一种检测肺癌相关基因shox2甲基化的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测肺癌相关基因SHOX2甲基化的试剂盒，以游离DNA中目的基因甲基化位点进行检测，包括三个甲基化的目的基因对应的引物及1个内参基因引物，优选还包括三个目的基因甲基化位点对应的MGB探针及内参基因对应的MGB探针，和三个甲基化目的基因对应的MGB探针。检测位点不仅包括基因的启动子区，还包括基因的编码区，多区域检测有利于提高SHOX2甲基化的准确性以及特异性。优选的通过MGB探针与甲基化序列特异性结合，对甲基化位点进行更精确的检测。操作简便、易于判读，对仪器的要求不高，整个PCR过程采用全封闭形式，避免了交叉污染的可能，结果更加精准。试剂盒检测的高灵敏性适用于肺癌的早期筛查。
【专利说明】
-种检测肺癌相关基因 SH0X2甲基化的试剂盒
技术领域
[0001] 本发明设及肺癌早期筛查检测技术领域，特别是一种WcfDNA检测肺癌相关基因 S册X2甲基化的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 据最新的数据显示，肺癌、乳腺癌分别位居男、女性恶性肿瘤发病首位，男女恶性 肿瘤死亡人数很高的均为肺癌。肿瘤专家指出，近年来在我国癌症发病的可能呈明显上升 趋势，但得到规范治疗的患者却不足一半。肺癌在我国是常见的恶性肿瘤之一，我国的肺癌 发病及死亡年龄自40岁W后迅速上升，70岁达到高峰，75岁W后略有下降。女性和男性年龄 发病的可能和死亡人数的变化趋势基本一致。但在肺癌死亡人数迅速上升的同时，不同时 期的肺癌死亡人数年龄曲线显示，肺癌死亡人数高峰出现前移。也就是说，我国肺癌的发病 及死亡年龄有年轻化的趋向。
[0003] 在肺癌的早期阶段，所表现出来的病症与一般呼吸系统疾病类似，并没有的明显 的临床症状，待出现相关临床症状时，已是肺癌的中晚期。并且临床数据表明肺癌发展到中 晚期时，只有15.8%的患者生存期能达到五年W上。因此，早期发现、早期诊断、早期治疗是 降低肺癌死亡人数的重要措施。目前，对于肺癌早期筛查的方法有多种，比如低剂量CT诊 断、组织细胞层面的肺癌诊断、基因层面的肺癌诊断等。低剂量CT检测存在较多的假阳性， 并且检测成本高;组织层面的肺癌诊断在取样方面会给患者带来较大痛苦。而对于基因层 面的诊断，随着目前分子生物学W及基因检测技术的快速发展，肿瘤特异性分子标志物检 测可作为肺癌早期诊断的一种手段。多个临床实验结果表明，肿瘤发生过程中某些基因甲 基化程度的不同可作为肿瘤诊断的一种分子标志，并且运种改变是肿瘤所特有的。DNA甲基 化是在肿瘤发生的早期阶段，在肿瘤形成初期能够利用基因检测手段提前发现，为之后的 预防、治疗、疾病监控W及预后提供一个直观的潜在指标。
[0004] 人矮小同源盒基因甜0X2(sho;rt stature homebox2)是同源盒基因家族的一员， 其表达于中胚层和外胚层，对骨骼、屯、脏和神经系统的发育起到重要的作用。有研究发现， 96%的肺癌患者細0X2发生高度甲基化，并且与基因拷贝数明显相关。并且最新的研究表 明，SH0X2基因的甲基化与肺癌密切相关，运也提示了細0X2基因的甲基化可能成为肺癌的 早期筛查指标。并且有相关研究表明在-800bp到-900bp、-1550bp到-165化P和+270化P到+ 2800bp等几个位点S册X2基因发生甲基化的概率较高。
[0005] DNA异常甲基化是人类肿瘤常见的改变。发生在启动子区W及基因内部的CpG岛异 常甲基化是基因失活的最常见机制。目前检测DNA甲基化检测方法有：甲基化特异性的PCR (Methylation-specific PCR，MSP)、亚硫酸氨盐测序法（Bisulfite sequencing PCR， BSP)、高分辨率烙解曲线法化ighResolution Melting，HRM)和高通量测序方法等。相对于 其他的检测方法而言，亚硫酸氨盐测序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP)是DNA甲基化 检测中的"金标准"，检测较为精准，但其检测灵敏度相对较低，且操作较繁琐、成本高。高分 辨率烙解曲线法化igh Resolution Melting,HRM)在PCR扩增中通过观察烙解曲线的变化 来判断DM是否发生甲基化，此类方法结果分析相对复杂。高通量测序检测方法主要是设及 到的成本太高，不利于临床上的推广。对于甲基化特异性的PCR(Methylat ion-specific PCR，MSP)检测方法，操作简便、耗时较短，结果易于分析。
[0006] 组织活检对于患者而言除了具有较大的创伤，也会因为肿瘤具有异质性，容易产 生假阴性结果。肿瘤液体活检是现在比较流行的检测方法，样本是血浆，相对组织较易获 得，且对患者无创。但血浆中肿瘤循环DNA的量较少，且易发生降解。因此，检测血浆中基因 的甲基化难度相对较大，不仅需要得到高质量的肿瘤循环DNAW及高质量的重亚硫酸盐转 化后DNA，而且需要将基因的甲基化高灵敏度、高准确度地检测出来。因此，对于此类检测试 剂盒的开发需要具备两个方面的要求:高特异性W及高灵敏度。
【发明内容】
[0007] 针对现有技术中肺癌检测产品灵敏度和特异性不佳的问题，本发明的目的是提供 一种通过检测患者血液中的游离DNA的SN0X2基因启动区和基因编码区域中Ξ个目标位点 甲基化情况来判断患病状态的试剂盒，达到辅助肺癌早期筛查的目的。上述Ξ个目标位点 对应的基因片段或者DNA片段即本发明技术方案中所述的Ξ个目的基因。
[0008] 本发明提供的检测肺癌相关基因 SH0X2甲基化的试剂盒，针对待检样品中Ξ个目 的基因的甲基化位点进行检测，其特征在于，包括已经甲基化的Ξ个目的基因对应的引物 及内参基因引物，具体引物序列如下：
[0009] 目的基因1正向引物F:TGATGTTTTTTTGTCGGAG(SEQ ID N0.1)，
[0010] 目的基因 1 反向引物R:TCAAAACAAAAAACCGC(沈Q ID N0.2);
[0011] 目的基因2正向引物F:GTTTGTATTTTTTTCGAT(沈Q ID N0.3)，
[0012] 目的基因2反向引物R:CACGAATAATAAAACGAAT(沈Q ID N0.4);
[0013] 目的基因3正向引物F:TTTTTTGGGTAGTTAATATGG(SEQ ID N0.5)，
[0014] 目的基因3反向引物R:CCAAATAATCTCCGTCC(沈Q ID N0.6);
[0015] 内参基因（β-actin)正向引物F:GTGATGGAGGAGGTTTAG(SEQ ID N0.7)，
[0016] 内参基因（β-actin)反向引物R:AAATTACAAAAACCACAA(沈Q ID N0.8)。
[0017] 本发明为了增加肺癌早期筛查的可靠性，通过选择与肺癌早期筛查密切相关的Ξ 个甲基化位点，采用特殊的引物设计方法，得出上述四对引物，提高了細0X2甲基化检测的 灵敏度W及特异性，避免了假阳性和假阴性结果的出现，使得整个试剂盒的检测准确性明 显得到提升。
[0018] 优选地，上述检测肺癌相关基因甜0X2甲基化的试剂盒，还包括Ξ个目的基因甲基 化位点对应的MGB探针W及内参基因对应的MGB探针，具体核巧酸序列如下：
[0019] 目的基因 1探针:FAM-AGCGACGTTGCGT-MGB-B册 1(沈Q ID N0.9);
[0020] 目的基因2探针:FAM-TTCGGTTCGTAGGT-MGB-B册 1(沈Q ID N0.10);
[00別]目的基因3探针:FAM-TGCGATTTCGGTCG-MGB-B册 1(沈Q ID N0.11);
[0022] 内参基因（β-actin)探针：
[0023] VIC-CACCACCCAACACACAAT-MGB-B册1(沈Q ID N0.12)。
[0024] 上述Ξ种探针序列，核巧酸序列5 '端标记巧光报告基团（FAM或VIC)，3 '端标记巧 光泽灭基团（BHQ1)。利用MGB探针设计手段，采取相对较短的探针序列，更有利于甲基化位 点的识别，进一步提高检测的特异性和灵敏度。
[0025]优选地，上述检测肺癌相关基因甜0X2甲基化的试剂盒，还包括Ξ个非甲基化目的 基因对应的MGB探针，具体核巧酸序列如下：
[00%] Blocked引物：AGTGATGTTGTGT-CY3(沈Q ID N0.13);
[0027] Blocked引物：TTTGGTTTGTAGGT-CY3(沈Q ID N0.14);
[002引 Blocked引物：TGTGATTTTGGTTG-CY3(沈Q ID N0.15)。
[0029] 在PCR扩增过程中，目的片段的引物容易与未发生甲基化的基因片段结合，并发生 突破扩增，从而产生非特异性条带，影响扩增效果。因此，作为优选方案，本试剂盒在每个扩 增体系中额外增加了一条Blocker引物(Blockerl-3分别为目的基因1-3的Blocker引物）， 引物5'端进行CY3修饰后可W阻止扩增，目的是运条引物特异性地与非甲基化基因片段结 合，进而擬弃非甲基化片段的扩增，使目的引物只与甲基化片段结合，进一步提高PCR扩增 效率W及扩增的特异性。
[0030] 优选地，上述检测肺癌相关基因甜0X2甲基化的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应 液包括DNA聚合酶、dNTPs和Mgh。
[0031] 本发明提供的检测肺癌相关基因 S册X2甲基化的试剂盒，具有如下有益效果：
[0032] 本发明试剂盒检测細0X2甲基化的位点不仅包括基因的启动子区域，还包括基因 的编码区域，运样进行多区域检测有利于提高SH0X2甲基化的准确性W及特异性，进一步提 高甜0X2的检出率。该试剂盒在分子水平上对于肺癌早期筛查具有很强针对性，具有检测特 异性、高灵敏度、准确性高等优点，运样对于早期可能的肺癌患者及早的进行预防W及采取 相应的治疗措施。
[0033] 本发明试剂盒主要采用化qman-MGB探针检测的手段，通过探针与甲基化序列特异 性结合，进而将甲基化位点精确检测。对比于用PCR特异性引物进行检测的方法，利用探针 对甲基化位点进行识别，具有更高的灵敏度、精准性。本发明采用运种技术进行相关基因的 甲基化检测，操作简便、易于判读，对仪器的要求不高，并且整个PCR过程采用全封闭形式， 避免了交叉污染的可能，使结果更加精准。试剂盒检测的高灵敏性适用于肺癌的早期筛查。
【附图说明】
[0034] 图1为实施例1检测结果。
【具体实施方式】
[0035] 为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合【具体实施方式】对本发 明作进一步的详细说明。
[0036] 实施例1检测肺癌相关基因 SH0X2甲基化的试剂盒的检测试验
[0037] 试剂盒组分如下表：
[00；3 引
[0039] 选取经过已知型别的10个肿瘤血浆样本:5个鉴定为細0X2甲基化阳性，均为肺癌 样本;5个为甜0X2甲基化阴性，为非肺癌的肿瘤样本。
[0040] 1、对上述10例血浆样本进行提取游离DNA，游离DNA提取试剂盒来自天根生化科技 有限公司。
[0041] 2、游离DNA提取完成，对提取好的DNA进行重亚硫酸盐转化，未甲基化的胞喀晚(C) 转变为尿喀晚化），而甲基化的胞喀晚(C)不变。得到纯化好的DNA，转化试剂盒来自天根生 化科技有限公司。
[0042] 3、配制PCR反应液:DNA聚合酶、dNTPs、Mgh、10XDNA聚合酶buffer、目的基因1引物 探针、目的基因巧I物探针、目的基因3引物探针、内参基因引物探针。
[0043] 4、PCR反应条件为：37°CUDG酶反应2min;95°C预变性3min;94°C变性15s，60退火延 伸35s，45个循环；
[0044] 5、PCR反应体系的配置
[0045] DNA PCR扩增MIX
[0046]
[0049]~PCR扩增程序如下:
' '
[(K)加]第一扩增阶段:37 rUDG酶反应2min;
[0化1] 第二扩增阶段:95Γ预变性3min;
[0052] 第Ξ扩增阶段:94 Γ变性15s，60 Γ退火延伸35s，45个循环；
[0化3]信号收集，第Ξ阶段6(TC收集FAM，VIC信号。
[0化4] 6、检测结果分析
[0055] 利用上述反应体系对10例样本进行检测，检测结果如图1所示。显示本发明试剂盒 能够准确检出5例阳性样本，目的基因 l/2/3ct值与内参基因 Ct值之差均小于8,说明甜0X2 发生甲基化。对剩下的5例阴性样本没有扩增曲线，目的基因 l/2/3ct值与内参基因 Ct值之 差均大于8，说明S册X2没有发生甲基化。（如表1)
[0056] 表1结果判读参考 [0化7]
[0化引实施案例2:
[0059] 收集来自浙江肿瘤医院的105例肺癌血浆样本和15例正常血浆样本，对运120例血 浆样本进行SH0X2基因甲基化的检测，具体操作步骤如实施案例1所述。15例正常血浆样本 检测结果目的基因 l/2/3ct值与内参基因 Ct值之差均大于8;而对于105个肺癌血浆样本，检 测出90例样本结果目的基因 l/2/3ct值与内参基因 Ct值之差均小于8,其敏感性达到 85.7%，特异性达到98%。
[0060] W上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核屯、思想。应当指出，对于本技术 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W对本发明进行若干改进 和修饰，运些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 一种检测肺癌相关基因 SH0X2甲基化的试剂盒，用于针对待检样品中三个目的基因 的甲基化位点进行检测，其特征在于，包括已经甲基化的三个目的基因对应的引物及内参 基因引物，具体引物序列如下： 目的基因1正向引物F:TGATGTTTTTTTGTCGGAG， 目的基因1反向引物R:TCAAAACAAAAAACCGC; 目的基因2正向引物F:GTTTGTATTTTTTTCGAT， 目的基因2反向引物R:CACGAATAATAAAACGAAT; 目的基因3正向引物F: ITITTTGGGTAGTTAATATGG， 目的基因3反向引物R:CCAAATAATCTCCGTCC; 内参基因(β-ac t in)正向引物F: GTGATGGAGGAGGTTTAG， 内参基因（β-act in)反向引物R: AAATTACAAAAACCACAA。2. 根据权利要求1所述的检测肺癌相关基因 SH0X2甲基化的试剂盒，其特征在于，还包 括三个目的基因甲基化位点对应的MGB探针以及内参基因对应的MGB探针，具体核苷酸序列 如下： 目的基因 1探针:FAM-AGCGACGTTGCGT-MGB-BHQ1; 目的基因2探针:FAM-TTCGGTTCGTAGGT-MGB-BHQ1; 目的基因3探针:FAM-TGCGAITTCGGTCG-MGB-BHQ1; 内参基因(β-actin)探针： VIC-CACCACCCAACACACAAT-MGB-BHQ1〇3. 根据权利要求1所述的检测肺癌相关基因 SH0X2甲基化的试剂盒，其特征在于，还包 括三个非甲基化目的基因对应的MGB探针，具体核苷酸序列如下： Blocker 1 引物:AGTGATGTTGTGT-CY3; Blocker2 引物：TTTGGTTTGTAGGT-CY3; Blocker3 引物：TGTGATTTTGGTTG-CY3。4. 根据权利要求1所述的检测肺癌相关基因 SH0X2甲基化的试剂盒，其特征在于，还包 括PCR反应液、重亚硫酸盐和UDG酶。5. 根据权利要求4所述的检测肺癌相关基因 SH0X2甲基化的试剂盒，其特征在于，所述 PCR反应液包括DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+。
【文档编号】C12Q1/68GK106011292SQ201610602854
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月27日
【发明人】刘沛, 王林海
【申请人】北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司