基于鱼的Shh基因监测水污染的方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于鱼的Shh基因监测水污染的方法，用鱼作为检测水污染的生物样本，所述鱼的Shh基因作为水污染的敏感生物标记物；本发明的优点在于：Sonic hedgehog基因简称为Shh基因，在脊锥和无脊锥动物发育中有广泛生物学功能的信号分子，Shh基因作为监测水污染的敏感生物标记物，测试Shh基因的相对表达量，来监测水体污染的程度，该方法能灵敏反应出水体是否污染及污染程度，甚至能敏感的表达出微量污染源的水体污染；同时也能从生物的角度敏感地监测多环芳烃菲、重金属镉、多氯联苯污染的危害性和危害程度，为水体生态环境监测、毒理诊断、调控和防治提供准确、快速的科学方法。
【专利说明】
基于鱼的Shh基因监测水污染的方法
技术领域
[0001] 本发明设及水污染监测技术领域。更具体地说，本发明设及一种基于鱼的化h基因 监测水污染的方法。
【背景技术】
[0002] 随着城镇化和工农业的迅猛发展，水体污染日益加剧，其中包括菲污染、重金属儒 污染、多氯联苯污染等，其中儒是重金属污染的典型代表，多氯联苯153(PCB153)是多氯联 苯异构体中的典型代表，菲是多环芳控污染的典型代表。它们均是水生动物非必需但高致 毒元素，具有亲脂强、易富集和难降解的特性，不仅能引起动物肾、肝、睾丸损伤，肺水肿和 骨软化，而且与肾、肺、前列腺的癌变等相关，对环境、人和其他动物健康造成严重威胁。用 化学方法可W定性、定量检测菲、儒、PCB153的污染，但是无法检测其危害性和危害程度，很 难检测微量的菲、儒、PCB153污染。然而敏感生物标记物则可敏感地监测菲、儒、PCB153污染 的危害性和危害程度，为水体生态环境监测、毒理诊断、调控和防治提供准确、快速的科学 方法。
【发明内容】
[0003] 本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供一种基于鱼的化h基因监测水污 染的方法，通过鱼的化h基因作为敏感生物标记物，测试并计算化h基因的相对表达量，能敏 感地预测水体污染的程度，方法简单，易操作，能快速灵敏地检测出水体污染程度，更好的 监测水体污染，W便及时控制或治理污染。
[0004] 为了实现根据本发明的运些目的和其它优点，提供了一种基于鱼的化h基因监测 水污染的方法；
[0005] 本发明提供的技术方案为：
[0006] -种基于鱼的化h基因监测水污染的方法，其特征在于，用鱼作为检测水污染的生 物样本，所述鱼的化h基因作为水污染的敏感生物标记物。
[0007] 优选的是，建立鱼的化h基因的相对表达量与污染浓度关系的标准曲线，获 取与建立标准曲线同类同大小的待测水域的鱼，然后将计算得所述待测水域的鱼的化h基 因的相对表达量与标准曲线比对，获得污染浓度。
[000引优选的是，计算化h基因的相对表达量具体包括W下步骤：
[0009] 1)用鱼作为监测水污染的生物样本；
[0010] 2)利用RNA提取试剂，提取鱼样品总RNA，利用反转录试剂将RNA反转录合成首链 cDNA；
[0011] 3)实时巧光定量PCR检测，W首链cDNA为模板，分别根据所述化h基因的引物，所述 18s-rRNA基因的引物，在罗氏PCR仪上进行实时巧光定量PCR扩增反应，巧光定量PCR反应体 系为：5￥8时式剂12.5化、上游引物!^化^下游引物1?化^〇0臟化^灭菌蒸馈水8.扣^反应 体系总体积为25化;反应程序采用Ξ步法程序:95°C预变性30s;95°C15s 一 60°C30s 一 72°C 30s，40个循环;采集巧光信号数值Ct，Ct值是:每个反应管内的巧光信号到达设定的域值时 所经历的循环数；
[0012] 4)获得Shh基因巧光信号数值CtShh和内参基因巧光信号数值Ct 18s-rRNA后，采取 2-AAGt 法进行数据分析，Act = ctaih-Ctl8s-rRNA;
[0013] AACt = (CtSUi-Ct 18s-rRNA)实验组-(CtSUi-Ct 18s-rRNA)空白组，Slih基因的相 对表达量=，计算2-^^^得出2化基因的相对表达量。
[0014] 优选的是，所述鱼为仔鱼，将仔鱼分成若干组，其中一组作为无污染对照组，其他 组为待测水域组;分别将仔鱼放入无污染对照水体和待测水域水体中饲养;7天后随机抽取 鱼样品，检测并计算化h相对表达量如果待测水域组的值小于无污染对照组的 值，则待测水域受到污染，其污染源的浓度与待测水域组的值成负相关。
[001引优选的是，所述Shh基因的特异性引物为：
[0016] 上游引物如沈9 10備.1所示：5化斗：5'-了66〔6641'(：1^66了64了644(：-3'，
[0017] 下游引物如沈9 10備.2所示：5化-1?:5'-〔6了4(：176(：1'(：1761^〇：了61'(：1'-3'；
[001引所述鱼的内参基因为18s-rRNA基因，所述18s-rRNA基因的引物为：
[0019] 上游引物如沈Q ID NO. 3所示：18s-rRNA-F: 5' -TTGACCCAACACGGGAAACCT-3'，
[0020] 下游引物如沈Q ID NO. 4所示：18s-rRNA-R: 5 ' -CAAATCGCTCCACCAACTAAGAA-3 '。 [0021 ]优选的是，所述水污染为多环芳控污染，重金属儒污染，多氯联苯污染中的一种。
[0022] 优选的是，多环芳控污染为菲污染。
[0023] 优选的是，所述鱼的化h基因的相对表达量与所述菲，重金属儒，多氯联苯中的一 种的浓度呈负相关。
[0024] 优选的是，所述鱼为海水青鎌或淡水青鎌。
[0025] 优选的是，所述仔鱼为10天龄仔鱼。
[00%]本发明至少包括W下有益效果：
[0027] l)Sonic hedgehog基因简称为化h基因，在脊锥和无脊锥动物发育中有广泛生物 学功能的信号分子，S化基因作为监测水污染的敏感生物标记物，测试化h基因的相对表达 量，来监测水体污染的程度，该方法能灵敏反应出水体是否污染及污染程度，甚至能敏感的 检出微量污染源的水体污染;同时也能从生物的角度敏感地监测菲、重金属儒、多氯联苯污 染的危害性和危害程度，为水体生态环境监测、毒理诊断、调控和防治提供准确、快速的科 学方法。
[0028] 2)由于各实验组提取的样品重量不同;RNA提取效率不同；目的基因的扩增效率不 同，所W化h基因的巧光信号不能直接作为各实验组基因表达量的数据来进行比较，必须用 内参基因进行校正，进行相对表达量的分析。18s-rRNA基因是维持细胞基本代谢活动所必 需的基因，所Wl8s-rRNA基因作为内参基因，能更准确表述化h基因的相对表达量。
[0029] 3)S化基因作为监测水污染的敏感生物标记物，S化相对表达量能敏感的表述出至 少与多环芳控，重金属儒，多氯联苯中的一种的浓度呈负相关，能监测多种污染源，而不仅 限于单一污染源，能更大范围的监测水污染。
[0030] 本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本 发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
【具体实施方式】
[0031] 结合下面实施例对本发明做进一步的详细说明，W令本领域技术人员参照说明书 文字能够据W实施。
[0032] 实施例1
[0033] 1、水污染鱼生物样本饲养准备
[0034] 采用10天龄仔鱼做监测水污染的实验，将仔鱼分成10组，每组3个平行进行养鱼实 验，分别在表1所述的儒浓度水域环境中饲养，7天后，每个平行随机取3个鱼样品测定，每组 测定3*3 = 9个数据，将每组9个数据数理统计后，得到各组鱼的化h基因的相对表达量2 如表5所示。
[0(Χ3日]表1 10组幼鱼饲养的水域的儒浓度
[0036]
'[0037]2、利用RNA提取试剂，提取鱼样品总RNA，利用反转录试剂将RNA反转录合成首链 cDNA；
[0038] (1)快速称取冷冻的幼鱼lOOmg左右，记录实际重量为M，然后放入提前预冷的研鉢 中倒入液氮，用研巧研磨称量好的幼鱼样品，直至研磨成粉末状，然后用不诱钢小药匙迅速 将样品粉末全部移入冰浴中的玻璃匀浆管底部。
[0039] (2)用移液枪往玻璃匀浆管中加入0.6mL RNAiso试剂，充分匀浆至匀浆液呈无颗 粒透明状后，将匀浆液转入1.5ml离屯、管中。然后再向匀浆管中加入0.2mL RNAiso试剂，洗 涂匀浆棒和匀浆管管壁一次，之后将匀浆液转入之前的离屯、管中，重复上述操作一次，使加 入的RNAiso试剂总体积为ImL。盖好离屯、管并颠倒混匀数次后室溫静置5min。
[0040] (3)用1000化微量移液枪往上一步的1.5mL离屯、管中加入2(Κ)化氯仿，盖紧离屯、管 盖，混匀至溶液乳化后，再室溫静置5min。
[0041 ] (4)转移至高速冷冻离屯、机中12000g，4°C，离屯、15min。
[0042] (5)小屯、从离屯、机中取出离屯、管，用1000化微量移液器吸取50化L上清液至一个新 的1.5ml离屯、管中。
[0043] (6)然后往新的1.5mL离屯、管中加入50化L异丙醇，盖好离屯、管并充分颠倒混匀，室 溫静置lOmin。
[0044] (7)转移至高速冷冻离屯、机中12000g，4°C，离屯、lOmin。
[0045] (8)将1.5mL离屯、管中上清液倒掉，再12000g，4°C，离屯、Imin，用小枪头（100化)将 上清液吸净。
[0046] (9)往离屯、管中加入现配的预冷的75%乙醇1ml(无水乙醇3:1DEPC水），盖好离屯、 管并轻轻上下颠倒洗涂离屯、管管壁及RNA，再12000g，4°C，离屯、Imin后小屯、去除乙醇。
[0047] (10)在超净工作台中打开离屯、管盖，室溫干燥沉淀lOmin，加入50化DEPC处理水 溶解沉淀，静置3min，待RNA沉淀完全溶解后置于-20°C冰箱保存，待用。
[004引 （11)使用Thermo Scientific化no化op 2000c测定总的RNA的含量，获得测定浓 度，
[0049] RNA含量的计算公式：
[0050] 样品RNA浓度(yg/mg)=测定浓度(ng/μL) X50X1000今Μ。
[0051 ] (12)用1 %琼脂糖凝胶电泳检测其纯度，若测定的0D260/0D280值在1.9~2.1之 间，且总RNA电泳条带清晰呈现为28S，18S和5SS条带，28S的条带亮度约为18S的两倍，说明 RNA纯度和浓度符合要求，可继续进行后续实验；
[0052] (13)利用反转录试剂将RNA反转录合成首链cDNA;
[0053] a)逆转录:用普通PCR仪将RNA反转录成首链cDNA，按照表2配制反转录反应液：
[0054] 表2反转录反应液组成
[0化5]
[0056] 反应液配制方法:配置前先根据反转录样品的数量计算出各反应液实际需要量， 统一加入无菌离屯、管中混合均匀，然后分装到各个反应管中，最后添加样品并小屯、点动离 屯、混匀，使反应更加充分并减少误差。配制过程需在冰浴且无菌体系中进行，
[0057] 反转录反应条件：50°C，20min一95°C，5min一5°C，5min一 15°C，15min。
[005引3、实时巧光定量PCR检测目的基因
[0059] (1)引物设计
[0060] 所述化h基因的特异性引物为：
[0061 ]上游引物为：Slih-F: 5' -TGGCGGATCTCGGTGATGAAC-3'，（沈Q ID NO. 1)
[0062] 下游引物为：5化-尺：5'-〔6了4(：176(：1'(：1761^〇：了61'(：1'-3'；（沈9 10備.2)
[0063] 所述鱼的内参基因为18s-rRNA基因，所述18s-rRNA基因的引物为：
[0064] 上游引物为：183-诚酷斗：5'-1764〔〇：44〔4〔666444〇：1'-3'，（沈9 10備.3)
[00化]下游引物为：18s-rRNA-R: 5 ' -CAAATCGCTCCACCAACTAAGAA-3 ' ；（SEQ ID NO. 4)
[0066] (2)PCR检测目的基因
[0067] PCR扩增反应用普通PCR仪扩增cDNA，按表3配制PCR反应液：
[0068] 表3 PCR反应液组成
[0069]
[0070] 根据反转录样品数量计算各PCR反应试剂用量，配制反应混合液，点动离屯、混匀， 然后分装到RT-PCR反应结束后的PCR反应管中，再点动离屯、混匀。反应结束后，将PCR管保存 于4°C冰箱保存，待用。
[0071] PCR扩增反应条件：95 °C，Imin一（94°C，30sec一60 °C，30sec一72 °C，Imin，40个循 环)一72°C，5min一 15°C，pause。
[0072] 用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，条件为100V，30min。若PCR反应产物的条带单 一，出现位置在10化P-20化P之间，可初步确定PCR产物为目的基因。
[0073] PCR产物纯化与浓缩，PCR产物的1 %琼脂糖凝胶电泳检测符合实验要求后，取经纯 化浓缩后的PCR产物测序，测序结果经BLAST化ttp: //www.ncbi .nlm.nih. gov)比对后，确定 PCR扩增产物是目的基因片段，方可进行后续的巧光定量实验。
[0074] 本实验采用的是TaKaRa公司的SY郎*Premix Ex Taq?(Perfect Real Time)试剂 盒，本试剂盒是在PCR扩增合成双链DNA的过程中，巧光分子SYBlTGreen I与双链DNA结合能 够发出巧光信号，通过连续监测巧光信号出现的先后顺序W及信号的强弱变化，来及时分 析目的基因化h的拷贝数目，从而对目的基因的表达量进行实时准确定量。实时巧光定量 PCR的反应体系如表4。
[00巧]表4 RTQ-PCR反应体系组成
[0076]
[0077] RTQ-PCR反应体系的配制必须在冰浴无菌条件下进行，试剂使用前需点动离屯、混 匀后才能使用，反应液配制、分装均要使用无菌的新枪头，W避免污染，而且配制的速度要 快，W免其中的反应酶失活。反应试剂添加完成后，使用配有八联管转头的台式离屯、机短暂 离屯、，确保试剂沉积在管底。
[007引巧光定量反应条件:95°C预变性30s;95°C15s 一 60°C30s 一 72°C30s，40个循环;采 集巧光信号数值Ct;获得化h基因巧光信号数值Ct化h和内参基因巧光信号数值Ctl8s-rRNA 后，采取2-皿Gt法进行数据分析，Act = Ctaih-Ct 18s-rRNA，
[0079] AACt = (Ctaih-Ct 18s-rRNA)实验组-(Ctaih-Ct 18s-rRNA)空白组，Slih基因的相 对表达量= 计算得出s化基因的相对表达量;实验结果如表5所示：
[0080] 表5 10组鱼样品的化h基因的相对表达量2-魁ct
[0081]
[0082] 受到水域中重金属儒的污染胁迫，鱼样本生理机能发生变化，通过化h基因的相对 表达量来监测水污染的程度，值越大，重金属儒浓度越小，很直观的说明水域受污染 的程度越小，反之2 值越小，重金属儒浓度越大，说明水域受污染的程度越大。
[0083] 通过表5的数据结果可W建立鱼的化h基因的相对表达量2-^Et与儒浓度关系的标 准曲线，获取与建立标准曲线同类同大小的待测水域的鱼，然后将计算得所述待测水域的 鱼的化h基因的相对表达量与标准曲线比对，获得儒污染的浓度。
[0084] 实施例2
[00化]1、水污染鱼生物样本饲养准备
[0086] 采用10天龄海水青鎌仔鱼作为监测水污染的生物样本，将仔鱼分成5组，每组3个 平行进行养鱼实验，分别在表6所述的菲浓度水域环境中饲养，0浓度作为对照组，饲养7天 后，每个平行随机取3尾鱼样品测定，每组测定3x3 = 9个数据，将每组9个数据数理统计后得 到各组鱼的化h基因的相对表达量结果。
[0087] 表6 5组幼鱼饲养的水域的菲浓度
[0088]_
[00例~2、利用RNA提取试剂，提取鱼样品总RNA，利用反转录试剂将RNA反转录合成首链 cDNA；
[0090] (1)快速称取冷冻的幼鱼lOOmg左右，记录实际重量为M，然后放入提前预冷的研鉢 中倒入液氮，用研巧研磨称量好的海水青鎌鱼幼鱼样品，直至研磨成粉末状，然后用不诱钢 小药匙迅速将样品粉送入冰浴中的玻璃匀浆管底部。
[0091] (2)用移液枪往玻璃匀浆管中加入0.6mL RNAiso试剂，充分匀浆至匀浆液呈无颗 粒透明状后，将匀浆液转入1.5ml离屯、管中。然后再向匀浆管中加入0.2mL RNAiso试剂，洗 涂匀浆棒和匀浆管管壁一次，之后将匀浆液转入之前的离屯、管中，重复上述操作一次，使加 入的RNAiso试剂总体积为ImL。盖好离屯、管并颠倒混匀数次后室溫静置5min。
[0092] (3)用1000化微量移液枪往上一步的1.5mL离屯、管中加入2(Κ)化氯仿，盖紧离屯、管 盖，混匀至溶液乳化后，再室溫静置5min。
[0093] (4)转移至高速冷冻离屯、机中12000g，4°C，离屯、15min。
[0094] (5)小屯、从离屯、机中取出离屯、管，用1000化微量移液器吸取50化L上清液至一个新 的1.5ml离屯、管中。
[00M] (6)然后往新的1.5mL离屯、管中加入50化L异丙醇，盖好离屯、管并充分颠倒混匀，室 溫静置lOmin。
[0096] (7)转移至高速冷冻离屯、机中12000g，4°C，离屯、lOmin。
[0097] (8)将1.5mL离屯、管中上清液倒掉，再12000g，4°C，离屯、Imin，用小枪头（100化)将 上清液吸净。
[009引 （9)往离屯、管中加入现配的预冷的75%乙醇1ml(无水乙醇3:1DEPC水），盖好离屯、 管并轻轻上下颠倒洗涂离屯、管管壁及RNA，再12000g，4°C，离屯、Imin后小屯、去除乙醇。
[0099] (10)在超净工作台中打开离屯、管盖，室溫干燥沉淀lOmin，加入50化DEPC处理水 溶解沉淀，静置3min，待RNA沉淀完全溶解后置于-20°C冰箱保存，待用。
[0100] (11)使用Thermo Scientific化no化op 2000c测定总的RNA的含量，获得测定浓 度，
[0101] RNA含量的计算公式：
[0102] 样品 RNA 浓度(yg/mg)=测定浓度(ngAU)X50X1000 今M。
[0103] (12)用1%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度，若测定的0D260/0D280值在1.9~2.1之 间，且总RNA电泳条带清晰呈现为28S，18S和5SS条带，28S的条带亮度约为18S的两倍，说明 RNA纯度和浓度符合要求，可继续进行后续实验；
[0104] (13)利用反转录试剂将RNA反转录合成首链cDNA;
[0105] a)逆转录:用普通PCR仪将RNA反转录成首链cDNA，按照表7配制反转录反应液：
[0106] 表7反转录反应液组成
[0107]
[0109] 反应液配制方法:配置前先根据反转录样品的数量计算出各反应液实际需要量， 统一加入无菌离屯、管中混合均匀，然后分装到各个反应管中，最后添加样品并小屯、点动离 屯、混匀，使反应更加充分并减少误差。配制过程需在冰浴且无菌体系中进行，
[0110] 反转录反应条件：50°C，20min一95°C，5min一5°C，5min一 15°C，15min。
[0111] 3、实时巧光定量PCR检测目的基因
[0112] (1)引物设计
[0113] 所述化h基因的特异性引物为：
[0114] 上游引物为：Slih-F: 5' -TGGCGGATCTCGGTGATGAAC-3'，（沈Q ID NO. 1)
[0115] 下游引物为：5化-尺：5'-〔6了4(：176(：1'(：1761^〇：了61'(：1'-3'；（沈9 10備.2)
[0116] 所述鱼的内参基因为18s-rRNA基因，所述18s-rRNA基因的引物为：
[0117] 上游引物为：183-诚酷斗：5'-1764〔〇：44〔4〔666444〇：1'-3'，（沈9 10備.3)
[0118] 下游引物为：18s-rRNA-R: 5 ' -CAAATCGCTCCACCAACTAAGAA-3 ' ；（沈Q ID NO. 4)
[0119] (2)PCR检测目的基因
[0120] PCR扩增反应用普通PCR仪扩增cDNA，按表8配制PCR反应液：
[0121] 表8 PCR反应液组成
[0122]
[0123] 根据反转录样品数量计算各PCR反应试剂用量，配制反应混合液，点动离屯、混匀， 然后分装到RT-PCR反应结束后的PCR反应管中，再点动离屯、混匀。反应结束后，将PCR管保存 于4°C冰箱保存，待用。
[0124] PCR扩增反应条件：95 °C，Imin一（94°C，30sec一60 °C，30sec一72 °C，Imin，40个循 环)一72°C，5min一 15°C，pause。
[0125] 用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，条件为100V，30min。若PCR反应产物的条带单 一，出现位置在10化P-20化P之间，可初步确定PCR产物为目的基因。
[0126] PCR产物纯化与浓缩，PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳检测符合实验要求后，取经纯 化浓缩后的PCR产物测序，测序结果经BLAST化ttp://WWW.ncbi .nlm.nih. gov)比对后，确定 PCR扩增产物是目的基因片段，方可进行后续的巧光定量实验。
[0127] 本实验义用的是TaKaRa公司的SY邸|"Premix Ex Taq?(perfect Real Time)试剂 盒，本试剂盒是在PCR扩增合成双链DM的过程中，巧光分子妍BIT Green I与双链DM结合能 够发出巧光信号，通过连续监测巧光信号出现的先后顺序W及信号的强弱变化，来及时分 析目的基因化h的拷贝数目，从而对目的基因的表达量进行实时准确定量。实时巧光定量 PCR的反应体系如表9:
[0128] 表9 RTQ-PCR反应体系组成
[0129]
[0130]
[0131] RTQ-PCR反应体系的配制必须在冰浴无菌条件下进行，试剂使用前需点动离屯、混 匀后才能使用，反应液配制、分装均要使用无菌的新枪头，W避免污染，而且配制的速度要 快，W免其中的反应酶失活。反应试剂添加完成后，使用配有八联管转头的台式离屯、机短暂 离屯、，确保试剂沉积在管底。
[0132] 巧光定量反应条件:95°C预变性30s;95°C15s 一 60°C30s 一 72°C30s，40个循环;采 集巧光信号数值ct;获得化h基因巧光信号数值Ct化h和内参基因巧光信号数值Ctl8s-rRNA 后，采取2-皿Gt法进行数据分析，Act = Ctaih-Ct 18s-rRNA，
[0133] AACt = (Ctaih-Ct 18s-rRNA)实验组-(Ctaih-Ct 18s-rRNA)空白组，Slih基因的相 对表达量= 计算2AAGt得出Shh基因的相对表达量;测定并经数理统计的结果如表10 所示：
[0134] 表10 5组鱼样品的化h基因的相对表达量2-^ct 「01351
[0136] 受到水域中多环芳控菲的污染胁迫，海水青鎌鱼样本生理机能发生变化，通过化h 基因的相对表达量来监测水污染的程度，值越大，多环芳控菲浓度越小，很直观地说 明水域受污染的程度越小，反之值越小，多环芳控菲浓度越大。
[0137] 海水青鎌((Iryzias melastigma)，是新发展的研究海水鱼病理毒理学的理想模型 生物。海水青鎌在中国、朝鲜、日本、印度等海域普遍存在，性格溫和、产卵率高、生长周期短 (约3个月）、体型小(成鱼个体长约3.5-4.0cm)、易于繁育(一年四季均可繁殖）、易于饲养和 观察，对环境变化极其敏感，是进行海洋生态毒理研究的理想海水鱼模式生物。
[0138] 通过表10的数据结果可W建立海水青鎌的化h基因的相对表达量与菲浓度 关系的标准曲线，获取待测水域中17天龄左右的海水青鎌，然后将计算得所述待测水域中 海水青鎌的化h基因的相对表达量与标准曲线比对，获得菲污染的浓度。
[0139] 实施例3
[0140] 1、水污染鱼生物样本饲养准备
[0141] 采用10天龄淡水青鎌仔鱼作为监测水污染的生物样本，将仔鱼分成6组，每组3个 平行进行，分别在表11所述的多氯联苯浓度水域环境中饲养，0浓度作为对照组，饲养7天 后，每个平行取3个样品测定，每组测定3x3 = 9个数据，将每组9个数据数理统计后得到各组 鱼的结果。
[0142] 表11 6组仔鱼饲养的水域的多氯联苯浓度
[0143] _
[0144] ~2、利用RNA提取试剂，提取鱼样品总RNA，利用反转录试剂将RNA反转录合成首链 cDNA；
[0145] (1)快速称取冷冻的幼鱼lOOmg左右，记录实际重量为M，然后放入提前预冷的研鉢 中倒入液氮，用研巧研磨称量好的幼鱼样品，直至研磨成粉末状，然后用不诱钢小药匙迅速 将样品粉末移入冰浴中的玻璃匀浆管底部。
[0146] (2)用移液枪往玻璃匀浆管中加入0.6mL RNAiso试剂，充分匀浆至匀浆液呈无颗 粒透明状后，将匀浆液转入1.5ml离屯、管中。然后再向匀浆管中加入0.2mL RNAiso试剂，洗 涂匀浆棒和匀浆管管壁一次，之后将匀浆液转入之前的离屯、管中，重复上述操作一次，使加 入的RNAiso试剂总体积为ImL。盖好离屯、管并颠倒混匀数次后室溫静置5min。
[0147] (3)用1000化微量移液枪往上一步的1.5mL离屯、管中加入2(Κ)化氯仿，盖紧离屯、管 盖，混匀至溶液乳化后，再室溫静置5min。
[0148] (4)转移至高速冷冻离屯、机中12000g，4°C，离屯、15min。
[0149] (5)小屯、从离屯、机中取出离屯、管，用1000化微量移液器吸取50化L上清液至一个新 的1.5ml离屯、管中。
[0150] (6)然后往新的1.5mL离屯、管中加入50化L异丙醇，盖好离屯、管并充分颠倒混匀，室 溫静置lOmin。
[0151] (7)转移至高速冷冻离屯、机中12000g，4°C，离屯、lOmin。
[0152] (8)将1.5mL离屯、管中上清液倒掉，再12000g，4°C，离屯、Imin，用小枪头（100化)将 上清液吸净。
[0153] (9)往离屯、管中加入现配的预冷的75%乙醇1ml(无水乙醇3:1DEPC水），盖好离屯、 管并轻轻上下颠倒洗涂离屯、管管壁及RNA，再12000g 4°C离屯、Imin后小屯、去除乙醇。
[0154] (10)在超净工作台中打开离屯、管盖，室溫干燥沉淀lOmin，加入50化DEPC处理水 溶解沉淀，静置3min，待RNA沉淀完全溶解后置于-20°C冰箱保存，待用。
[01巧](11)使用Thermo Scientific化no化op 2000c测定总的RNA的含量，获得测定浓 度，
[0156] RNA含量的计算公式：
[0157] 样品 RNA 浓度(yg/mg)=测定浓度(ngAU)X50X1000 今M。
[0158] (12)用1%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度，若测定的0D260/0D280值在1.9~2.1之 间，且总RNA电泳条带清晰呈现为28S，18S和5SS条带，28S的条带亮度约为18S的两倍，说明 RNA纯度和浓度符合要求，可继续进行后续实验；
[0159] (13)利用反转录试剂将RNA反转录合成首链cDNA;
[0160] a)逆转录:用普通PCR仪将RNA反转录成首链cDNA，按照表12配制反转录反应液：
[0161] 表12反转录反应液组成
[0162]
[0163] 反应液配制方法:配置前先根据反转录样品的数量计算出各反应液实际需要量， 统一加入无菌离屯、管中混合均匀，然后分装到各个反应管中，最后添加样品并小屯、点动离 屯、混匀，使反应更加充分并减少误差。配制过程需在冰浴且无菌体系中进行，
[0164] 反转录反应条件：50°C，20min一95°C，5min一5°C，5min一 15°C，15min。
[0165] 3、实时巧光定量PCR检测目的基因
[0166] (1)引物设计
[0167] 所述化h基因的特异性引物为：
[0168] 上游引物为：Slih-F: 5' -TGGCGGATCTCGGTGATGAAC-3'，（沈Q ID NO. 1)
[0169] 下游引物为：5化-尺：5'-〔6了4(：176(：1'(：1761^〇：了61'(：1'-3'；（沈9 10備.2)
[0170] 所述鱼的内参基因为18s-rRNA基因，所述18s-rRNA基因的引物为：
[0171] 上游引物为：183-诚酷斗：5'-1764〔〇：44〔4〔666444〇：1'-3'，（沈9 10備.3)
[0172] 下游引物为：18s-rRNA-R: 5 ' -CAAATCGCTCCACCAACTAAGAA-3 ' ；（SEQ ID NO. 4)
[0173] (2)PCR检测目的基因
[0174] PCR扩增反应用普通PCR仪扩增cDNA，按表13配审化CR反应液：
[0175] 表13 PCR反应液组成
[0176]
[0177] 根据反转录样品数量计算各PCR反应试剂用量，配制反应混合液，点动离屯、混匀， 然后分装到RT-PCR反应结束后的PCR反应管中，再点动离屯、混匀。反应结束后，将PCR管保存 于4°C冰箱保存，待用。
[0178] PCR扩增反应条件：95 °C，Imin一（94°C，30sec一60 °C，30sec一72 °C，Imin，40个循 环)一72°C，5min一 15°C，pause。
[0179] 用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，条件为100V，30min。若PCR反应产物的条带单 一，出现位置在10化P-20化P之间，可初步确定PCR产物为目的基因。
[0180] PCR产物纯化与浓缩，PCR产物的1 %琼脂糖凝胶电泳检测符合实验要求后，取经纯 化浓缩后的PCR产物测序，测序结果经BLAST化ttp: //www.ncbi .nlm.nih. gov)比对后，确定 PCR扩增产物是目的基因片段，方可进行后续的巧光定量实验。
[0181] 本实验采用的是TaKaRa公司的.S您IfPremixExTaq?(p>erfectRealTime)试剂 盒，本试剂盒是在PCR扩增合成双链DNA的过程中，巧光分子沉书於Green I与双链DNA结合能 够发出巧光信号，通过连续监测巧光信号出现的先后顺序W及信号的强弱变化，来及时分 析目的基因化h的拷贝数目，从而对目的基因的表达量进行实时准确定量。实时巧光定量 PCR的反应体系如表14:
[0182] 表14 RTQ-PCR反应体系组成
[0183]
[0184] RTQ-PCR反应体系的配制必须在冰浴无菌条件下进行，试剂使用前需点动离屯、混 匀后才能使用，反应液配制、分装均要使用无菌的新枪头，W避免污染，而且配制的速度要 快，W免其中的反应酶失活。反应试剂添加完成后，使用配有八联管转头的台式离屯、机短暂 离屯、，确保试剂沉积在管底。
[0185] 巧光定量反应条件:95Γ预变性3〇8;95。(：153一60^3〇3一72^3〇3,40个循环;采 集巧光信号数值ct;获得化h基因巧光信号数值Ct化h和内参基因巧光信号数值Ctl8s-rRNA 后，采取2-皿Gt法进行数据分析，Act = Ctaih-Ct 18s-rRNA，
[01 化]AACt = (CtSUi-Ct 18s-rRNA)实验组-(Ctaih-Ct 18s-rRNA)空白组，Slih基因的相 对表达量= 计算得出化h基因的相对表达量;实验结果如表15所示：
[0187]表15 6组鱼样品的化h基因的相对表达量2-^ct fOIRRl
'[0189]~受到水域中多氯联苯的污染胁迫，淡水青鎌鱼样本生理机能发生变化I，通过化h基I 因的相对表达量来监测水污染的程度，值越大，多氯联苯浓度越小，很直观的说明水 域受污染的程度越小，反之值越小，多氯联苯浓度越大。
[0190] 通过表15的数据结果，可W建立淡水青鎌的Shh基因的相对表达量2-^Et与多氯联 苯浓度关系的标准曲线，获取待测水域中17天龄左右的淡水青鎌，然后将计算得所述待测 水域中淡水青鎌的化h基因的相对表达量与标准曲线比对，获得多氯联苯污染的浓 度。
[0191] 实施例4
[0192] 1、采用10天龄仔鱼作为监测水污染的生物样本，将幼鱼分成2组，分为无污染对照 组与待测水域组，将仔鱼分别放入无污染水体和待测水域水体中饲养，每组3个平行进行， 饲养7天后，每个平行取3个样品测定，每组测定3x3 = 9个数据，将每组9个数据数理统计后 得到各组鱼的结果。
[0193] 2、利用RNA提取试剂，提取鱼样品总RNA，利用反转录试剂将RNA反转录合成首链 cDNA；
[0194] (1)快速称取冷冻的幼鱼lOOmg左右，记录实际重量为M，然后放入提前预冷的研鉢 中倒入液氮，用研巧研磨称量好的幼鱼样品，直至研磨成粉末状，然后用不诱钢小药匙迅速 将样品粉末移入冰浴中的玻璃匀浆管底部。
[01M] (2)用移液枪往玻璃匀浆管中加入0.6mLRNAiso试剂，充分匀浆至匀浆液呈无颗粒 透明状后，将匀浆液转入1.5ml离屯、管中。然后再向匀浆管中加入0.2mL RNAiso试剂，洗涂 匀浆棒和匀浆管管壁一次，之后将匀浆液转入之前的离屯、管中，重复上述操作一次，使加入 的RNAiso试剂总体积为ImL。盖好离屯、管并颠倒混匀数次后室溫静置5min。
[0196] (3)用1000化微量移液枪往上一步的1.5mL离屯、管中加入2(Κ)化氯仿，盖紧离屯、管 盖，混匀至溶液乳化后，再室溫静置5min。
[0197] (4)转移至高速冷冻离屯、机中12000g，4°C，离屯、15min。
[0198] (5)小屯、从离屯、机中取出离屯、管，用1000化微量移液器吸取5(Κ)化上清液至一个新 的1.5ml离屯、管中。
[0199] (6)然后往新的1.5mL离屯、管中加入50化L异丙醇，盖好离屯、管并充分颠倒混匀，室 溫静置lOmin。
[0200] (7)转移至高速冷冻离屯、机中12000g，4°C，离屯、lOmin。
[0201] (8)将1.5mL离屯、管中上清液倒掉，再12000g，4°C，离屯、Imin，用小枪头（100化)将 上清液吸净。
[0202] (9)往离屯、管中加入现配的预冷的75%乙醇1ml(无水乙醇3:1DEPC水），盖好离屯、 管并轻轻上下颠倒洗涂离屯、管管壁及RNA，再12000g，4°C，离屯、Imin后小屯、去除乙醇。
[0203] (10)在超净工作台中打开离屯、管盖，室溫干燥沉淀lOmin，加入50化DEPC处理水 溶解沉淀，静置3min，待RNA沉淀完全溶解后置于-20°C冰箱保存，待用。
[0204] (11)使用Thermo Scientific化no化op 2000c测定总的RNA的含量，获得测定浓 度，
[0205] RNA含量的计算公式：
[0206] 样品RNA浓度(yg/mg)=测定浓度(ng/μL) X50X1000今M。
[0207] (12)用1%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度，若测定的0D260/0D280值在1.9~2.1之 间，且总RNA电泳条带清晰呈现为28S，18S和5SS条带，28S的条带亮度约为18S的两倍，说明 RNA纯度和浓度符合要求，可继续进行后续实验；
[0208] (13)利用反转录试剂将RNA反转录合成首链cDNA;
[0209] a)逆转录:用普通PCR仪将RNA反转录成首链cDNA，按照表12配制反转录反应液：
[0210] 表12反转录反应液组成
[0211]
[0213] 反应液配制方法:配置前先根据反转录样品的数量计算出各反应液实际需要量， 统一加入无菌离屯、管中混合均匀，然后分装到各个反应管中，最后添加样品并小屯、点动离 屯、混匀，使反应更加充分并减少误差。配制过程需在冰浴且无菌体系中进行，
[0214] 反转录反应条件：50°C，20min一95°C，5min一5°C，5min一 15°C，15min。
[0215] 3、实时巧光定量PCR检测目的基因
[0216] (1)引物设计
[0217] 所述Shh基因的特异性引物为：
[0218] 上游引物为：Slih-F: 5' -TGGCGGATCTCGGTGATGAAC-3'，（沈Q ID NO. 1)
[0219] 下游引物为：5化-尺：5'-〔6了4(：176(：1'(：1761^〇：了61'(：1'-3'；（沈9 10備.2)
[0220] 所述鱼的内参基因为18s-rRNA基因，所述18s-rRNA基因的引物为：
[0221] 上游引物为：183-诚酷斗：5'-1764〔〇：44〔4〔666444〇：1'-3'，（沈9 10備.3)
[0222] 下游引物为：18s-rRNA-R: 5 ' -CAAATCGCTCCACCAACTAAGAA-3 ' ；（SEQ ID NO. 4)
[0223] (2)PCR检测目的基因
[0224] PCR扩增反应用普通PCR仪扩增cDNA，按表13配制PCR反应液：
[0225] 表13 PCR反应液组成
[0226]
[0228]根据反转录样品数量计算各PCR反应试剂用量，配制反应混合液，点动离屯、混匀， 然后分装到RT-PCR反应结束后的PCR反应管中，再点动离屯、混匀。反应结束后，将PCR管保存 于4°C冰箱保存，待用。
[02巧]PCR扩增反应条件：95 °C，Imin一（94Γ，30sec一60 °C，30sec一72 °C，Imin，40个循 环)一72°C，5min一 15°C，pause。
[0230] 用1%琼脂糖凝胶电泳检巧UPCR产物，条件为100V，30min。若PCR反应产物的条带单 一，出现位置在10化P-20化P之间，可初步确定PCR产物为目的基因。
[0231] PCR产物纯化与浓缩，PCR产物的1 %琼脂糖凝胶电泳检测符合实验要求后，取经纯 化浓缩后的PCR产物测序，测序结果经BLAST化ttp: //www.ncbi .nlm.nih. gov)比对后，确定 PCR扩增产物是目的基因片段，方可进行后续的巧光定量实验。
[0232] 本实验采用的是TaKaRa公司的SYBlfPremix Ex Taq?(Perfect Real Time)试剂 盒，本试剂盒是在PCR扩增合成双链DNA的过程中，巧光分子S邱rGreen I与双链DNA结合能 够发出巧光信号，通过连续监测巧光信号出现的先后顺序W及信号的强弱变化，来及时分 析目的基因化h的拷贝数目，从而对目的基因的表达量进行实时准确定量。实时巧光定量 PCR的反应体系如表14:
[0233] 表14 RTQ-PCR反应体系组成
[0234]
[0235] RTQ-PCR反应体系的配制必须在冰浴无菌条件下进行，试剂使用前需点动离屯、混 匀后才能使用，反应液配制、分装均要使用无菌的新枪头，W避免污染，而且配制的速度要 快，W免其中的反应酶失活。反应试剂添加完成后，使用配有八联管转头的台式离屯、机短暂 离屯、，确保试剂沉积在管底。
[0236] 巧光定量反应条件:95°C预变性30s;95°C15s 一 60°C30s 一 72°C30s，40个循环;采 集巧光信号数值Ct;采用上述参数，多次循环测试，相对其他参数来说采集到的巧光信号数 值Ct误差小；获得化h基因巧光信号数值Ct化h和内参基因巧光信号数值Ct 18s-rRNA后，采 取 2-ΔΔα 法进行数据分析，Act = Ctaih-Ctl8s-rRNA，AACt=(Ctaih-Ctl8s-rRNA)实验 组-(Ctaih-Ct 18s-rRNA)空白组，SUi基因的相对表达量=2-^Gt，计算2-AAct得出化h基因的 相对表达量，采取法进行数据分析能减少误差，能够准确表述化h基因的相对表达量 从而精准反映出水污染程度；检测结果：对照组的值为3.87,待测组的值为 3.25，结果显示对照组的值大于待测组的2AAGt值，所述待测水域已经受到了多环芳 控污染，重金属儒污染，多氯联苯污染中的一种污染，需及早进行水域治理，而化学的方法 测试只能单一测试一种污染源，如测试儒浓度一般采用原子分光光度计法测试，原子分光 光度计法先做标准曲线，然后制作样品再测试样品的吸光度后，在标准曲线上找去相应浓 度，该方法误差大，并且只适合较大浓度测试，微量级浓度无法测试出；菲浓度一般采用气 质联用法测试，多氯联苯也是一般采用气质联用法测试，该方法成本高，误差相对本发明来 说也较大。本发明所提到的空白组为所使用的试剂盒的空白对照，目的是为了减小误差。
[0237] 尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列 运用，它完全适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易改为他 用，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节 和运里示出与描述的实施例。
[023引 [0239]
【主权项】
1. 一种基于鱼的Shh基因监测水污染的方法，其特征在于，用鱼作为监测水污染的生物 样本，鱼的Shh基因作为监测水污染的敏感生物标记物。2. 根据权利要求1所述的基于鱼的Shh基因监测水污染的方法，其特征在于，建立鱼的 Shh基因的相对表达量与污染浓度关系的标准曲线，获取与建立标准曲线同类同大小 的待测水域的鱼，然后将计算得所述待测水域的鱼的Shh基因的相对表达量与标准曲 线比对，获得污染浓度。3. 根据权利要求2所述的基于鱼的Shh基因监测水污染的方法，其特征在于，计算Shh基 因的相对表达量具体包括以下步骤： 1) 用鱼作为监测水污染的生物样本； 2) 利用RNA提取试剂，提取鱼样品总RNA，利用反转录试剂将RNA反转录合成首链cDNA; 3) 实时荧光定量PCR检测，以首链cDNA为模板，分别根据所述Shh基因的引物，18s-rRNA 基因的引物，在罗氏PCR仪上进行实时荧光定量PCR扩增反应，荧光定量PCR反应体系为： SYBR试剂12.5yL、上游引物F lyL、下游引物R lyL、cDNA 2yL、灭菌蒸馏水8.5yL，反应体系 总体积为25yL;反应程序采用三步法程序：95°C预变性30s;95°C15s460°C30s-72°C30s， 40个循环;采集荧光信号数值Ct，Ct值是:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经 历的循环数； 4) 获得Shh基因荧光信号数值CtShh和内参基因荧光信号数值Ctl8s-rRNA后，采取2 -ΔΔα法进行数据分析，Δ Ct = CtShh-Ctl8s_rRNA; Δ ACt=(CtShh-Ctl8s-rRNA)实验组-(CtShh-Ctl8s-rRNA)空白组，Shh基因的相对表 达量= 2_AAet，计算2_AAet得出Shh基因的相对表达量。4. 根据权利要求3所述的基于鱼的Shh基因监测水污染的方法，其特征在于，所述鱼为 仔鱼，将仔鱼分成若干组，其中一组作为无污染对照组，其他组为待测水域组;分别将仔鱼 放入无污染对照水体和待测水域水体中饲养;7天后随机抽取鱼样品，检测并计算Shh相对 表达量，如果待测水域组的2 4Aet值小于无污染对照组的24Aet值，则待测水域受到污 染，其污染源的浓度与待测水域组的值成负相关。5. 根据权利要求1-4任一项所述的基于鱼的Shh基因监测水污染的方法，其特征在于， Shh基因的引物为： 上游引物如SEQ ID N0.1 所示：Shh-Fj'-TGGCGGATCTCGGTGATGAACHy， 下游引物如SEQ ID N0.2所示：Shh-Rj'-CGTACTTGCTCTTGTCCCTGTCT-SS 鱼的内参基因为18s-rRNA基因，18s-rRNA基因的引物为： 上游引物如SEQ ID NO · 3所示：18s-rRNA-F: 5' -TTGACCCAACACGGGAAACCT-3'， 下游引物如SEQIDN0·4所示：18s-rRNA-R:5/-CAAATCGCTCCACCAACTAAGAA-3 /。6. 根据权利要求5所述的基于鱼的Shh基因监测水污染的方法，其特征在于，所述水污 染为多环芳烃污染，重金属镉污染，多氯联苯污染中的一种。7. 根据权利要求6所述的基于鱼的Shh基因监测水污染的方法，其特征在于，所述多环 芳烃污染为菲污染。8. 根据权利要求7所述的基于鱼的Shh基因监测水污染的方法，其特征在于，鱼的Shh基 因的相对表达量与所述菲，重金属镉，多氯联苯中的一种的浓度呈负相关。9. 根据权利要求8所述的基于鱼的Shh基因监测水污染的方法，其特征在于，所述鱼为
【文档编号】C12Q1/68GK106011272SQ201610546388
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月12日
【发明人】许友卿, 丁兆坤, 刘永强, 刘富娟, 计沈斌, 梅婕
【申请人】广西大学