一种诊治下咽癌的分子标志物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了ZACN基因及其表达产物可以作为下咽癌诊治的分子标志物。通过检测受试者下咽组织中ZACN基因及其表达产物的含量可以判断受试者是否患有下咽癌或者诊断受试者是否存在患有下咽癌的风险。本发明通过研究体外培养的下咽癌细胞的增殖、迁移、侵袭等情况发现抑制ZACN基因表达可以抑制细胞增殖、抑制细胞迁移和侵袭，上述研究结果表明ZACN基因及其表达产物是治疗下咽癌的一个潜在的药物靶点。
【专利说明】
-种诊治下咽癌的分子标志物
技术领域
[0001] 本发明设及肿瘤诊断、治疗、预测预后领域，更具体地，本发明设及W检测ZACN异 常为手段的肿瘤诊断、预测预后方法;及抑制ZACN基因或蛋白质的肿瘤治疗剂。
【背景技术】
[0002] 下咽癌又称喉咽癌。国外约占头颈部恶性肿瘤的5 %，占全身恶性肿瘤的0.3 %。国 内约占头颈部恶性肿瘤的1.4%，占全身恶性肿瘤的0.2%。虽然下咽癌发病率较低，但是由 于其位置隐蔽，临床症状出现较晚，生物学性质又恶劣，67%~92%患者就诊时已经处于 ιπ、ιν期，且肿瘤范围往往被低估，预后较差。尽管目前下咽癌的诊疗手段在不断改进高，但 是下咽癌特别是晚期下咽癌生存率却无明显提高，原因是下咽癌早期诊断较为困难，到了 晚期又难W控制癌细胞的转移。癌症的早期诊断W及癌细胞转移的控制是临床上的焦点， 研究肿瘤的发生和转移规律，寻找其标志物可能有助于准确评价癌症的发生、发展，有利于 治疗措施的制定，改善患者的预后。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的之一在于提供一种通过检测ZACN基因或蛋白表达差异来诊断下咽 癌的方法。
[0004] 本发明的目的之二在于提供一种通过检测ZACN基因或蛋白表达差异来预测下咽 癌预后的方法。
[0005] 本发明的目的之Ξ在于提供一种通过抑制ZACN基因或ZACN蛋白来治疗下咽癌的 方法。
[0006] 本发明的目的之四在于提供一种用于筛选治疗下咽癌的药物的方法。
[0007] 本发明的目的之五在于提供一种用于治疗下咽癌的药物。
[000引为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
[0009]本发明提供了检测ZACN基因或ZACN蛋白的产品在制备下咽癌诊断工具中的用途。 [0010]本发明还提供了检测ZACN基因或ZACN蛋白的广品在制备预测下咽癌预后工具中 的用途。
[0011] 进一步，所述检测ZACN基因或ZACN蛋白的产品包括检测ZACN基因或ZACN蛋白的表 达水平的产品。所述产品包括能够结合ZACN基因的核酸或者能够结合ZACN蛋白的物质（例 如抗体）。所述核酸能够检测ZACN基因的表达水平;所述物质能够检测ZACN蛋白的表达水 平。
[0012] 本发明的检测ZACN基因的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能:如 PCR、如Southern杂交、Northern杂交、点杂交、巧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、AS0法、高 通量测序平台等。使用该产品可W定性地、定量地、或半定量地实施分析。
[0013] 包含在上述产品中的核酸可W通过化学合成来获得，或通过从生物材料制备含有 期望核酸的基因，然后使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来获得。
[0014] 进一步，所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS(Ampl if ication RefractoiT Mutation System,扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增 的核酸可W通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法）、PCR-RFLP法、原位RT-PCR 法、PCR-SS0 (序列特异性寡核巧酸）法、PCR-SSP法、AMPFLP (可扩增片段长度多态性）法、 MVR-PCR法、和PCR-SSCP (单链构象多态性)法来检测。
[0015] 上面所述的核酸包括扩增ZACN基因的引物，产品中包括的引物可W通过通过化学 合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化 学合成来制备。
[0016] 在本发明的具体实施方案中，所述核酸为QPCR实验中使用的扩增引物，所述引物 的序列如SEQ ID N0.1 (正向序列）和SEQ ID N0.2(反向序列)所示。
[0017] 上面所述的核酸还可包括探针，所述探针可W通过化学合成来制备，通过使用本 领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可W通 过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩 增它来制备。
[0018] 本发明的检测ZACN蛋白的产品可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例如， 可W包括化ISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹等。
[0019] 本发明的检测ZACN蛋白的产品包括特异性结合ZACN蛋白的抗体或其片段。可W使 用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合祀蛋白质即可。本 发明的检测产品中包括的抗体或其片段可W是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体 对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肤。抗体片段可W包括F (al/ )2、Fab/ Jab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区（双抗 体）、或含有CDR的肤。本发明的检测ZACN蛋白的产品可W包括编码抗体或编码抗体片段的 氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。
[0020] 抗体可W通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分祀 蛋白质的多肤或整合编码它们的多核巧酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免 疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞W获得杂交瘤。然后从杂交 瘤培养物收集抗体。最后可W通过使用被用作抗原的ZACN蛋白或其部分对获得的抗体实施 抗原特异性纯化来获得针对ZACN蛋白的单克隆抗体。可W如下制备多克隆抗体：用与上文 相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上 述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可W通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体 的序列信息来获得抗体片段。
[0021] 标记物与抗体或其片段的结合可W通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可 W如下巧光标记蛋白质或肤：用憐酸盐缓冲液清洗蛋白质或肤，添加用DMS0、缓冲剂、等准 备的染料，然后混合溶液，再于室溫放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸 如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-NH2、生物素标记试剂盒-SH (DojindoLaboratories);碱性憐酸酶标记试剂盒诸如碱性憐酸酶标记试剂盒-N肥、碱性憐 酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories);过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标 记试剂盒-NH2、过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories);藻胆蛋白标记试剂 盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、藻胆蛋白标记试剂盒-SH、B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2， B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、R-藻红蛋白标记试剂盒SH (DojindoLaboratories);巧光标记试剂盒诸如巧光素标记试剂盒-NH2、HiLyte FluoHTM) 555标记试剂盒-N肥、HiLyte Fluo;r(TM)647标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories);及 DyLi曲t 547和DyLi曲t647(Techno 化emical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluo;r(TM)抗体 标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒（Invitrogen Coloration)和EZ-标记物蛋白质标 记试剂盒(化nakoshi Co巧oration)。为了正确标记，可W使用适宜的仪器来检测经过标记 的抗体或其片段。
[0022] 作为依照本发明的检测产品的样品，可W使用例如自活检受试者获得的组织样品 或流体。样品不受特别限制，只要它适于本发明的测定;例如，它可W包括组织、血液、血浆、 血清、淋己液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材 料。
[0023] 在本发明的具体实施方案中，所述样品来自受试者的组织。
[0024] 在本发明中，"预后"是指肿瘤患者在通过手术处理等抑制或缓解肿瘤生长后的过 程或结果。在本说明书中，预后可W是通过手术处理抑制或缓解肿瘤生长后1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、15、20年或更久时的生机状态。预后可W通过检查生物标志物即ZACN蛋白或编码 ZACN蛋白的基因来预测。预后预测可W运样进行:根据生物标志物的有或无，或者升高或降 低，确定患者的预后是良好还是不良，或者确定良好预后或不良预后的概率。
[0025] 在本发明中，"预后良好"是指在通过手术处理等为患者抑制或缓解肿瘤生长之 后，患者长时期(例如3、5、6、7、8、9、10、15、20年或更长)没有危急状况。或者，预后好可^意 指在运样长时间内存活、无转移、无复发、或无再发。例如，预后良好可W意指至少3年或尤 其是至少5年存活，优选没有转移或复发。预后良好最优选的状态是长期无疾病的存活。如 本文中所使用的，"预后良好"还可W包括任何运样的状态，其中可W发现疾病如转移，但是 恶性低且不严重地影响生存能力。
[0026] 在本发明中，"预后不良"是指患者在通过手术处理等抑制或缓解肿瘤生长后的短 时期（例如1、2、3、4、5年或更短）内发生致命状况。或者，预后差是指在运样的短时期里死 亡、转移、复发、或再发。例如，预后差可W意指至少3年或尤其至少5年内复发、转移、或死 亡。
[0027] 预测预后是指预测患者状况的过程或结果，并不意味着能W100%的准确度预测 患者状况的过程或结果。预测预后是指确定某些过程或结果的可能性是否增加，而并不意 味着通过与某些过程或结果不发生的情况比较来确定发生某些过程或结果的可能性。如本 发明而言，本发明中ZACN基因或ZACN蛋白的水平升高的患者中，与不显示该特征的患者相 比，更有可能观察到特定过程或结果。
[0028] 进一步，所述检测ZACN基因或ZACN蛋白的产品可W是检测ZACN基因或ZACN蛋白的 试剂、也可W是包含所述试剂的试剂盒、忍片、试纸等，也可W是使用所述试剂的高通量测 序平台。
[0029] 本发明还提供了一种诊断下咽癌的工具，所述工具能够检测ZACN基因或ZACN蛋白 的表达水平。所述工具包括能够结合ZACN基因的核酸或者能够结合ZACN蛋白的物质（例如 抗体）。所述核酸能够检测ZACN基因的表达水平;所述物质能够检测ZACN蛋白的表达水平。
[0030] 进一步，所述核酸和所述物质的性质同前面所述。
[0031] 进一步，所述诊断下咽癌的工具包括但不限于忍片、试剂盒、试纸、或高通量测序 平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断下咽癌的工具，随着高通量测序技术的发展，对一 个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表 达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知ZACN基因的异常 与下咽癌相关也属于ZACN基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
[0032] 本发明还提供了一种预测下咽癌预后的工具，所述预测下咽癌预后工具包括能够 结合ZACN基因的核酸或者能够结合ZACN蛋白的物质(例如抗体）。所述核酸能够检测ZACN基 因的mRNA水平;所述物质能够检测ZACN蛋白的表达水平。
[0033] 进一步，所述核酸和所述物质的性质同前面所述。
[0034] 进一步，所述预测下咽癌预后的工具包括但不限于忍片、试剂盒、试纸、或高通量 测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断下咽癌的工具，随着高通量测序技术的发展， 对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基 因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知ZACN基因的 异常与下咽癌相关也属于ZACN基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
[0035] 本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗ZACN抗体或其片段所识别的氨基酸的数 目没有特别限制，只要抗体能够结合ZACN即可。当抗体作为治疗药物时，优选的是它能够识 别尽可能多的氨基酸，只要它能抑制ZACN功能。抗体或其片段识别的氨基酸的数目是至少 一个，更优选至少Ξ个。抗体的免疫球蛋白类别不受限制，可W是IgG、IgM、IgA、IgE、I曲或 I巧。
[0036] 本发明还提供了一种诊断下咽癌或预测下咽癌预后的方法，所述方法包括如下步 骤：
[0037] (1)获取受试者的样品；
[0038] (2)检测受试者样品中ZACN基因或蛋白的表达水平；
[0039] (3)将测得的ZACN基因或蛋白的表达水平与受试者的患病与否关联起来。
[0040] (4)与对照相比，ZACN基因或蛋白的表达水平升高，则该受试者被诊断为下咽癌， 或该受试者被确定为预后不良。
[0041] 本发明还提供了一种下咽癌的治疗方法，所述方法包括抑制ZACN基因或ZACN蛋 白。
[0042] 进一步，所述方法包括抑制ZACN基因的表达，或抑制ZACN蛋白的表达或抑制ZACN 蛋白的活性。
[0043] 本发明还提供了一种肿瘤药物的筛选方法，可W通过在对肿瘤细胞添加测试药物 后或在对肿瘤模型动物施用测试药物后的某个时期测量ZACN基因或者ZACN蛋白的表达水 平来测定肿瘤药物改善肿瘤预后的效果。更具体地说，当ZACN基因或者ZACN蛋白的表达水 平在添加或施用测试药物后降低时或者恢复正常水平时，可选择该药物作为改善肿瘤预后 的治疗药物。
[0044] 本发明还提供了一种含有ZACN基因或ZACN蛋白的抑制剂的药物。
[0045] 本发明还提供了上述抑制剂在制备治疗下咽癌的药物中的应用。
[0046] 本发明的ZACN基因或ZACN蛋白的抑制剂不受限制，只要是可W抑制ZACN或设及 ZACN上游或下游途径的物质的表达或活性，且对于治疗肿瘤有效的药物即可。
[0047]进一步，所述抑制剂包括反义核酸、dsRNA、核酶、适体、ZACN结合蛋白片段、或抗体 或其片段。
[004引"反义核酸"指含有与编码ZACN的mRNA互补的序列的核酸。反义核酸可W由DNA、 RNA或二者组成。反义核酸不需要与祀ZACN的mRNAlOO%互补。反义核酸可含有非互补碱基， 只要它能够在严格条件下特异性杂交即可。当将反义核酸引入细胞时，它结合祀多核巧酸 并抑制转录、RNA加工、翻译或稳定性。除反义多核巧酸之外，反义核酸还包括多核巧酸模拟 物，它含有经过修饰的主链、和y和5/端部分。运样的反义核酸可W根据ZACN序列信息来恰 当设计并使用本领域技术人员公知的方法来生成。
[00例 "dsRNA"指含有双链RNA结构，通过RNA干扰(RNAi)来抑制基因表达的RNA，包括 siRNA(短干扰RNA)和shRNA(短发夹RNA)dcIsRNA不需要与祀基因序列具有100%的同源性， 只要它可抑制祀基因表达即可。为了稳定化或其它目的，可W将dsRNA的一部分用DNA替代。 优选的是，S i RNA是21 -2 3个碱基的双链RNA。S i RNA可W通过本领域技术人员公知的方法来 制备，例如通过化学合成或作为天然存在RNA的类似物。shRNA是具有发夹转角化airpin turn)结构的短链RNA。shRNA可W通过本领域技术人员公知的方法来制备，例如通过化学合 成或通过将编码shRNA的DNA引入细胞并表达DNA。
[0050] "核酶"指具有催化活性的RNA，它能够切割、粘贴、插入、和转移RNA。核酶的结构可 W包括键头、发夹等。
[0051] "适体"指结合某物质诸如蛋白质的核酸。适体可W是RNA或DNA。核酸的形式可W 是双链或单链。适体的长度无限制，只要它能够特异性结合祀分子即可，可W由例如10至 200个核巧酸、优选10至100个核巧酸、更优选15至80个核巧酸、进一步更优选15至50个核巧 酸组成。适体可W使用本领域技术人员公知的方法来选择。例如，可W采用SELEX(通过指数 式富集进行的配体的系统进化）。
[0052] "ZACN结合蛋白的片段"指结合ZACN且抑制ZACN实施原始功能的蛋白质的片段。
[0053] 本发明的药物可W作为医药单独施用或与其它药物一起施用。可W与本发明的药 物一起施用的其它药物不受限制，只要它不损害本发明的治疗性或预防性药物的效果即 可，优选的是，用于治疗或预防肿瘤的药物可W包括例如烧化剂，诸如异环憐酷胺、环憐酷 胺、达卡己嗦、替莫挫胺、尼莫司汀、白消安、丙卡己阱、美法仑、和雷莫司汀;抗代谢物，诸如 依诺他滨、卡培他滨、卡莫氣、克拉屈滨、吉西他滨、阿糖胞巧、阿糖胞巧十八烷基憐酸盐 (cy^rabine ocfos化te)、替加氣、替加氣-尿喀晚、替加氣吉美喀晚奥替拉西钟、去氧氣尿 巧、径基脈、氣尿喀晚、氣达拉滨、培美曲塞、喷司他下、琉嚷岭、和甲氨蝶岭;植物生物碱，诸 如伊立替康、依托泊巧、索布佐生、多西他赛、nogitecan、帕利他赛、长春瑞滨、长春地辛、和 长春碱;抗癌抗生素，诸如放线菌素 D、阿柔比星、氨柔比星、伊达比星、表柔比星、净司他下 stimalamer、柔红霉素、多柔比星、化柔比星、博来霉素、培洛霉素、丝裂霉素 C、和米托蔥酿； 基于销的药物，诸如奥沙利销、卡销、顺销、和奈达销;激素药物，诸如阿那曲挫、依西美坦、 雌莫司汀、烘雌醇、氯地孕酬、戈舍瑞林、他莫昔芬、地塞米松、托瑞米芬、比卡鲁胺、氣他胺、 泼尼松龙、憐雌酪、米托坦、甲睾酬、甲径孕酬、美雄烧、亮丙瑞林、和来曲挫；生物反应修饰 剂，诸如干扰素 α、干扰素 β、干扰素丫、白介素、乌苯美司、干BCG、和香茹多糖;和分子祀向药 物，诸如伊马替尼（imatinib)、吉非替尼(旨6門1:;[]1化）、吉姆单抗、奥佐米星、他米己罗汀、曲 妥单抗、维A酸、棚替佐米(bo;rtezomib)、和利妥昔单抗等。
[0054] 本发明的药物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、 舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。
[0055] 本发明的药物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即 可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下 的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，屯、室内，直肠，阴道， 烦骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可W系统地给药。在某些情况下是局部地给药。
[0056] 本发明的药物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可，可 W依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。本发明的治疗药物或预防药物的剂量可W使用例 如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。
[0057] 在本发明的上下文中，"诊断下咽癌"既包括判断受试者是否已经患有下咽癌、也 包括判断受试者是否存在患有下咽癌的风险。
[0058] 本文所用的"治疗"涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类中治疗相关的 疾病或疾病状态，并且包括：
[0059] (1)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当该哺乳动物易感于所述疾 病状态，但尚未被诊断出患有运种疾病状态时；
[0060] (2)抑制疾病或疾病状态，即阻止其发生;或者
[0061] (3)缓解疾病或疾病状态，即使疾病或疾病状态消退。
[0062] 术语"治疗"通常设及治疗人类或动物(例如，被兽医所应用），其中可达到某些预 期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止）、改善病症和治愈 病症。还包括作为预防措施(例如预防）的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危 险的患者的用途，也包括在术语"治疗"中。
[0063] 本发明的优点和有益效果：
[0064] 本发明的发现了一种诊断下咽癌的分子标志物，使用该分子标志物可W在下咽癌 发生的早期即可作为判断，提供了患者的生存率。
[0065] 另外，通过预测患者的预后，本发明能够提供有意义的信息来为患者决定治疗方 案策略。
[0066] 本发明的包括ZACN基因或蛋白的抑制剂的治疗药物可用作新的下咽癌的治疗药 物。
【附图说明】
[0067] 图1显示利用QPCR在mRNA水平上检测ZACN基因的差异表达；
[006引图2显示利用免疫印迹在蛋白水平上检测ZACN基因的差异表达；
[0069 ] 图3显示利用QPCR检测S iRNA对ZACN基因表达的干扰效率；
[0070] 图4显示利用免疫印迹检测S iRNA对ZACN基因表达的干扰效率；
[0071] 图5显示利用MTT检测抑制ZACN基因表达对下咽癌细胞增殖的影响；
[0072] 图6显示抑制ZACN蛋白功能对下咽癌细胞增殖的影响。
[0073] 具体的实施方式
[0074] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。W下实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring化rborLaboratoiy Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0075] 实施例1基因忍片筛选差异表达基因
[0076] 1、取材：
[0077] 8例行同期颈部淋己结清扫的原发下咽癌患者手术切除癌组织，另取9例非下咽癌 疾病患者的下咽正常粘膜组织作为对照。所有癌组织均术后病理证实为下咽癌。全部原发 下咽癌患者术前均未行放、化疗，全部病例临床资料完整。
[007引 2、组织RNA的获取
[00巧]使用Tr i ZO1-步法提取组织总RNA。
[0080] 3、RNA纯度及浓度的测定
[0081 ] 取RNA溶液1μ1，仪器测定0D260、0D280，RNA浓度为0D260值X稀释倍数X 40/ 1000，计算0D260/0D280，比值在1.7-2.0代表RNA溶液纯度高，含蛋白质等杂质少，-20°C保 存。
[0082] 4、RNA完整性检测
[0083] (1)取2μ1 RNA样品行1.5%琼脂糖凝胶电泳(80v，15min);
[0084] (2)分出区带后，genefinder染色，蓝光下观察电泳区带；
[00化](3)当28s/18s约2:1时，说明RNA稳定无降解。
[00化]5、高通量转录组测序
[0087] 5. IRNA-seq读段定位
[0088] 首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用Top化t vl. 3.1将清洁片段与 UCSC H. sapiens参考基因组化gl9)进行匹配，H. sapiens UCSC hgl9版的预先构建的索引 从Top化t主页下载，并作为参考基因组，利用Top化t与基因组匹配时，允许每个读段(默认 到20)有多个匹配位点，最多2次错配。Top化t根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的 剪切位点库，根据运些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用 的Top化t方法的系统默认参数。
[0089] 5.2转录丰度评估
[0090] 匹配上的读段文件通过Cufflinks vl.0.3处理，Qifflinks vl.0.3将RNA-seq片 段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定 基因化b长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。 Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载（Homo_ sapiens.GRQi37.63.gtf)。
[0091] 5.3差异表达基因的检测
[0092] 将下载的Ensembl GTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff， Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表 达。在化ffi壯f输出中只有q值<0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。
[OOW] 6、结果
[0094] RNA-Sep结果显示，下咽癌组织与正常对照组织之间共筛选出211个差异表达基 因，其中表达水平上调的基因 54个，表达水平下调的基因 157个。
[00M] 实施例2大样本验证筛选出的差异表达基因
[0096] 基于前期高通量转录组深度测序的结果，根据P value的大小，我们选择ZACN基因 进行验证。
[0097] 1、样本收集
[0098] 按照实施例1的方法收集下咽癌组织45例，正常对照组织50例。
[0099] 2、在mRNA水平上进行验证
[0100] 2.1提取组织RNA
[0101] 步骤同实施例1。
[0102] 2.2逆转录
[0103] 反转录使用Primescript 1st strand cDNA syndesis kit试剂盒，操作步骤如下 进行：
[0104] (1)在微量离屯、管中加入W下反应液体，如表1所示：
[0105] 表1反应液体
[0106]
[0107] (2)70°C解育5min，迅速冷却至4°C ;
[0108] 在微量离屯、管内加入W下反应试剂，制成反应体系：
[0109]
[0110] ~轻轻震荡，快速离屯、后，42 °C反应化，70°C lOmin终止反应，4°C冷却，-20°c保存。~'
[0111] 义用SYBP Premix Ex Tap? Π 试剂盒，在化pendorf Real-time PCR分析仪进行， 具体操作如下：
[0112] (1)在冰上配制W下PCR反应液：
[0113]
[0114] 引物序列设计如下：
[0115] ZACN 基因：
[0116] 5'-GCGATGGAGTTAGAGTTC-3'（沈Q ID NO.l);
[0117] 5'-TGGGTCTTCAGATCATAAAC-3'（SEQ ID N0.2)
[011 引 β-actin:
[0119] 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3'（沈Q ID N0.3);
[0120] 5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3'（SEQ ID N0.4)
[0121] (2)上机，执行下述程序:95°(：预变性3111111;95°(：变性153。59°(：退火2〇3,72°(：延伸 20s，共40个循环。
[0122] 结果采用相对定量法，运用公式计算。实验重复3次。
[0123] Act = ct(A)-ct(0-actin)
[0124] Δ Δ ct = Act(实验组）-Act(对照组）
[01巧]结果如图1显示，与正常对照组织相比，下咽癌组织中ZACN基因的mRNA水平明显上 调，差异具有统计学意义(P<〇. 05)。
[01%] 3、在蛋白水平上进行验证
[0127] 按照RIPA蛋白裂解液试剂盒说明书提取各组蛋白，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒 检测样品中蛋白浓度。W常规Western-blot方法检测ZACN蛋白变化，各组实验均重复3次， Wi3-actin为内参，做ZACN蛋白条带吸光度定量分析，表达量WZACN蛋白/i3-actin吸光度的 比值代表。
[0128] 结果如图2显示，与正常对照组织相比，下咽癌组织中ZACN蛋白水平显著增加，差 异具有统计学意义(p<0.05)。
[0129] 实施例3抑制ZACN基因表达
[0130] UsiRNA设计合成
[0131] 针对 ZACN 的 siRNA 序列：
[0132] siRNA-ZACN：
[0133] 正义链为5'-AUCAUAAACUACGUAUUCCCU-3'（沈Q ID N0.5)
[0134] 反义链为5'-GGAAUACGUAGUUUAUGAUCU-3'（沈Q ID N0.6);
[0135] W上S i RNA序列与阴性对照S i RNA序列（S i RNA-NC)均由上海吉玛制药技术有限公 司提供。
[0136] 2、下咽癌细胞的培养与转染
[0137] 2.1细胞培养
[013引下咽癌FADU细胞采用含有10%胎牛血清(FBS)、青霉素 lOOU/ml、链霉素10化邑/ ml的RPMI 1640培养基置于37°C，5%C02,饱和湿度环境下培养。
[0139] 2.2细胞转染
[0140] (1)转染前24小时，在50化1无抗培养基中接种0.5-2*105个细胞，转染时细胞融合 度为30-50%。铺板时要将细胞消化完全混匀，避免细胞堆积生长。
[0141] (2)用50μ1化ti-MEM稀释siRNA(转染细胞的终浓度为33nM，轻轻吹吸3-5次混匀。
[0142] (3)轻轻颠倒混匀转染试剂，用50μ1 Opti-MEM稀释化1 Lipofectamine2000轻轻 吹吸3-5次混匀，室溫下静置5min。
[0143] (4)混合转染试剂和SiRNA稀释液，轻轻吹吸3-5次混匀，室溫下静置20min。
[0144] (5)转染复合物加入到24孔细胞板中，100μΙ/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。
[0145] (6)细胞板置于37 °C，5 %C〇2培养箱中培养18-48小时。转染4-6小时后可换鲜培养 基。
[0146] 3、利用QPCR实验检测S iRNA的干扰效率
[0147] 3.1提取细胞总RNA利用常规方法进行操作。
[0148] 3.2逆转录
[0149] 步骤同实施例2。
[0150] 3.3QPCR
[0151] 步骤同实施例2。
[0152] 3.4 结果
[0153] 结果如图3所示，与S i RNA-NC组相比，S i RNA-ZACN能够有效的抑制ZACN基因 mRNA的 表达，差异具有统计学意义(P<〇. 05)。
[0154] 4、利用Western blot实验检测siRNA的干扰效率
[0155] 步骤同实施例2。
[0156] 结果如图4所示，与siRNA-NC组相比，siRNA-ZACN能够有效的抑制ZACN蛋白的表 达，差异具有统计学意义(p<0.05)。
[0157] 实施例4ZACN基因的表达对下咽癌细胞增殖能力的测定 [015引1、步骤
[0159 ]按照实施例2的步骤进行细胞转染，将转染48小时的细胞消化，接种于96孔培养板 中，每孔5000个细胞，每孔20化L细胞悬液，分别培养24h、48、72后，W不加细胞者为空白对 照组，每孔加入20化MTT(0.5mg/mL)，培养箱内解育4h后小屯、吸去孔内液体，每孔加入10化 L DMS0，振荡10~20min，使结晶物充分溶解。酶联免疫检测仪测定各孔0D570值，W时间和 吸光度值分别为横纵坐标，绘制细胞生长曲线。每孔细胞设置3个复孔。本实验重复3次。
[0160] 2、结果
[0161] 结果如图5所示，与转染siRNA-NC组相比，转染SiRNA-ZACN组细胞增殖缓慢，差异 具有统计学意义(P<〇.05)。上述实验结果表明，ZACN基因表达促进了下咽癌细胞的增殖。
[0162] 实施例5下咽癌细胞抗体中和实验
[0163] 1、步骤：
[0164] 将下咽癌细胞FADU接种于96孔细胞培养板中，每孔巧103个细胞/孔/200μ1，细胞 贴壁后进行如下处理：
[0165] 实验组1(对照组）：下咽癌细胞中加入无关单抗(1:50);
[0166] 实验组2:下咽癌细胞中加入抗人ZACN单抗(1:50)。
[0167] 将细胞在37°C、5%C02培养箱解育24小时后，根据Brd U细胞增殖试剂盒 (Qiemicon International)的说明书，测量细胞增殖速率。
[016引2、统计学方法
[0169] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是W平均值±标准差的方式来表示， 采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具 有统计学意义。
[0170] 3、结果
[0171] 结果如图6所示，相比于对照组，加入抗人ZACN单抗的组细胞增殖减缓。上述实验 结果表明，抑制ZACN蛋白的功能可W抑制下咽癌细胞增殖。
[0172] 实施例6检测ZACN基因表达对细胞迁移影响
[0173] 1、迁移实验步骤
[0174] (1)将转染24h后的细胞消化，调整细胞密度为105/ml;
[01巧](2)24孔细胞培养板每孔加入60化L进口胎牛血清(FBS)，将化answel 1小室置入24 孔细胞培养板小孔，Transwell小室内加入各10化L RPMI 1640培养基细胞悬液；
[0176] (3)24孔细胞培养板解育2地，将化answel 1小室从24孔细胞培养板取出，弃掉培养 基，PBS冲洗Transwell小室膜部附着细胞；
[0177] (4)取新24孔细胞培养板，小孔内加入甲醇/PBS混合液（（l:l)600yL，将TYanswell 小室放入小孔，使甲醇/PBS混合液从下室（24孔细胞培养板小孔）浸入上室，室溫静置 15min；
[017引（5)弃掉化answell小室上室及24孔细胞培养板小孔内甲醇/PBS混合液，下室加入 600化甲醇，将化answe 11小室置入小孔，使甲醇从下室(24孔细胞培养板小孔)浸入上室，室 溫静置15min;
[01巧](6)弃掉甲醇，室溫下干燥15-30min;
[0180] (7)取0.1 %结晶紫染液60化L滴入24孔细胞培养板小孔，将化answe 11小室置入小 孔染色15min;
[0181] (8)弃掉0.1 %结晶紫染液，蒸馈水冲洗Transwe 11小室15min，惊干，显微镜下观 察，取不同视野拍照计数，实验重复3次。
[0182] 2、结果
[0183] 转染siRNA-NC组和转染siRNA-ZACN组每个视野下平均迁移细胞数目分别为 (167.45± 14.98)个和(79.86±8.34)个，差异具有统计学意义(P<0.05)。上述实验结果表 明，ZACN基因表达促进了下咽癌细胞的迁移。
[0184] 实施例7检测ZACN基因表达对细胞侵袭的影响
[0185] 1、侵袭实验步骤
[01化]实验前从-20°c冰箱取出Ma化igel?基质胶，冰盒上融化，取Ma化igel?基质胶与 RPMI 1640培养基按1:6比例混合，制成混合液加入Transwell小室上室，每孔45化，将 Transwel 1小室置入24孔细胞培养板，转移至37 °C 5 % C〇2培养箱解育30min，后续细胞接种 及培养操作同上述细胞迁移实验。培养2地后，弃掉培基，用棉签轻轻拭去化answell小室上 室内Matrigel?基质胶，勿损伤小室底膜，余操作同细胞转移实验。本实验重复3次。
[0187] 2、结果
[0188] 转染siRNA-NC组和转染SiRNA-ZACN组每个视野下平均侵袭细胞数目分别为 (54.14±6.46)个和(26.25±3.69)个，差异具有统计学意义。<0.05)。上述实验结果表明， ZACN基因表达促进了下咽癌细胞的侵袭。
[0189] 实施例8体外克隆形成能力的检测
[0190] 1、步骤
[0191 ] (1)将转染24h后的细胞消化后制成细胞悬液，细胞计数板计数；
[0192] (2)六孔细胞培养板每孔加入2ml 10%FBS-RPMI 1640培养基，按500个/孔细胞密 度接种细胞悬液，轻轻混匀；
[0193] (3)六孔细胞培养板移至37°C5%C02培养箱解育10天，每3天更换培养基1次，每次 2mV孔；
[0194] (4)培养结束后，弃掉培养基，PBS缓冲液小屯、清洗3次，每次5min，室溫干燥，甲醇 固定15min，弃掉甲醇，室溫空气干燥20min;
[01 Μ] (5)取0.1 %结晶紫染液加入细胞培养板，每孔加入1ml，染色15min;
[0196] (6)回收0.1%结晶紫染液，细胞培养板蒸馈水清洗15min;
[0197] (7)拍照观察计数，重复试验3次。
[019引2、结果
[0199] 转染SiRNA-NC组平均集落形成数目分别为（175.30 ± 16.45)个，转染SiRNA-ZACN 组细胞平均集落形成数目为(78.00±5.56)个。上述实验结果表明，ZACN基因表达促进了下 咽癌细胞的成瘤能力。
[0200] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核屯、思想。应当指出，对于本 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W对本发明进行若干改进 和修饰，运些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 检测ZACN基因或ZACN蛋白的广品在制备诊断下咽癌或预测下咽癌预后的工具中的 应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测ZACN基因或ZACN蛋白的产品包括 检测ZACN基因或ZACN蛋白的表达水平的产品。3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述产品包括能够结合ZACN基因的核 酸或者能够结合ZACN蛋白的物质;所述核酸能够检测ZACN基因的表达水平;所述物质能够 检测ZACN蛋白的表达水平。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩 增ZACN基因的引物如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2所示。5. -种诊断下咽癌或预测下咽癌预后的工具，其特征在于，所述工具包括能够检测 ZACN基因或ZACN蛋白的表达水平的工具。6. 根据权利要求5所述的工具，其特征在于，所述工具包括能够结合ZACN基因的核酸或 者能够结合ZACN蛋白的物质;所述核酸能够检测ZACN基因的表达水平;所述物质能够检测 ZACN蛋白的表达水平。7. 根据权利要求6所述的工具，其特征在于，所述核酸是实时定量PCR中使用的特异扩 增ZACN基因的引物如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2所示。8. -种治疗下咽癌的药物，其特征在于，所述药物包含ZACN基因或ZACN蛋白的抑制剂。9. 根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述抑制剂能够抑制ZACN或涉及ZACN上游 或下游途径的物质的表达或活性。10. 权利要求8或9所述的抑制剂在制备治疗下咽癌的药物中的应用。
【文档编号】G01N33/68GK106011291SQ201610602028
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月27日
【发明人】杨承刚, 宋宏涛
【申请人】北京泱深生物信息技术有限公司