一种东乡野生稻genic-SSR分子标记开发方法
【专利摘要】一种东乡野生稻genic?SSR分子标记开发方法，所述方法步骤为：东乡野生稻Unigene?EST序列的获得；东乡野生稻SSR序列的识别；东乡野生稻genic?SSR引物的设计；东乡野生稻genic?SSR引物的有效性和通用性鉴定。本发明利用生物信息学方法从东乡野生稻Unigene?EST序列中挖掘SSR位点，进行genic?SSR分子标记的开发，克服了东乡野生稻genic?SSR分子标记获取困难的问题；使用东乡野生稻和不同品种的现代栽培稻对开发的genic?SSR引物进行PCR鉴定，结果真实可靠；本发明方法简单，操作简便，获得的分子标记数量巨大，为东乡野生稻的遗传学研究及分子育种等奠定基础。
【专利说明】一种东乡野生賴gen i c-SSR分子标巧开发方法
[0001]
技术领域
[0002] 本发明属于分子生物学技术领域，设及一种东乡野生稻genic-SSR分子标记开发 方法。
【背景技术】
[0003] 长期W来，由于育种者片面地追求高产及品种推广的单一化，导致现代栽培稻遗 传多样性显著降低。水稻野生资源处于自然生长状态，蕴藏着丰富的基因资源和遗传多样 性，是水稻改良极其宝贵的遗传资源。东乡野生稻起源于江西省东乡县(28°14'），是迄今发 现的中国乃至全球分布最北的普通野生稻，富含众多优异特性(如高产、胞质不育、育性恢 复、强分葉等)和丰富的抗逆特性(如耐冷、耐旱、抗病、抗虫等），利用东乡野生稻优异基因 资源改良栽培稻是水稻育种有效途径。
[0004] 然而，将野生稻优异基因转移到栽培稻培育新品种往往需要耗费很长的时间。此 夕h由于野生稻的优异基因常与不利基因紧密连锁，使得育种过程具有较大困难。DNA分子 标记可W大大加快育种进程，并且可W定位优异基因的染色体位置，分离优异基因，降低育 种难度。在已发明的DNA分子标记中，SSR(simple sequence repeat,简单重复序列）分子标 记被认为是最有效和最理想的DNA分子标记，具有许多优点，例如共显性遗传、丰富的基因 组多态性、高重复性和多等位性等。此外，SSR分子标记只需要简单和廉价的PCR(聚合酶链 式反应)扩增，其产物多态性通常可W通过琼脂糖凝胶电泳分离检测。
[0005] 依据SSR分子标记在基因组中的位置，可W将其分为两种基本类型，即genomic- SSR分子标记和genic-SSR分子标记。与genomic-SSR分子标记相比，genic-SSR分子标记位 于基因的编码区，具有信息量大和通用性好等优点。近几年，随着转录组测序技术快速发 展，使得针对没有全基因组参考序列的物种，开发大规模genic-SSR分子标记成为可能。
[0006] 迄今为止，基于转录组测序技术已有大量genic-SSR分子标记在许多物种中被开 发和利用，例如萝l·、亚麻巧、梨、金钱械等。然而，利用东乡野生稻转录组数据开发genic- SSR分子标记尚未见报道，同时，目前东乡野生稻可用的genic-SSR分子标记也十分有限。因 此，利用东乡野生稻转录组序列信息，批量开发genic-SSR分子标记，将会对东乡野生稻种 质资源鉴定、遗传多样性、优异性状基因定位及分子标记辅助选择育种等方面起重要推动 作用。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种东乡野生稻genic-SSR分子标记的开发方法，通过网 络数据库下载转录组测序数据，利用生物信息学方法获得东乡野生稻化igene-EST序列，发 掘SSR位点，开发引物，构建东乡野生稻genic-SSR分子标记体系。
[000引本发明的目的通过如下技术方案实现： 一种东乡野生稻genic-SSR分子标记开发方法步骤为： 1)东乡野生稻化igene-EST序列的获得： 通过美国国立生物技术信息中屯、网络数据库下载东乡野生稻转录组高通量测序数据， 进行去接头污染序列及低质量reads的处理，获得化igene集，然后利用TIGR Gene Indices Clustering软件和CD-mT软件进行组装，最终获得东乡野生稻非冗余化igene-EST序列。
[0009] 2)东乡野生稻SSR序列的识别： 采用SSR检索软件MISA对上述步骤（1)得到的非冗余化igene-EST序列进行SSR位点查 找。检索的限定条件为:重复基序为1-6个碱基，重复单元数依次大于12次、6次、5次、5次、4 次和4次。
[0010] 3)东乡野生稻genic-SSR引物的设计： 根据上述步骤（2)识别的SSR位点，使用primers.0软件批量设计genic-SSR引物，引物 设计参数设定为：引物长度18-28 bp;烙解溫度55-65°C，60°C为最优溫度;产物大小为80- 300 bp〇
[00川 4)东乡野生稻genic-SSR引物的有效性和通用性鉴定： 提取东乡野生稻和现代栽培稻不同品种的基因组DNA，W其为模板进行PCR扩增。PCR扩 增反应采用15化的反应体系，其中包括50 ng模板DNA、1.5化10XPCR buffer、0.5 mM dNTPs、0.2 liM引物和lU TaqDNA聚合酶； 所述PCR扩增反应程序:95°C预变性5 min;然后进入35个循环95°C变性30s，55-63°C退 火303,72。(：延伸303;最后72。(：延伸10111111。
[001^ 所述PCR扩增反应程序结束后，扩增产物加入2化loading buffer，W50 bp DNA Ladder为DM分子量标准，进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶浓度为3-4%。电泳结束后，采用紫外凝 胶成像系统观察并拍照。依据每条引物扩增的目的片段长度，若有80-300 bp扩增产物检测 出，该引物即为有效引物。
[0013] 利用现代栽培稻的基因组DM进行引物通用性鉴定，依据每条引物的目的片段长 度，若有80-300 bp扩增产物检测出，该引物即具有通用性。
[0014] 与现有技术相比，本发明具有如下优点和积极效果： 1) 本发明通过网络数据库下载东乡野生稻转录组测序数据进行组装，获得大量东乡野 生稻非冗余化igene-EST序列，极大地增加了 genic-SSR分子标记开发所用的原始数据； 2) 本发明利用生物信息学方法从东乡野生稻化igene-EST序列中挖掘SSR位点，进行 genic-SSR分子标记的开发，克服了东乡野生稻genic-SSR分子标记获取困难的问题； 3) 使用东乡野生稻和不同品种的现代栽培稻对开发的genic-SSR引物进行PCR鉴定，结 果真实可靠； 4) 方法简单，操作简便，获得的分子标记数量巨大，为东乡野生稻的遗传学研究及分子 育种等奠定基础。
【附图说明】
[0015] 图1为本发明中部分SSR重复基序类型和数量： 图中纵坐标轴表示SSR数量，横坐标轴表示SSR重复基序类型； 图2为随机选取25条genic-SSR分子标记，利用东乡野生稻基因组DNA进行PCR扩增和 琼脂糖凝胶电泳： 图中：1-18为成功扩增的引物，M:50 bp DNA Ladder; 1-18:引物编号； 图3为利用东乡野生稻和15个现代栽培稻品种的基因组DNA进行genic-SSR分子标记 通用性检测（引物5); 图中M:50 bp DNA Ladder;l:东乡野生稻;2-16:15个现代栽培稻品种。
【具体实施方式】
[0016] -种东乡野生稻genic-SSR分子标记开发方法，其【具体实施方式】包括W下步骤： 1)东乡野生稻化igene-EST序列的获得： 登陆美国国立生物技术信息中屯、(NCBI)网络数据库，下载东乡野生稻转录组高通量测 序数据，进行去接头污染序列及低质量reads的处理，获得地上和地下部分化igene集。然后 利用TIGR Gene Indices Clustering(TGICL,http://sourceforge.net/projects/tgicl/ files/tgicl〇/〇20v2.1/)软件和CD-HIT化 ttp://www. bioinformat ics ,o;rg/cd-hit/)软件进 行组装，最终获得东乡野生稻非冗余化igene-EST序列。
[0017] 2)东乡野生稻SSR序列的识别： 采用SSR检索软件MISA化ttp: //pgrc . ipk-gatersleben. de/misa)对得到的非冗余 化igene-EST序列进行SSR位点查找，软件参数设置如下：重复基序为1-6个碱基，重复单元 数依次大于12次，6次，5次，5次，4次和4次。
[0018] 3)东乡野生稻genic-SSR引物的设计： 使用町 imer3.0(ht1:ps ://sou;rceforge .1161:/91'〇^'6。13/91'；[1116^处;[163/)软件对55尺位 点批量设计genic-SSR引物，引物设计参数设定为：引物长度18-28 bp;烙解溫度55-65DC， 60T为最优溫度;产物大小为80-300 bp。
[0019] 4)东乡野生稻genic-SSR引物的有效性和通用性鉴定： 提取东乡野生稻和现代栽培稻不同品种的基因组DNA，W其为模板进行PCR扩增。PCR扩 增反应采用15化的反应体系，其中包括50 ng模板DNA、1.5化10XPCR buffer、0.5 mM dNTPs、0.2 liM引物和lU TaqDNA聚合酶。
[0020] PCR反应程序：95°C预变性5 min;然后进入35个循环95°C变性30s，55-63°c退火 30s，72T延伸30s;最后72°C延伸 10 min。
[0021] PCR反应结束后，扩增产物加入2 化 loading buffer，W50 bp DNA Ladder为DNA 分子量标准，进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶浓度为3-4%。电泳结束后，采用紫外凝胶成像系统 观察并拍照。
[0022] 实施例1: 应用上述方法从美国国立生物技术信息中屯、(NCBI)网络数据库中下载获得东乡野生 稻正常培养的地上和地下部分组织转录组高通量测序数据，分别进行去接头污染序列及低 质量reads的处理，然后组装获得76258条东乡野生稻非冗余化igene-EST序列（表1)，应用 MISA软件共发掘出21226个SSR位点，其中SSR变异类型的频率分布见图1，使用Primer 3.0 软件开发SSR引物3681对。
[0023] 从3681对设计的SSR引物中随机选取25对，使用东乡野生稻和15个现代栽培稻(表 2)的基因组DNA进行引物通用性验证，具体材料信息详见表2。结果表明：选取的25对引物 中18对可在东乡野生稻中检测到清晰的目的扩增条带(表3)，成功率达到72%，说明引物的 设计成功率较高（图2) ; W现代栽培稻为模板DNA进行PCR扩增，也可W检测到清晰的目的 扩增条带，并且不同品种之间存在多态性，说明运些genic-SSR引物在栽培稻中具有较好的 通用性（图3)。
【主权项】
1. 一种东乡野生稻genic-SSR分子标记开发方法，其特征在于，所述方法步骤为： 1) 东乡野生稻Unigene-EST序列的获得： 通过美国国立生物技术信息中心网络数据库下载东乡野生稻转录组高通量测序数据， 进行去接头污染序列及低质量reads的处理，获得Unigene集，然后利用TIGR Gene Indices Clustering软件和CD-HIT软件进行组装，最终获得东乡野生稻非冗余Unigene-EST序列； 2) 东乡野生稻SSR序列的识别： 采用SSR检索软件MISA对上述步骤（1)得到的非冗余Unigene-EST序列进行SSR位点查 找;检索的限定条件为:重复基序为1-6个碱基，重复单元数依次大于12次、6次、5次、5次、4 次和4次； 3) 东乡野生稻genic-SSR引物的设计： 根据上述步骤(2)识别的SSR位点，使用primer3.0软件批量设计genic-SSR引物，引物 设计参数设定为：引物长度18-28 bp;熔解温度55-65°C，60°C为最优温度;产物大小为80-300 bp; 4) 东乡野生稻genic-SSR引物的有效性和通用性鉴定： 提取东乡野生稻和现代栽培稻不同品种的基因组DNA，以其为模板进行PCR扩增;PCR扩 增反应程序采用15 yL的反应体系，其中包括50 ng模板DNA、1.5 yL 10XPCR buffer、0.5 mM dNTPs、0.2 μΜ引物和 1U TaqDNA聚合酶； 所述PCR扩增反应程序:95°C预变性5 min;然后进入35个循环95°C变性30s，55-63°C退 火30s，72°C延伸30s;最后72°C延伸 10 min; 所述PCR扩增反程序结束后，扩增产物加入2 yL loading buffer，以50 bp DNA Ladder为DNA分子量标准，进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶浓度为3-4%;电泳结束后，采用紫外凝 胶成像系统观察并拍照;依据每条引物扩增的目的片段长度，若有80-300 bp扩增产物检测 出，该引物即为有效引物。
【文档编号】C12Q1/68GK106011275SQ201610556793
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月15日
【发明人】张帆涛, 张朦, 谢建坤, 孙佳
【申请人】江西师范大学