一种基于实时荧光pcr技术快速筛查黄瓜中病原微生物的方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于实时荧光PCR技术快速筛查黄瓜中病原微生物的方法，该方法结合传统细菌培养法，以水煮法提取选择性增菌后黄瓜中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7和单增李斯特氏菌的细菌基因组DNA，应用实时荧光PCR技术对四种食源性致病菌进行快速筛查。本发明采用的DNA提取方法，30min内即可完成样品DNA提取的全过程，实时荧光PCR方法，90min内可完成样品的全过程鉴定，具有高效、快速、实时、操作简便等优势，为生鲜果蔬黄瓜中食源性致病菌的快速筛查提供了技术支撑。
【专利说明】
-种基于实时黄光PCR技术快速筛查黄瓜中病原微生物的 方法
技术领域
[0001] 本发明属于食品微生物鉴定与应用技术领域，具体设及生鲜果蔬黄瓜中沙口氏 菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157 :H7和单增李斯特氏菌四种食源性致病菌的DNA提取及 实时巧光快速筛查方法。
【背景技术】
[0002] 即食生鲜蔬菜和水果是食源性致病菌传播的主要载体之一。即食生鲜蔬果属于低 酸性食品，具有较高的含水量，同时含有多种营养元素不耐高溫，因此消费者在食用时往往 不烹调，简单清洗后便直接食用，由此极易招致病原微生物的侵染，存在食用安全隐患。现 已有报道污染即食蔬果的食源性致病菌有:大肠杆菌0157 :H7、沙口氏菌、金黄色葡萄球菌 和单增李斯特氏菌等。然而，即食生鲜蔬果中食源性致病菌的分布具有不确定性和难控制 性，我国虽自2003年开始启动了多种食源性致病菌的监测计划，但仍缺乏即食蔬菜水果中 致病菌污染水平的系统完整的统计资料。
[0003] 黄瓜（cucumber)作为即食蔬菜中较为常见的蔬菜品种之一，深受广大消费者喜 爱。黄瓜在种植、采收、胆藏、运输和销售的过程中表面都有可能受到各种微生物的污染，而 在整个过程中如果完整性遭到破坏容易使汁液营养物外流，运无疑又加大了微生物感染的 几率。因此，虽然中国还没有出现食用生鲜蔬果而发生集体安全事件的案例，但其潜在的食 用安全隐患较大，那么，防治就显得尤为重要。针对即食蔬果从农田到餐桌的产业链，可通 过采收前、采后运输、流通销售和产品胆藏等四个阶段控制生鲜蔬果的微生物污染。
[0004] 因此，亟需针对即食生鲜蔬菜水果中的病原微生物展开调查及安全性评估，确定 风险隐患和危害程度，为风险交流与管理、科普宣传与解答公众疑虑提供科学依据，并增加 民众对致病菌的认知、自觉采取安全的家庭加工和食用方式的意识。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于在大样本筛查生鲜黄瓜中的食源性致病菌时能够快速、简便的 得到筛查结果，在第一时间控制食源性致病菌的蔓延，为食品安全突发事件争取有效的时 间。本发明的快速筛查方法具有高效、快速、实时监测、操作简便等优势。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：
[0007] -种基于实时巧光PCR技术快速筛查黄瓜中病原微生物的方法，其特征在于它按 如下步骤进行：
[000引（1)吸取选择性增菌后的沙口氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157 :H7和单增李 斯特氏菌的增菌液各ImL于2mL离屯、管中，13200rpm离屯、lOmin，弃上清，沉淀溶于10化L去离 子水中，封口膜封好，沸水浴lOmin，取出后迅速冷冻于-20°C冰箱中lOmin，去掉封口膜， 13200巧m离屯、3min，上清即为DNA;
[0009] (2)采用实时巧光PCR扩增引物及探针引物，对四种食源性致病菌的DNA进行扩增；
[0010] 其中的实时巧光PCR反应体系为20化，各成分含量为：2 XMix预混液10化，上下游 引物各化L，探针引物0.化L，R0X 0.化L，模板化L，无菌超纯水补足20化，混匀后离屯、，在实 时巧光PCR仪上开始循环。循环参数为:95°C预变性lOmin，然后进行40个循环，每个循环为 95°(：变性153,60°(：退火1111111。
[0011] 本发明所述的快速鉴定方法，其中四种食源性致病菌指的是:沙口氏菌、金黄色葡 萄球菌、大肠杆菌0157: H7和单增李斯特氏菌。
[0012] 为了能更加清楚的说明本发明的快速筛查方法，下面W生鲜果蔬黄瓜为样本实 例，对本发明的快速筛查方法加 W说明。
[OOU] -、材料和引物
[0014] (1)样品：30份黄瓜样品，由农贸市场购置。
[0015] (2)主要仪器:高速冷冻离屯、机，实时巧光定量PCR扩增仪，恒溫水浴锅。
[0016] (3)主要试剂：
[0017] PCR引物、探针由上海生工公司合成，引物序列见表1。
[001 引 2XPremix Ex Taq(Probe qPCR)试剂购自TaKaRa公司。
[0019] 表1食源性致病菌鉴定定量PCR引物序列
[0020]
[0021] 二、生鲜果蔬黄瓜中食源性病原菌DNA提取
[0022] (1)称取黄瓜样品25g，按照国标GB 4789各致病菌检测方法进行选择性增菌；
[0023] (2)吸取选择性增菌后的沙口氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157:H7和单增李 斯特氏菌的增菌液各ImL于2mL离屯、管中，13200巧m离屯、lOmin，弃上清；
[0024] (3)沉淀溶于1(Κ)化去离子水中，封口膜封好，沸水浴lOmin;
[0025] (4)取出后迅速冷冻于-20 °C冰箱中1 Omin;
[0026] (5)去掉封口膜，13200巧m离屯、3min，上清即为DM。
[0027] Ξ、黄瓜食源性致病菌DM的实时巧光PCR扩增筛查试验：
[002引1、PCR反应体系组成：
[00巧]2XPremix Ex Taq(Probe qPCRHOyL，上游和下游引物 10皿ol/L各化L，探针 10μ mol/L，0.化L，R0X，0.化L，供试黄瓜细菌基因组DM模板，2yL，双蒸水补足20μ1^;
[0030] 2、PCR反应程序：
[0031] 95Γ预变性 10min;40个扩增循环(95Γ，15sec;6(TC，lmin);
[0032] 3、实时巧光PCR扩增结果：
[0033] 通过扩增曲线的有无及Ct值的大小，判断食源性病原菌的检出与否，结果见附图 1。扩增结果为阳性的样品，再进行进一步的生化鉴定。
[0034] 本发明具有的积极效果在于：
[0035] (1)采用分子生物学鉴定方法与传统培养方法相结合，有效的克服了因传统方法 费时、费力、繁琐、且检测周期过长，难W满足应急预案处理的需要。
[0036] (2)本方法最大的优点在于其过程快速，简便，实时监测，充分提高了生鲜果蔬黄 瓜中食源性致病菌鉴定的检测效率。与传统的培养鉴定过程需要将近1周的时间相比，采用 本方法，2天即可完成样本筛查的全过程。
[0037] (3)采用本发明方法对黄瓜样品进行筛查，一次性可筛查的样本量相比传统培养 法可大大提局。
【附图说明】：
[0038] 图1为黄瓜样品中四种食源性致病菌筛查鉴定的实时巧光PCR扩增图谱;如图标注 分别为黄瓜样品；阳性对照样本;空白对照样本；
[0039] 图2为普通绿黄瓜样品中四种食源性致病菌筛查鉴定的实时巧光PCR扩增图谱;如 图标注分别为普通绿黄瓜样品；阳性对照样本;空白对照样本；
[0040] 图3为旱黄瓜样品中四种食源性致病菌筛查鉴定的实时巧光PCR扩增图谱;如图标 注分别为旱黄瓜样品；阳性对照样本;空白对照样本；
[0041] 图4为荷兰黄瓜样品中四种食源性致病菌筛查鉴定的实时巧光PCR扩增图谱;如图 标注分别为荷兰黄瓜样品；阳性对照样本;空白对照样本；
【具体实施方式】
[0042] 为了能更加清楚的说明本发明的方法，下面结合实施例对本发明做进一步的描 述。
[0043] 实施例1
[0044] W普通绿黄瓜为样本，采用本发明方法快速筛查四种食源性致病菌。制备方法如 下：
[0045] (1)称取黄瓜样品25g，按照国标GB 4789各致病菌检测方法进行选择性增菌；
[0046] (2)吸取选择性增菌后的沙口氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157 :H7和单增李 斯特氏菌的增菌液各ImL于2mL离屯、管中，13200rpm离屯、lOmin，弃上清;沉淀溶于10化L去离 子水中，封口膜封好，沸水浴lOmin;取出后迅速冷冻于-20°C冰箱中lOmin;去掉封口膜， 13200巧m离屯、3min，上清即为DNA。
[0047] 实时巧光PCR检测：
[0048] 1、对四种食源性致病菌进行实时巧光PCR扩增，引物序列为：
[0049] SM-F:5 '-GCGGCGTTGGAGAGTGATA-3 '
[0050] SM-R:5 '-AGCAATGGAAAAAGCAGGATG-3，
[0化 1 ] SM-P:5 '-FAM-CATTTCTTAAACGGCGGTGTCTTTCCCT-TAMRA-3 '
[0化 2 ]肝-F:5 '-TTCTTCACGACTAAATAAACGCTCA-3 '
[005；3 ]肝-R: 5 ' -GGTACTACTAAAGATTATCAAGACGGCT-3，
[0054] JP-P: 5 ' -FM-CAGAACACAATGTTTCCGATGCAACGT-TMRA-3 '
[0055] 0157:H7-F:5 '-TCCTCAGCTATAGGGTGCTTTTG-3 '
[0056] 0157:H7-R:5 '-ATCGAAACAAGGCCAGTTTTTTAC-3 '
[0057] 0157:H7-P:5 '-FAM-TATTTTTCCGAGTACATTGGCATCGTGTGG-TAMRA-3 '
[0 化引 LST-F: 5 ' -CTGAATCTCAAGCAAAACCTGGT-3 '
[0059] LST-R:5 '-CGCGACCGAAGCCAACTA-3 '
[0060] LST-P:5 '-FAM-ATACGATAACATCCACGGCTCTGGCTGG-TAMRA-3 '
[0061] 2、反应体系：
[0062] 2XPremix Ex Taq(Probe qPCRHOyL，上游和下游引物 10皿ol/L各化L，探针 10μ mol/L，0.化L，R0X，0.化L，供试普通绿黄瓜细菌基因组DM模板，2yL，双蒸水补足20yL。
[0063] 3、反应程序：
[0064] 95°C预变性 10min;40个扩增循环(95°C，15sec;60°C，lmin);
[0065] 4、结果:普通绿黄瓜实时巧光PCR扩增结果见图2。
[0066] 实施例2
[0067] W旱黄瓜为样本，采用本发明方法快速筛查四种食源性致病菌。制备方法如下：
[0068] (1)称取黄瓜样品25g，按照国标GB 4789各致病菌检测方法进行选择性增菌；
[0069] (2)吸取选择性增菌后的沙口氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157 :H7和单增李 斯特氏菌的增菌液各ImL于2mL离屯、管中，13200rpm离屯、lOmin，弃上清;沉淀溶于10化L去离 子水中，封口膜封好，沸水浴lOmin;取出后迅速冷冻于-20°C冰箱中lOmin;去掉封口膜， 13200巧m离屯、3min，上清即为DNA。
[0070] 实时巧光PCR检测：
[0071] 1、对四种食源性致病菌进行实时巧光PCR扩增，引物序列为：
[0072] SM-F:5 '-GCGGCGTTGGAGAGTGATA-3 '
[0073] SM-R:5 '-AGCAATGGAAAAAGCAGGATG-3，
[0074] SM-P:5 '-FAM-CATTTCTTAAACGGCGGTGTCTTTCCCT-TAMRA-3 '
[00 巧]肝-F:5 '-TTCTTCACGACTAAATAAACGCTCA-3 '
[0076] 肝-R:5 '-GGTACTACTAAAGATTATCAAGACGGCT-3 '
[0077] 肝-P:5 '-FAM-CAGAACACAATGTTTCCGATGCAACGT-TAMRA-3 '
[007引 0157:H7-F:5 '-TCCTCAGCTATAGGGTGCTTTTG-3 '
[00 巧]0157:H7-R:5 '-ATCGAAACAAGGCCAGTTTTTTAC-3 '
[0080] 0157:H7-P:5，-FAM-TATTTTTCCGAGTACATTGGCATCGTGTGG-TAMRA-3 '
[0081 ] LST-F:5 '-CTGAATCTCAAGCAAAACCTGGT-3 '
[0082] LST-R:5，-CGCGACCGAAGCCAACTA-3 '
[0083] LST-P:5，-FAM-ATACGATAACATCCACGGCTCTGGCTGG-TAMRA-3 '
[0084] 2、反应体系：
[0085] 2XPremix Ex Taq(Probe qPCRHOyL，上游和下游引物 10皿ol/L各化L，探针 10μ mol/L，0.化L，R0X，0.化L，供试普通绿黄瓜细菌基因组DM模板，2yL，双蒸水补足20yL。
[00化]3、反应程序：
[0087] 95°C预变性 10min;40个扩增循环(95°C，15sec;60°C，lmin);
[0088] 4、结果:普通绿黄瓜实时巧光PCR扩增结果见图2。
[0089] 实施例3
[0090] W荷兰黄瓜为样本，采用本发明方法快速筛查四种食源性致病菌。制备方法如下：
[0091] (1)称取黄瓜样品25g，按照国标GB 4789各致病菌检测方法进行选择性增菌；
[0092] (2)吸取选择性增菌后的沙口氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌0157:H7和单增李 斯特氏菌的增菌液各ImL于2mL离屯、管中，13200rpm离屯、lOmin，弃上清;沉淀溶于10化L去离 子水中，封口膜封好，沸水浴lOmin;取出后迅速冷冻于-20°C冰箱中lOmin;去掉封口膜， 13200巧m离屯、3min，上清即为DNA。
[0093] 实时巧光PCR检测：
[0094] 1、对四种食源性致病菌进行实时巧光PCR扩增，引物序列为：
[00 巧]SM-F:5 '-GCGGCGTTGGAGAGTGATA-3 '
[00化]SM-R:5 '-AGCAATGGAAAAAGCAGGATG-3，
[0097] SM-P:5 '-FAM-CATTTCTTAAACGGCGGTGTCTTTCCCT-TAMRA-3 '
[009引 肝-F:5 '-TTCTTCACGACTAAATAAACGCTCA-3 '
[0099] 肝-R:5 '-GGTACTACTAAAGATTATCAAGACGGCT-3 '
[0100] JP-P: 5 ' -FM-CAGAACACAATGTTTCCGATGCAACGT-TMRA-3 '
[0101] 0157:H7-F:5 '-TCCTCAGCTATAGGGTGCTTTTG-3 '
[0102] 0157:H7-R:5 '-ATCGAAACAAGGCCAGTTTTTTAC-3 '
[0103] 0157:H7-P:5 '-FAM-TATTTTTCCGAGTACATTGGCATCGTGTGG-TAMRA-3 '
[0104] LST-F:5 '-CTGAATCTCAAGCAAAACCTGGT-3 '
[0105] LST-R:5 '-CGCGACCGAAGCCAACTA-3 '
[0106] LST-P:5 '-FAM-ATACGATAACATCCACGGCTCTGGCTGG-TAMRA-3 '
[0107] 2、反应体系：
[010引 2XPremix Ex Taq(Probe qPCRHOyL，上游和下游引物 10皿ol/L各化L，探针 10μ mol/L，0.化L，R0X，0.化L，供试普通绿黄瓜细菌基因组DM模板，2yL，双蒸水补足20yL。
[0109] 3、反应程序：
[0110] 95°C 预变性 10min;40 个扩增循环(95°C，15sec;60°C，lmin);
[0111] 4、结果:普通绿黄瓜实时巧光PCR扩增结果见图2。
【主权项】
1. 用于鉴定四种食源性致病菌的PCR扩增引物及探针引物，其特征在于，包括沙门氏菌 引物正向序列：5' -GCGGCGTTGGAGAGTGATA-3'，反向序列：5' -AGCAATGGAAAAAGCAGGATG-3'， 探针序列：57 -FAM-CATTTCTTAAACGGCGGTGTCTTTCCCT-TAMRA-3';金黄色葡萄球菌引物正向 序列：5 7 - TTCTTCACGACTAAATAAACGCTCA-37，反向序列：57 -GGTACTACTAAAGATTATCAAGACGGCT-3'，探针序列：5' -FAM-CAGAACACAATGTTTCCGATGCAACGT-TAMRA-3';大肠杆菌0157: H7引物正向序列：5' -TCCTCAGCTATAGGGTGCTTTTG-3'，反向序列： 57 -ATCGAAACAAGGCCAGTTTTTTAC-37，探针序列：57 - FAM-TATTTTTCCGAGTACATTGGCATCGTGTGG-TAMRA-3';单增李斯特氏菌引物正向序列：57 -CTGAATCTCAAGCAAAACCTGGT-3'，反向序列:57 -CGCGACCGAAGCCAACTA-3'，探针序列：57 -FAM-ATACGATAACATCCACGGCTCTGGCTGG-TAMRA-37 〇2. -种基于实时荧光PCR技术快速筛查黄瓜中病原微生物的方法，其特征在于它按如 下步骤进行： (1) 吸取选择性增菌后的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌〇157:H7和单增李斯特 氏菌的增菌液各lmL于2mL离心管中，13200rpm离心10min，弃上清，沉淀溶于100yL去离子水 中，封口膜封好，沸水浴lOmin，取出后迅速冷冻于-20 °C冰箱中lOmin，去掉封口膜， 13200rpm离心3min，上清即为DNA; (2) 采用实时荧光PCR扩增引物及探针引物，对四种食源性致病菌的DNA进行扩增； 其中的实时荧光PCR反应体系为20yL，各成分含量为：2 X Mix预混液10yL，上下游引物 各lyL，探针引物0.4yL，R0X 0.4yL，模板2yL，无菌超纯水补足20yL，混匀后离心，在实时荧 光PCR仪上开始循环。循环参数为:95 °C预变性lOmin，然后进行40个循环，每个循环为95 °C 变性 15s，60°C 退火 lmin。3. 利要求1、2所述的快速鉴定方法，其中四种食源性致病菌指的是:沙门氏菌、金黄色 葡萄球菌、大肠杆菌0157: H7和单增李斯特氏菌。
【文档编号】C12Q1/14GK106011297SQ201610628283
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月30日
【发明人】赵新, 兰青阔, 王永, 陈锐, 朱珠, 刘娜, 王成
【申请人】天津市农业质量标准与检测技术研究所