段化严重,在造成亚硫酸氨盐处理饱和的情况下,仍出现的有效模板浓度很 低的情况,Touch-down PCR扩增可确保正、反向扩增引物与样本DNA模板的结合发生在最互 补的序列之间,当退火溫度降低到非特异性扩增发生的水平时,特异性扩增产物在此时已 经有一个几何数的起始优势,丰度较高,在剩余的扩增反应中,特异性扩增产物与非特异扩 增产物产生竞争,但是因非特异性扩增产物丰度较低,特异性扩增产物始终优先扩增,从而 产生单一的占主导地位的特异性扩增产物。而Sanger测序法是检测基因突变的金标准,检 测结果准确性高,并且很大程度上地节省了检测成本。
[000引由于DNA序列在经亚硫酸盐处理后,其部分C碱基会转变为T,导致序列区域内CG含 量和TM值发生较大程度的变异,进而影响常规引物设计软件在其序列上获得理想的引物序 列。因此,本发明中PCR采用的扩增引物W及测序引物均为自行设计,其中测序引物使用兼 并碱基,从而使得阴性、阳性都可在同一体系扩增。同时,扩增引物的使用比例经过多次优 化实验,相对于其它文献和软件设计的引物具备了更加理想的扩增效率。
[0009] 因此,本发明的检测方法具备了检测出率高,检测稳定性好,准确度高W及低污染 风险等优势。检测结果将有助于预见相关肿瘤疾病的早期,同时具有潜在的指导临床医生 个体化治疗的作用。

【发明内容】

[0010] 为解决上述技术问题,本发明采用的一个技术方案是:设计用于检测SFRP3基因启 动子甲基化的引物,包括一对特异性扩增兼并引物SEQ NO 1和SEQ N02,其序列为:
[0011] 沈Q NO 1:5 ' -GGGGAATTTGATTTMGGAAG-3 ' ;
[0012] SEQ NO 2:5'-AACRAACTCACAAACTACAACCC-3';
[0013] 所述沈Q NO 1和沈Q NO 2也可作为测序引物。
[0014] 本发明提供的另一个技术方案是:用于检测SFRP1基因启动子甲基化的方法,包 括:
[001引(1)提取样本中的DM;
[0016] (2)将步骤(1)中提取的DM进行亚硫酸氨盐处理;
[0017] (3似步骤(2)中的DNA作为模板,使用SEQ NO巧PSEQ NO 2扩增SFRP3基因片段,获 得PCR扩增产物;
[0018] (4)对步骤(3)中获得的产物测序;
[0019] (5)根据步骤(4)的测序结果,得到序列CG位点的甲基化结果;
[0020] 其中,PCR扩增反应条件为:第一阶段,92-97 °C预变性5-15min;第二阶段,变性溫 度92-97°C30sec,退火溫度62-66°C90sec,延伸溫度72°C30sec,循环12-18次,每循环一次, 所述退火溫度降低0.5°C ;第Ξ阶段,变性溫度92-97°C30sec,退火溫度53-57°C30sec,延伸 溫度72°C30sec,循环24-34次;第四阶段,72°C10min;第五阶段,扩增反应结束,扩增产物在 4°C下保存。
[0021] 所述的测序为Sanger测序,测序引物为:
[0022] 沈Q NO 1:5' -GGGGAATTTGATTTMGGAAG-3' ;
[0023] 沈Q NO 2:5'-AACRAACTCACAAACTACAACCC-3';
[0024] 该方法检测的样本为石蜡切片样本、全血样本、新鲜组织样本或细胞系样本。
[0025] 更进一步地,本发明提供一种用于检测SFRP3基因启动子甲基化的试剂盒的技术 方案,包括亚硫酸盐修饰、PCR扩增试剂W及Sanger测序试剂、阳性对照品、阴性对照品,其 中:
[00%] (1)亚硫酸盐处理试剂包括:Bisulfite Mix、脚ase free wate;r、DNA Protect Buffer;
[0027] (2)PCR扩增试剂:10冲CR Buffer、2mM dNTP、5*Q Solution Buffer、5U/ul Taq 酶、lOuM扩增引物(SEQ NOl、沈Q NO 2)W及灭菌水;
[0028] (3)酶纯化试剂:EX0I、CIP;
[0029] (4)测序试剂:Bigdye Terminator V3.1、无水乙醇、EDTA、及测序引物(SEQ NO 1、 沈Q NO 2)。
[0030] 其中,阳性对照品为经过所有胞喀晚甲基化修饰的全甲基化正常人群血液基因组 DNA,阴性对照品为正常人群血液基因组DNA。
[0031] 本发明采用Touch-down PCR扩增和Sanger测序法SFRP3启动子甲基化检测,针对 石蜡切片DNA片段化严重,在造成亚硫酸氨盐处理饱和的情况下,仍出现的有效模板浓度很 低的情况,Touch-down PCR扩增可确保正、反向扩增引物与样本DNA模板的结合发生在最互 补的序列之间,当退火溫度降低到非特异性扩增发生的水平时,特异性扩增产物在此时已 经有一个几何数的起始优势,丰度较高,在剩余的扩增反应中,特异性扩增产物与非特异扩 增产物产生竞争,但是因非特异性扩增产物丰度较低,特异性扩增产物始终优先扩增,从而 产生单一的占主导地位的特异性扩增产物。而Sanger测序法是检测基因突变的金标准,检 测结果准确性高,并且很大程度上地节省了检测成本。
[0032] 由于DNA序列在经亚硫酸盐处理后,其部分C碱基会转变为T,导致序列区域内CG含 量和TM值发生较大程度的变异,进而影响常规引物设计软件在其序列上获得理想的引物序 列。因此,本发明中PCR采用的扩增引物W及测序引物均为自行设计,其中测序引物使用兼 并碱基,从而使得阴性、阳性都可在同一体系扩增。同时,扩增引物的使用比例经过多次优 化实验,相对于其它文献和软件设计的引物具备了更加理想的扩增效率。
[0033] 因此,本发明的检测方法具备了检测出率高,检测稳定性好,准确度高W及低污染 风险等优势。检测结果将有助于预见相关肿瘤疾病的早期,同时具有潜在的指导临床医生 个体化治疗的作用。
【附图说明】
[0034] 图1是本发明的检测基因甲基化的方法检测标准序列,(A)图为阴性标准序列,(B) 图为阳性标准序列。
[0035] 图2是本发明的检测基因甲基化的方法一较佳实施例中阴性检测的结果图(A)和 阳性结果的图(B)。
【具体实施方式】
[0036] 下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应当注意的是,实施例中未说明的常规 条件和方法,通常按照所属领域实验人员常规采用方法:譬如,奥斯柏和金斯顿主编的《精 编分子生物学实验指南》第四版,或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
[0037] 实施例1
[003引 SFRP3基因启动子区CG岛甲基化检测试剂盒包括一对特异性兼并引物SEQ NO 1和 SEQ NO 2,同时,此引物为测序引物,其碱基序列如下所示:
[0039] 沈Q NO 1:5 ' -GGGGAATTTGATTTMGGAAG-3 ' ;
[0040] 沈Q NO 2:5 '-AACRAACTCACAAACTACAACCC-3 ';
[0041 ] SFRP3基因启动子区CG岛甲基化检测试剂盒还包括如下试剂:
[0042] (1)亚硫酸盐处理试剂:Bisulfite Mix、R化se free wate;r、DNA Protect Buffer;
[0043] (2)PCR扩增试剂:10冲CR Buffer、2mM dNTP、5*Q Solution Buffer、5U/ul Taq 酶、lOuM扩增引物(SEQ NOl、沈Q NO 2)W及灭菌水;
[0044] (3)酶纯化试剂:EX0I,CIP;
[0045] (4)测序试剂:Bigdye Terminator V3.1,无水乙醇,EDTA,及测序引物(SEQ NO 1, 沈Q NO 2)。
[0046] (5)阳性质控品:已确定的SFRP3基因启动子区CG岛甲基化的DM。阴性质控品:已 确定的SFRP3基因启动子区CG岛无甲基化的DNA。空白对照品:灭菌水。
[0047] 实施例2
[004引 DNA提取试剂和方式。
[0049] 取石蜡切片(5-10皿厚,lXlcm2大小)5-則长,将石蜡包埋组织收集到1.5mL离屯、管 内,短暂离屯、;加入ImL组织透明液,充分振荡,13200rpm离屯、Imin,移除上清液;加入0.5mL 组织透明液,充分振荡,13200巧m离屯、Imin,移除上清液;加入ImL乙醇(96-100 % ),剧烈振 荡,13200巧m室溫离屯、2min,移除上清液;打开盖子,室溫(15-25°C)或金属浴37°C解育直到 剩余乙醇完全挥发;取18化L Buffer A化对管内组织进行吹吸重悬,然后加入20化蛋白酶 K,再次振荡;将含有混合液的离屯、管置于56°C的金属浴上,解育比,期间颠倒混匀3次,直至 样品完全溶解;将离屯、管转移至90°C的金属浴上,再次解育化;短暂离屯、,将管盖上的溶液 甩至管底;向管内加入20化L Buffer AL,充分振荡混匀。然后加入20化L乙醇(96-100%), 再次振荡混匀;短暂离屯、,将管盖上的溶液甩至管底;小屯、将混合液用移液器转移至含有 QIAamp Mi址lute column吸附柱的2mL收集管内,800化pm离屯、Imin,弃收集管,将吸附柱置 于一个新的收集管上;向吸附柱内加入50化L Buffer AW1,务必不要打湿吸附柱管口边缘。 800化pm离屯、Imin,弃收集管,将吸附柱置于一个新的收集管上;向吸附柱内加入500μΙ Buffer AW2,务必不要打湿吸附柱管口边缘。800化pm离屯、Imin,弃收集管,将吸附柱置于一 个新的收集管上;13200rpm室溫离屯、3min,W彻底甩掉吸附膜上残留的溶液;将吸附柱将吸 附柱置于一个干净的1.5mL离屯、管上(自备),小屯、向膜中央滴加50化Buffer ATE; 1320化pm室溫离屯、Imin,取收集到的DNA溶液1.扣L用Nano化op检测所得DNA的浓度和纯度; 将剩余的DNA溶液于-20°C保存。
[00加]实施例3
[0化1 ] 亚硫酸盐处理试剂和方法如下。
[0化2] 操作步骤:将实施例2提取的基因组DNA与1.5παΕΡ管中使用双蒸水稀释至50ul加 5.5ul新鲜配制的3M化0扣容液,42°C水浴30min ;水浴期间配制W下溶液:lOmM氨酿溶液 化y化yquinone):取55mg氨酿于50ml水中溶解;3.6mol/LNaHS〇3:取 18.8g 化HS03加入40ml 水中,并W3MNa0田容液调节溶液PH至5.0,最终定容至50ml。加30ul lOmM氨酿溶液和520ul 3.6mo 1/LNaHS化至上述水浴后溶液中,EP管外包裹W侣锥纸避光,轻柔颠倒混匀溶液,管内 加 lOOul石蜡油,短暂离屯、使石蜡油盖住液面,防止水浴过程中水分的蒸发并限制氧化50°C 避光水浴16h;水浴完后将移液器枪头伸入石蜡油层下,先轻轻加压使其中一小段石蜡油排 出,然后小屯、吸取约580U1DNA溶液至洁净的1.5mlEP管中,使用PCR产物回收试剂盒回收 DNA,所得到的DNA溶于50ul去离子水,加5.5ul新鲜配制的3MNaOH,室溫放置15min,然后加 33ul 10M乙酸锭中和NaOH,使溶液PH=7,也加入4ul lOmg/ml葡萄糖作为沉淀位置指示剂, 加入270ul冰无水乙醇,至于-20°C,过夜沉淀后,4°C,12000巧m离屯、,30min,倒掉上清液,收 集沉淀,加入500U170%乙醇,洗剂沉淀,4°C 12000巧m,5min离屯、两次;倒掉上清,室溫干燥 至沉淀由不透明变为半透明或透明时,依DNA沉淀多少加入30-50U1双蒸水溶解沉淀。
[0053]利用本发明所述的DNA亚硫酸氨钢处理试剂和方法,可W获得更高的DNA回收率, 高转化率,同时可W降低DNA降解率和片段化率,从而提高了PCR扩增和后续分析技术的灵 敏度。
[0054] 实施例4
[0055] PCR检测方法如下。
[0056] PCR引物为:所有引物纯度达到PAGE级或HPLC级,不含杂带。提供合成结构出具的 合成产物的质检证明,如PAGE电泳结果或HPLC分析图谱,证明使用引物达到检测要求。 SFRP3的引物序列如下:
[0化7 ]沈Q NO 1:5 ' -GGGGAATTTGATTTMGGAAG-3 ' ;
[005引 SEQ NO 2:5'-AACRAACTCACAAACTACAACCC-3';
[0059] PCR检测反应体系为:8-10 X PCR缓冲液、0.8-1.2mM dNTPs、0.8-1.2uM扩增引物 (沈Q NO 1和沈Q NO 2)、0.5-2ng模板DNA,0.05-0.1U/ul DM聚合酶。
[0060]所述dNTPs包括:10mM dATP、10mM dCTP、10mM dTTP、10mM dGTP。
[0061 ]所述PCR缓冲液包括:TRIS.化、氯化钟、硫酸儀和氯化儀。
[0062] PCR检测的反应条件为:第一阶段,92-97 °C预变性5-15min;第二阶段,变性溫度 92-97°C30sec,退火溫度62-66°C90sec,延伸溫度72°C30sec,循环12-18次,每循环一次,所 述退火溫度降低0.5°C ;第Ξ阶段,变性溫度92-97°C30sec,退火溫度53-57°C30sec,延伸溫 度72 °C 30sec,循环24-34次;第四阶段,72 °C lOmin;第五阶段,扩增反应结束,扩增产物在4 °(:下保存。
[006引电泳检测后将所得PCR产物进行酶纯化,测序反应,上机测序;
[0064] 所述酶纯化的反应条件为:371:5〇111111,951:5111111。所述测序反应的反应条件为:95 °C4min,95°C15S;50°C20S;60°C2min,25 个循环。
[0065] 依据相关软件获得样本的SFRP3启动子甲基化状态。W亚硫酸盐处理后的SFRP3启 动子序列为标准序列,通过软件分析获得样本的SFRP3启动子甲基化状态。
[0066] 针对石蜡切片DNA片段化严重,而亚硫酸氨盐修饰饱和状态下仍呈现有效模板浓 度低的问题,将Touch-down PCR扩增和Sanger测序相结合,可显著提高检测灵敏度。
[0067] 实施例5
[006引子宫颈癌样本检测:
[0069] 选择石蜡切片样本10例,3例为已确诊子宫颈癌样本,3例为正常人样本,其余4例 为未知样本。利用本发明的试剂盒按照实施例3中的方法进行样本DNA提取、亚硫酸处理、纯 化回收、PCR扩增、测序及结果分析。
[0070] (1)材料:待测样本、阳性质控品、阴性质控品、空白对照。
[0071] (2)仪器:移液器、高速离屯、机、NANODROP1000 、满旋震荡w、冰箱、电泳仪、凝胶拍 照系统,ABI 3500XL Genetic Analyzer,PCR仪。
[0072] (3)试剂:DM聚合酶(凯杰),DNA纯化试剂(凯杰),dNTPs (TaKaRa)、纯化水,亚硫酸 盐处理试剂(凯杰),ΕΧΟΙ(肥B),CIP(肥B),Bigdye Terminator(肥B).
[0073] (4)引物:所有引物纯度达到PAGE级或HPLC级,不含杂带。提供合成结构出具的合 成产物的质检证明,如PAGE电泳结果或HPLC分析图谱,证明使用引物达到检测要求。SFRP3 的引物序列如下:
[0074] 沈Q NO 1:5 ' -GGGGAATTTGATTTMGGAAG-3 ' ;
[00巧]沈Q NO 2:5 '-AACRAACTCACAAACTACAACCC-3 ';
[0076] (5化0?检测,反应体系为:8-10乂?0?缓冲液、0.8-1.21111(1^?3、0.8-1.2碰如权利 要求3所述的扩增引物、0.5-2ng模板DNA,0.05-0. lU/ul DNA聚合酶。
[0077] (6)所述dNTPs中包括lOmM dATP、10mM dCTP、10mM dTTP、10mM dGTP,所述PCR缓冲 液包含TRIS. CL、氯化钟、硫酸儀和氯化儀。
[007引(7)所述PCR检测的反应条件为:第一阶段,92-97 °C预变性5-15min;第二阶段,变 性溫度92-97°C30sec,退火溫度62-66°C90sec,延伸溫度72°C30sec,循环12-18次,每循环 一次,所述退火溫度降低0.5°C;第Ξ阶段,变性溫度92-97°C30sec,退火溫度53-57Γ 30sec,延伸溫度72 °C 30sec,循环24-34次;第四阶段,72°C lOmin;第五阶段,扩增反应结束, 扩增产物在4°C下保存。
[0079] (8)电泳检测后将所得PCR产物进行酶纯化,测序反应,上机测序;
[0080] (9)所述酶纯化的反应条件为:37°C50min,95°C5min。所述测序反应的反应条件 为:951:4111111,95°(:155;501:205;601:2111111,25个循环。
[0081] (10)依据相关软件获得样本的SFRP3启动子甲基化状态。W亚硫酸盐处理后的 SFRP3启动子序列为标准序列,通过软件分析获得样本的SFRP3启动子甲基化状态。
[0082] 10例样本的SFRP1基因启动子甲基化状态结果如下表所示: Γ00831
[0084]~检测样本的SFRP3基因启动子甲基化状态结果如图2所示,图2A为S4样本检测结胃 果,结果为阴性(箭头指CG位点)。图2B为为S1样本检测结果,结果为阳性(箭头指CG位点)。
【主权项】
1. 用于检测SFRP3基因启动子甲基化的引物,其特征在于,包括一对特异性扩增兼并引 物SEQ NO 1和SEQ NO 2,其序列为: SEQ NO 1:5 '-GGGGAATTTGATTTAAGGAAG-3 '; SEQ NO 2:5'-AACRAACTCACAAACTACAACCC-3'。2. 根据权利要求1所述的引物,其特征在于,扩增引物同为测序引物,所述测序引物的 序列为: SEQ NO 1:5 '-GGGGAATTTGATTTAAGGAAG-3 '; SEQ NO 2:5'-AACRAACTCACAAACTACAACCC-3'。3. -种用于检测SFRP3基因启动子甲基化的方法,包括: (1) 提取样本中的DNA; (2) 将步骤(1)中提取的DNA进行亚硫酸氢盐处理; (3) 以步骤(2)中的DNA作为模板,使用SEQ N01和SEQ NO 2扩增SFRP3基因片段,获得 PCR扩增产物; (4) 对步骤(3)中获得的产物测序; (5) 根据步骤(4)的测序结果,得到序列CG位点的甲基化结果; 其所述引物序列为: SEQ NO 1:5 '-GGGGAATTTGATTTAAGGAAG-3 '; SEQ NO 2:5'-AACRAACTCACAAACTACAACCC-3'。4. 根据权利要求3所述的方法,其特征在于,PCR扩增反应条件为:第一阶段,92-97Γ预 变性5-15min;第二阶段,变性温度92-97°C30sec,退火温度62-66°C90sec,延伸温度72°C 30sec,循环12-18次,每循环一次,所述退火温度降低0.5°C;第三阶段,变性温度92-97Γ 30sec,退火温度 53-57°C30sec,延伸温度 72°C30sec,循环 24-34次;第四阶段,72°C10min; 第五阶段,扩增反应结束,扩增产物在4°C下保存。5. 根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述的测序为Sanger测序,测序引物为: SEQ NO 1:5 '-GGGGAATTTGATTTAAGGAAG-3 '; SEQ NO 2:5'-AACRAACTCACAAACTACAACCC-3'。6. 根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述样本为石蜡切片样本、全血样本、新 鲜组织样本或细胞系样本。
【文档编号】C12Q1/68GK106011267SQ201610516207
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月2日
【发明人】林有升, 单战, 王淑, 王淑一
【申请人】北京艾迪康医学检验所有限公司
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