一种ApoE试剂盒、引物及其用图

一种ApoE试剂盒、引物及其用图
【专利摘要】本发明公开了一种ApoE试剂盒、引物及其用途，两个SNP位点是否具有已知突变的测定方法。其中，该方法包括：利用第一引物和第二引物对核酸样本进行PCR扩增，并且在PCR扩增体系中加入核酸探针，核酸探针对应两个预定位点之间至少一部分对应的核酸序列；检测反应体系的发光，以便确定核酸样本的预定位点是否存在已知突变，第一引物的近3’端包含与两个预定位点之一已知突变对应的碱基，第二引物的近3’端包含与另一个已知突变对应的碱基，核酸探针具有：发光基团，发光基团形成于核酸探针的5’端，调节基团，调节基团形成于核酸探针的3’端，并且调节基团可以调节发光基团的发光。利用该方法能够有效地确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变。
【专利说明】
-种ApoE试剂盒、引物及其用途
技术领域
[0001] 本发明设及一种ApoE试剂盒、引物及其用途，两个SNP位点是否具有已知突变的测 定。具体设及一种确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法、试剂盒W及引 物，属于生物学领域。
【背景技术】
[0002] ApoE是一种载脂蛋白，其遗传多态性主要受控于两个SNP位点rs429358和rs7412， 运两个SNP位点通过不同的核酸组合决定了ApoE的Ξ种等位基因型：e2(rs429358为T， rs7412 为T)、e3(rs429358 为T，rs7412 为 C)、e4(rs429358 为C，rs7412 为C),运 Ξ种类型等位 基因分别编码Ξ种ApoE蛋白亚型，即ApoE2(其蛋白序列的112位和158位均为半脫氨酸）、 ApoE3(其蛋白序列的112位为半脫氨酸，158位为精氨酸）、ApoE4(其蛋白序列的112位和158 位均为精氨酸）。
[0003] 因此，ApoE 基因有 ε2/ε2、ε3/ε3、和 ε4/ε4Ξ 种纯合子型与 ε2/ε3、ε2/ε4 和 ε3/ε4Ξ 种杂合子型。
[0004] 目前ApoE基因分型的方法主要有:传统DNA测序法、等位基因特异性寡核巧酸探针 杂交法、聚合酶链反应-单链构象多态性法、聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性法、 多重扩增受阻突变体系PCR技术法、高分辨率溶解曲线法W及双色巧光分子探针法等。
[0005] 然而，目前确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法，仍有待改进。

【发明内容】

[0006] 本发明的目的在于，提供一种ApoE试剂盒、引物及其用途，两个SNP位点是否具有 已知突变的测定，W克服现有技术所存在的上述缺点和不足。
[0007] 本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出了可W 有效确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法。本发明所需要解决的技术问 题，可W通过W下技术方案来实现：
[000引在本发明的第一个方面，一种ApoE试剂盒，其特征在于，包括：
[0009] 第一引物，所述第一引物的近3'端包含与所述两个预定位点之一已知突变对应的 碱基，
[0010] 第二引物，所述第二引物的近3'端包含与所述两个预定位点另一个已知突变对应 的碱基，
[0011] 核酸探针，所述核酸探针与两个预定位点之间至少一部分对应的核酸序列，并且 所述核酸探针具有：
[0012] 发光基团，所述发光基团形成于所述核酸探针的5'端，
[0013] 调苄基团，所述调苄基团形成于所述核酸探针的3'端，并且所述调苄基团可W调 节所述发光基团的发光，
[0014] 其中，所述预定位点是SNP rs429358和rs7412，
[0015] 其中，所述述第一引物的近3'端包含与rs429358的已知突变对应的碱基，所述第 二引物的近3'端包含与rs7412的已知突变对应的碱基，
[0016] 其中，所述第一引物的3'端碱基为与rs429358的已知突变对应的碱基，所述第二 引物的3'端碱基为与rs7412的已知突变对应的碱基，
[0017]其中，所述第一引物作为正向引物，所述第二引物作为反向引物，
[001引其中，所述第一引物包括：
[0019] 5'-CGGACATGGAGGACGTGT-3'
[0020] 5 '-GCGGACATGGAGGACGAGT-3 '
[0021] 日 '-CGCGGACATGGAGGACGTTT-3 '
[0022] 5 '-CGGACATGGAGGACGAGC-3 '
[0023] 5 '-GCGGACATGGAGGACGTGC-3 '
[0024] 5 '-CGCGGACATGGAGGACGTTC-3 '，
[00巧]所述第二引物包括：
[0026] 5'-TGGTACACTGCCAGGTA-3'
[0027] 5 '-CTGGTACACTGCCAGTCA-3 '
[0028] 5'-CCTGGTACACTGCCAGGCA-3'
[0029] 5 '-TGGTACACTGCCAGGCG-3 '
[0030] 5 '-CTGGTACACTGCCAGGTG-3 '
[0031] 5 '-CCTGGTACACTGCCAGTCG-3 '，
[0032] 其中，所述核酸探针的长度为20个核巧酸。
[0033] 其中，所述核酸探针的序列为:5'-〔46口'0：1^66了6口'口'66(：-3'。
[0034] 进一步，所述核酸探针的发光基团为巧光基团，所述巧光基团为FAM，所述调苄基 团为泽灭基团，所述泽灭基团为B册1。
[0035] Ξ种基因的阳性质粒用Tr i S-HC1缓冲液（lOmM，P册.0)进行稀释，得到2400拷贝/μ 1、240拷贝/μ巧日24拷贝/μ1的，并对运些样本进行检测，95 % (η>20)的阳性率作为最低检 测限的标准，
[0036] 浓度为2400拷贝/μ1和浓度为240拷贝/μ1阳性质粒阳性质粒，重复检测20次，20个 可检出结果，检出率为100% ;
[0037] 浓度为24拷贝/μ1阳性质粒，重复检测20次，ε2、ε3和ε4检测试剂分别有16、18和14 个可检出结果，检出率分别为80%、90%和70%;
[0038] 所述试剂盒检测最低检出限为240拷贝/μ1，换算成基因组DNA的量为O.Sng/μΙ，即 4ng/反应；
[0039] AP0E基因检测试剂能够耐受总量为6*104拷贝/反应的其它亚型的DNA，根据阳性 质控品的大小，换算成基因组DNA的量为20化g/反应。
[0040] 根据本发明的实施例，所述试剂盒可W应用于前面所述的确定核酸样本的两个预 定位点是否具有已知突变的方法。由此，利用根据本发明实施例的确定核酸样本的两个预 定位点是否具有已知突变的试剂盒对核酸样本进行检测，可W有效地确定核酸样本的两个 预定位点是否具有已知突变，并进一步可W有效地确定ApoE的等位基因分型，对于阿尔茨 海默症和屯、脑血管疾病的预防W及早期诊断具有非常重要的意义。另外，前面针对确定核 酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法所描述的特征和优点，也当然地适用该试 剂盒，不再寶述。
[0041] 本发明的第二方面，本发明提出了一组确定核酸样本的两个预定位点是否具有已 知突变的PCR引物。
[0042] -种ApoE试剂盒的引物，其特征在于，所述引物包括：
[0043] 第一引物，所述第一引物的近3'端包含与所述两个预定位点之一已知突变对应的 碱基，
[0044] 第二引物，所述第二引物的近3'端包含与所述两个预定位点另一个已知突变对应 的碱基，
[0045] 所述第一引物的近3'端包含与rs429358的已知突变对应的碱基，所述第二引物的 近3 '端包含与rs7412的已知突变对应的碱基，
[0046] 所述第一引物的3'端碱基为与rs429358的已知突变对应的碱基，所述第二引物的 3 '端碱基为与rs7412的已知突变对应的碱基，
[0047] 所述第一引物作为正向引物，所述第二引物作为反向引物，
[004引其中，所述第一引物包括：
[0049] 日 '-CGGACATGGAGGACGTGT-3 '
[0050] 5 '-GCGGACATGGAGGACGAGT-3 '
[0051 ] 5 '-CGCGGACATGGAGGACGTTT-3 '
[0化。5 ' -CGGACATGGAGGACGAGC-3 '
[0053 ] 5 '-GCGGACATGGAGGACGTGC-3 '
[0054] 5 '-CGCGGACATGGAGGACGTTC-3 '，
[0化5]所述第二引物包括：
[0化6] 5'-TGGTACACTGCCAGGTA-3'
[0057 ] 5 '-CTGGTACACTGCCAGTCA-3 '
[005引 5'-CCTGGTACACTGCCAGGCA-3'
[0059] 5 '-TGGTACACTGCCAGGCG-3 '
[0060] 5 '-CTGGTACACTGCCAGGTG-3 '
[0061 ] 5 '-CCTGGTACACTGCCAGTCG-3 '。
[0062] 根据本发明的实施例，所述PCR引物可W应用于前面所述的确定核酸样本的两个 预定位点是否具有已知突变的方法W及试剂盒。由此，PCR扩增过程中引物可W与模板按照 碱基配对原则选择性结合，PCR扩增可W按照预定方向进行有效扩增，并且能够特异地扩增 出不同等位基因。另外，前面针对确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法 及试剂盒所用引物的描述的特征和优点，也当然地适用该PCR引物，不再寶述。
[0063] 在本发明的又一个方面，一种ApoE试剂盒的用途，其特征在于，用于确定核酸样本 的两个预定位点是否具有已知突变。
[0064] 其中，所述确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法，包括W下步 骤：
[0065] a.引物设计：
[0066] b.巧光DNA分子探针设计：
[0067] c.PCR反应体系配制：
[006引 d.PCR反应体系配制：
[0069] 利用第一引物和第二引物对所述核酸样本进行PCR扩增，并且在所述PCR扩增体系 中加入核酸探针，所述核酸探针对应两个预定位点之间至少一部分的核酸序列；W及
[0070] e.检测反应体系的发光，
[0071] f.数据分析与结论：
[0072] W便确定所述核酸样本的预定位点是否存在已知突变。
[0073] 进一步，所述第一引物的近3'端包含与所述两个预定位点之一已知突变对应的碱 基，
[0074] 所述第二引物的近3'端包含与所述两个预定位点另一个已知突变对应的碱基，
[0075] 所述第一引物和第二引物之一作为正向引物，所述第一引物和所述第二引物的另 一个作为反向引物，
[0076] 所述核酸探针具有：
[0077] 发光基团，所述发光基团形成于所述核酸探针的5'端，
[0078] 调苄基团，所述调苄基团形成于所述核酸探针的3'端，并且所述调苄基团可W调 节所述发光基团的发光，
[0079] 其中，所述核酸样本来源于人体组织或细胞、重组核酸或转基因生物组织细胞，
[0080] 其中，所述预定位点是SNP rs429358和rs7412，
[0081 ] 其中，所述述第一引物的近3'端包含与rs429358的已知突变对应的碱基，所述第 二引物的近3'端包含与rs7412的已知突变对应的碱基，
[0082] 其中，所述第一引物的3'端碱基为与rs429358的已知突变对应的碱基，所述第二 引物的3'端碱基为与rs7412的已知突变对应的碱基，
[0083] 其中，所述第一引物作为正向引物，所述第二引物作为反向引物，
[0084] 其中，所述第一引物包括：
[0085] 日 '-CGGACATGGAGGACGTGT-3 '
[00 化]5'-GCGGACATGGAGGACGAGT-3'
[0087] 5 '-CGCGGACATGGAGGACGTTT-3 '
[0088] 5'-CGGACATGGAGGACGAGC-3'
[0089] 5 '-GCGGACATGGAGGACGTGC-3 '
[0090] 5 '-CGCGGACATGGAGGACGTTC-3 '，
[0091] 所述第二引物包括：
[0092] 5 '-TGGTACACTGCCAGGTA-3 '
[0093] 5 '-CTGGTACACTGCCAGTCA-3 '
[0094] 5'-CCTGGTACACTGCCAGGCA-3'
[00 巧]5 '-TGGTACACTGCCAGGCG-3 '
[0096] 5'-CTGGTACACTGCCAGGTG-3'
[0097] 5 '-CCTGGTACACTGCCAGTCG-3 '，
[0098] 其中，所述核酸探针的长度为20个核巧酸。
[0099] 进一步，所述核酸探针的序列为:5'-〔46口'(：口^66了6口'口'66(：-3'。
[0100] 更进一步，所述核酸探针的发光基团为巧光基团，所述巧光基团为FAM，所述调节 基团为泽灭基团，所述泽灭基团为B册1。
[0101] 根据本发明实施例的方法，能够通过检测PCR扩增体系所产生的巧光，有效地确定 所检测的核酸样本的两个预定位点同时存在相应的已知突变，并进一步可W有效地确定 ApoE的等位基因分型，对于阿尔茨海默症及屯、脑血管等与ApoE基因型相关疾病的预防、早 期诊断W及疾病预后具有非常重要的意义。
[0102] 根据本发明的一些实施例，上述确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变 的方法还可W具有下列附加技术特征：
[0103] 根据本发明的一个实施例，所述核酸样本来源于重组核酸或转基因生物组织细 胞，根据本发明的实施例，可W对上述来源的核酸样本进行有效地确定突变类型，从而可W 对提供核酸样本的个体进行有效地分析。
[0104] 根据本发明的一个实施例，所述预定位点是SNP rs429358和rs7412。由此，利用根 据本发明实施例，可W有效地确定核酸样本中在两个预定位点SNP rs429358和rs7412是否 具有已知突变，从而可W有效地确定ApoE等位基因分型。
[0105] 根据本发明的一个实施例，所述第一引物的近3'端包含与rs429358的已知突变对 应的碱基，所述第二引物的近3'端包含与rs7412的已知突变对应的碱基。由此，利用根据本 发明实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法对核酸样本进行检 巧。，在PCR反应时引物可W与模板按照碱基配对原则选择性结合，从而可W特异地扩增出 ApoE的不同等位基因，并进一步可W有效地确定ApoE等位基因的类型。
[0106] 由此，利用根据本发明实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变 的方法对核酸样本进行检测，在PCR反应过程中，引物可W与模板按照碱基配对原则选择性 结合，从而可W特异地扩增出ApoE的不同等位基因，并进一步可W有效地确定ApoE等位基 因的类型。
[0107] 由此，利用根据本发明实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变 的方法对核酸样本进行检测，通过检测各基因型对应的扩增体系中有无巧光信号，即可判 断待测样品中是否含有该亚型的ApoE基因。
[0108] 本发明的有益效果：
[0109] 根据本发明的实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法 可W实现下列优点至少之一：
[0110] 1、根据本发明的实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方 法，该方法操作简便，仅需PCR扩增和巧光检测两个步骤，减少了实验步骤，避免交叉污染；
[0111] 2、根据本发明的实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方 法，该方法容易实现自动化操作，可W大大减小手工操作过程中的人为误差，使得到的结果 更加准确；
[0112] 3、根据本发明的实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方 法，该方法快速省时，完成整个检测的时间不到1.5小时，耗时少于现有的方法；
[0113] 4、根据本发明的实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方 法，该方法的成本较低，仅需一个巧光探针和常规PCR体系即可；
[0114] 5、根据本发明的实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方 法，该方法的检测结果直观，根据实验结果可W直接读出待测样本的ApoE基因型，无需繁琐 的分析过程。
[0115] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变 得明显，或通过本发明的实践了解到。
【附图说明】
[0116] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得 明显和容易理解，其中：
[0117] 图1是根据本发明一个实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变 的方法的不同引物对ApoE不同等位基因特异性扩增原理示意图，在该图中，1表示含SNP rs42358和rs7412的ApoE基因 DNA片段示意图；
[0118] 图2是根据本发明一个实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变 的方法的ApoE基因 PCR扩增体系示意图，在该图中，1表示ApoE基因 DNA模板反义链，2表示正 向扩增引物，3表示偶联有巧光基团（F)和泽灭基团（Q)的DNA分子探针，4表示ApoE基因 DNA 模板正义链，5表示反向扩增引物，6表示DNA聚合酶；
[0119] 图3是根据本发明一个实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变 的方法的巧光探针工作原理示意图，在该图中，1表示ApoE基因 DNA模板反义链，2表示正向 扩增引物，3表示巧光基团（F)脱离的DNA分子探针，4表示ApoE基因 DNA模板正义链，5表示反 向扩增引物，6表示DNA聚合酶；
[0120] 图4是根据本发明一个实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变 的方法的实例样品检测巧光信号读值的柱型分析图。
[0121] 图5ε2检测试剂中加入浓度为2400拷贝/μ1阳性质粒，重复检测20次，20个可检出 结果，检出率为100%。画阴性结果阳性结果，ε2阳性质粒，浓度为2400拷贝/μ1。
[0122] 图6ε2检测试剂中加入浓度为240拷贝/μ1阳性质粒，重复检测20次，20个可检出结 果，检出率为100%。画阴性结果阳性结果，。阳性质粒，浓度为240拷贝/μ1。
[0123] 图7ε2检测试剂中加入浓度为24拷贝/μ1阳性质粒，重复检测20次，16个可检出结 果，检出率为80%。圓阴性结果阳性结果，ε2阳性质粒，浓度为24拷贝/μ1。
[0124] 图8ε3检测试剂中加入浓度为2400拷贝/μ1阳性质粒，重复检测20次，20个可检出 结果，检出率为100%。圓阴性结果阳性结果，ε3阳性质粒，浓度为2400拷贝/μ1。
[0125] 图9ε3检测试剂中加入浓度为240拷贝/μ1阳性质粒，重复检测20次，20个可检出结 果，检出率为100%。画阴性结果阳性结果，ε3阳性质粒，浓度为240拷贝/μ1。
[0126] 图10ε3检测试剂中加入浓度为24拷贝/μ1阳性质粒，重复检测20次，18个可检出结 果，检出率为90%。圍阴性结果阳性结果，ε3阳性质粒，浓度为24拷贝/μ1。
[0127] 图11 ε4检测试剂中加入浓度为2400拷贝/μ1阳性质粒，重复检测20次，20个可检出 结果，检出率为100%。圓阴性结果阳性结果，ε4阳性质粒，浓度为2400拷贝/μ1。
[0128] 图12ε4检测试剂中加入浓度为240拷贝/μ1阳性质粒，重复检测20次，20个可检出 结果，检出率为100%。麵阴性结果阳性结果，ε4阳性质粒，浓度为240拷贝/μ1。
[0129] 图13ε4检测试剂中加入浓度为24拷贝/μ1阳性质粒，重复检测20次，14个可检出结 果，检出率为70%。;誦阴性结果阳性结果，ε4阳性质粒，浓度为24拷贝/μ1。
[0130] 图14 ΑΡ0Εε2基因检测试剂对阳性质控品的扩增效果。·ε2阳性质控品圍ε3阳性 质巧品 ε4阳性质巧品。
[0131] 图15 ΑΡΟΕε3基因检测试剂对阳性质控品的扩增效果，结果如图15所示。 ε2阳性 质巧品圍ε 3阳性质巧品 ε4阳性质巧品。
[0132] 图16 ΑΡ0Εε4基因检测试剂对阳性质控品的扩增效果，结果如图16所示。·ε2阳性 质巧品圓ε 3阳性质巧品 ε4阳性质巧品。
【具体实施方式】
[0133] W下结合具体实施例，对本发明作进步说明。应理解，W下实施例仅用于说明本发 明而非用于限定本发明的范围。
[0134] 在本发明的一个方面，本发明提出了一种确定核酸样本的两个预定位点是否具有 已知突变的方法。根据本发明的实施例，确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变 的方法可W包括W下步骤：
[0135] S100:利用第一引物和第二引物对核酸样本进行PCR扩增，并且在PCR扩增体系中 加入核酸探针
[0136] 在该步骤中，针对核酸样本的两个预定位点之一的核酸序列设计一条PCR引物:第 一引物，针对核酸样本的两个预定位点另一个预定位点的核酸序列设计一条PCR引物:第二 引物，并且加入核酸探针，然后对核酸样本进行PCR扩增。由此，获得PCR扩增样本，W便进一 步对其进行巧光检测。
[0137] 发明人发现，在PCR扩增时，如果第一引物的近3'端包含与核酸样本的两个预定位 点之一的已知突变对应的碱基，第二引物的近3'端包含与核酸样本的另一个预定位点的已 知突变对应的碱基，W及第一引物和第二引物之一作为正向引物，第一引物和所述第二引 物的另一个作为反向引物，则在PCR扩增时引物可W与模板按照碱基配对原则选择性结合， PCR扩增可W按照预定方向进行有效扩增，并且能够特异地扩增出不同等位基因。
[013引根据本发明的实施例，第一引物的3'端碱基为与rs429358的已知突变对应的碱 基，第二引物的3'端碱基为与rs7412的已知突变对应的碱基。根据本发明的实施例，第一引 物作为正向引物，第二引物作为反向引物。根据本发明的实施例，
[0139] 其中，所述第一引物包括：
[0140] 5'-CGGACATGGAGGACGTGT-3'
[0141] 5 '-GCGGACATGGAGGACGAGT-3 '
[0142] 5，-CGCGGACATGGAGGACGTTT-3，
[0143] 5，-CGGACATGGAGGACGAGC-3，
[0144] 5'-GCGGACATGGAGGACGTGC-3'
[0145] 5 '-CGCGGACATGGAGGACGTTC-3 '，
[0146] 所述第二引物包括：
[0147] 5'-TGGTACACTGCCAGGTA-3'
[0148] 5'-CTGGTACACTGCCAGTCA-3'
[0149] 5'-CCTGGTACACTGCCAGGCA-3'
[01加 ]5'-TGGTACACTGCCAGGCG-3'
[0151] 5 '-CTGGTACACTGCCAGGTG-3 '
[0152] 5 '-CCTGGTACACTGCCAGTCG-3 '。
[0153] 由此，PCR扩增时引物可W与模板按照碱基配对原则选择性结合，PCR扩增可W按 照预定5'到3'方向进行有效扩增，并且能够特异地扩增出不同等位基因。
[0154] 根据本发明的具体实施例，针对SNP rs429358为T或C的核酸序列分别设计一条 PCR正向引物下称为P112T或P112C)，针对SNP rs7412为T或C的核酸序列分别设计一条 PCR反向引物m下称为P158T或P158C)。根据ApoE基因型的区别可得知，ApoE不同基因型 SNP rs429358和rs7412之间的核酸序列可由如下引物对在PCR反应中特异扩增：引物P112T 和P158T能够特异扩增ε2型基因，引物P112T和P158C能够特异地扩增ε3型基因，W及引物 P112C和P158C能够特异地扩增ε4型基因。由此，PCR能够特异地扩增出不同等位基因，从而 可W有效地确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变，进一步可W有效地确定核酸 样本中ApoE等位基因的类型。
[0155] 在该步骤中，针对核酸样本的两个预定位点之间的核酸序列设计一段具有特异性 的核酸巧光探针，核酸探针对应两个预定位点之间至少一部分对应的核酸序列。
[0156] 发明人发现，如果核酸探针具有：发光基团，发光基团形成于所述核酸探针的5' 端，调苄基团，调苄基团形成于所述核酸探针的3'端，并且所述调苄基团可W调节所述发光 基团的发光，则当含有核酸探针对应核酸序列被PCR扩增时，探针能够特异结合到扩增模板 上，此时核酸聚合酶的外切酶活性能够切下探针5'端基团，使发光基团和调苄基团分离，从 而发出可检测的信号。
[0157] 根据本发明的具体实施例，核酸探针的发光基团为巧光基团，优选巧光基团为 FAM。根据本发明的实施例，核酸探针的调苄基团为巧光基团，优选调苄基团为B册1。根据本 发明的实施例，核酸探针的长度不受特别限制，例如，核酸探针的长度可W为20个核巧酸。 根据本发明的具体实施例，针对SNP rs429358和rs7412之间的核酸序列设计一段具有特异 性的核酸巧光探针。根据本发明的一个实施例，核酸探针的序列为5 'FAM- CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-BHQ1 3 '。由此，当检测核酸样本的ApoE基因型时，仅需在PCR扩增 体系中加入按上述方法设计的核酸巧光探针，利用。Α3/ε4基因型各自对应的不同引物分 另化CR扩增待巧阳ΝΑ模板。PCR反应结束后，检测各反应孔的扩增情况，即可判断待测核酸样 本中的ApoE基因。
[0158] 根据本发明的实施例，核酸样本的类型及来源并不受特别限制，例如，可W是人基 因组DNA的至少一部分，可W来源于任何人体组织或细胞、重组核酸或转基因生物组织细 胞。由此，利用根据本发明实施例的方法，可W有效地确定核酸样本的两个预定位点是否具 有已知突变，进一步可W有效地确定ApoE的等位基因分型，对于阿尔茨海默症和屯、脑血管 疾病的预防W及早期诊断具有非常重要的意义。
[0159] 在本发明中所使用的术语"核酸样本"的含义是指在任何设及人基因组DNA的至少 一部分，检测的核酸样本可W来源于任何人体组织或细胞、重组核酸或转基因生物组织细 胞。在本发明中，除非特别说明，"第一与、第二"仅是为了便于描述本发明，不能理解为对本 发明的限制。在本发明中，除非特别说明，"近3'端"指的是，距离3'末端的碱基为预定范围 W内的碱基，例如距离10个，9个，8个，7个，6个，5个，4个，3个，2个，1个或者0个(即3'末端）。
[0160] S200:检测反应体系的发光，W便确定核酸样本的预定位点是否存在已知突变
[0161 ] 在该步骤中，对步骤S100中所得到的PCR扩增样本进行巧光检测，在巧光检测时， 根据PCR扩增体系中有无巧光信号即可定性判断待测核酸样本中是否具有该PCR扩增体系 引物对所对应的ApoE等位基因分型。由此，可W确定核酸样本的预定位点是否存在已知突 变，并进一步可W有效地确定ApoE等位基因的类型。
[0162] 根据本发明的具体实施例，对人体基因组DNA的PCR扩增样本进行巧光检测，如果 仅在ε2扩增体系中检测到巧光信号，则该样品来源的待测人ApoE基因型为ε2/ε2;同理如果 仅在ε3(或ε4)扩增体系中检测到巧光信号，则该样品来源的待测人ApoE基因型为ε3/ε3(或 ε4/ε4);如果同时在ε2和ε3扩增体系中检测到巧光信号，则该样品来源的待测人ApoE基因 型为。A3;同理如果同时在ε2和ε4扩增体系中检测到巧光信号，则该样品来源的待测人 ApoE基因型为ε2/ε4;同理如果同时在ε2和ε4(或ε3和ε4)扩增体系中检测到巧光信号，则该 样本来源的待测人ApoE基因型为ε2/ε4(或ε3/ε4)。由此，可W有效地确定核酸样本的两个 预定位点是否具有已知突变，进一步可W有效地确定ApoE的等位基因分型，对于阿尔茨海 默症和屯、脑血管疾病的预防、早期诊断W及疾病预后具有非常重要的意义。
[0163] 根据本发明的实施例，PCR扩增及巧光检测的手段并不受特别限制，可W借助任何 已知的方法与设备来进行PCR扩增及巧光检测。例如根据本发明的具体实施例，利用美国 Applied Biosystems公司的TSOCFast Real-Time PCR system和Roche公司的Li曲Cycler 480，可W将PCR热循环、巧光检测及各种应用分析软件结合在一起，可W动态观察PCR每一 循环各反应管中PCR扩增产物逐渐增加的情况，PCR实验结束后可W马上得到结果，无需凝 胶电泳分析，无需纯化PCR产物，具有时间省、灵敏度高、准确性好等优点，再例如，相关技术 人员可W根据具体实际需要的不同，对引物W及PCR溫度等进行相应的调整，在此不再寶 述，运些均在本发明的权利保护范围之内。
[0164] 在本发明的又一个方面，本发明提出了一种确定核酸样本的两个预定位点是否具 有已知突变的试剂盒。根据本发明的具体实施例，该试剂盒可W应用于前面所述的确定核 酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法。由此，利用根据本发明实施例的确定核 酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的试剂盒对核酸样本进行检测，可W有效地确定 核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变，并进一步可W有效地确定ApoE的等位基因分 型。另外，前面针对确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法所描述的特征 和优点，也当然地适用该试剂盒，不再寶述
[0165] 在本发明的又一个方面，本发明提出了一组确定核酸样本的两个预定位点是否具 有已知突变的PCR引物。根据本发明的具体实施例，该引物可W应用于前面所述的确定核酸 样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法W及试剂盒。由此，PCR扩增过程中引物可W 与模板按照碱基配对原则选择性结合，PCR扩增可W按照预定方向进行有效扩增，并且能够 特异地扩增出不同等位基因。另外，前面针对确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知 突变的方法及试剂盒所用引物的描述的特征和优点，也当然地适用该PCR引物，不再寶述。
[0166] 本法明的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法、试剂盒及引物 可W应用在阿尔茨海默症W及屯、脑血管等疾病的预防W及早期诊断方面，相关技术人员当 然也可W将其扩大至其它其应用领域，在此不予寶述，运些均在本发明的权利保护范围之 内。
[0167]下面通过具体的实施例，对本发明进行说明，需要说明的是运些实施例仅仅是为 了说明目的，而不能W任何方式解释成对本发明的限制。另外，在下列实施例中如果没有特 别说明，则所采用的设备和材料均为市售可得的。
[016引一般方法；
[0169] 1材料与试剂：
[0170] 1)DNA 引物P112T: 5 ' -GCGGACATGGAGGACGTGT-3 '，Tm = 59.5 °C，GC含量=63.2 %， 5 . 6nM/0D/管，加无菌去离子水55 . 6μ1配制成100μΜ反应液，于4°C储藏；5'- CGGACATGGAGGACGTGT-3 '，Tm = 57.2 °C，GC含量=61.1 %，5.9nM/0D/管，加无菌去离子水 58.9μ1配制成100μΜ反应液，于4°C储藏。引物均合成于英潍捷基(上海）贸易有限公司，纯化 方式为:PAGE纯化。
[0171] 2)0麻引物口112(：:5'-〔664〔4了664664〔6了6(：-3'，时1 = 59.5。(：，6(：含量=66.7%， 5.化M/0D/管，加无菌去离子水59μ1配制成lOOiiM反应液，于4°C储藏。引物均合成于上海博 尚生物技术有限公司，纯化方式为:PAGE纯化。
[0172] 3)DNA 引物P158T: 5 ' -CCTGGTACACTGCCAGGCA-3 '，Tm = 59.5 °C，GC含量=63.2 %， 5.7nM/0D/管，加无菌去离子水57.2μ1配制成100μΜ反应液，于4°C储藏。引物均合成于上海 博尚生物技术有限公司，纯化方式为:PAGE纯化。
[0173] 4)0麻引物口158(：:5'-(：了66了4〔4(：了6此466〔6-3'，时1 = 59.5。(：，6(：含量=66.7%， 6nM/0D/管，加无菌去离子水60μ1配制成lOOiiM反应液，于4°C储藏。引物均合成于上海博尚 生物技术有限公司，纯化方式为:PAGE纯化。
[0174] 5)巧光DNA分子探针：5'FAM-CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-B册13'，Tm=65°C，GC含量= 70 %，5. InM/OD/管，加无菌去离子水51μ1配制成100μΜ反应液，于4°C避光储藏。巧光DNA分 子探针合成于英潍捷基(上海)贸易有限公司，纯化方式为:HPLC纯化。
[01巧]6)PCR预混液：购于美国Applied Biosystems公司的TaqMan Genotyping Master Mix(包括DNA聚合酶，dNTPs，ROX参比巧光），ROX参比巧光在PCR反应中不会加入扩增，它作 为巧光内参能够矫正在PCR反应中由于浓度和体积改变引起的巧光信号变化。
[0176] 7)无菌去离子水:去离子水取自英国化GA纯水仪(型号purelab 3000)，并经高压 蒸汽灭菌后所得。
[0177] 8)1.5ml离屯、管:购于美国Axygen公司。
[0178] 9)PCR板：MicroAmp⑥Optical 96-Well Reaction Plate购于美国Applied Biosystems 公司。
[0179] 10)PCR封板膜:Mi.C.r〇Am|>⑥96-Well Optical A化esive Film购于美国Applied Biosystems 公司。
[0180] 11)-次性医用无菌注射器:一次性医用无菌注射器(5ml规格)购于河南新乡市宇 安医用卫材有限公司。
[0181] 12)人血液基因组DNA提取相关试剂：
[0182] 曰、红细胞裂解液:称取3.735g氯化锭、Ξ径甲基氨基甲烧(Tris)1.3g加水溶解并 稀释至500ml，0.22m滤膜(购于美国Millipore公司）过滤除菌，于4°C保存；
[0183] b、Nuclei Lysis Solution(购于美国Promega公司）；
[0184] c、Precipitation Solution(购于美国Promega公司）。
[0185] 13) ε 2/ ε 2DNA已知样本:从ε2/ε2基因组DM中PCR扩增并测序验证的DM样品。
[0186] 14) ε 3/ ε 3DNA已知样本:从ε3/ε3基因组DM中PCR扩增并测序验证的DM样品。
[0187] 15) ε 4/ ε 4DNA已知样本:从ε 4/ ε 4基因组DNA中PCR扩增并测序验证的DNA样品。
[018引 16) ε 2/ ε 3DNA已知样本:从ε2/ε3基因组DNA中PCR扩增并测序验证的DNA样品。
[0189] 17) ε 2/ ε 4DNA已知样本:从ε 2/ ε 4基因组DNA中PCR扩增并测序验证的DNA样品。
[0190] 16) ε 3/ ε 4DNA已知样本:从ε 3/ ε 4基因组DNA中PCR扩增并测序验证的DNA样品。
[0191] 2仪器与设备：
[0192] 1)移液器:微量移液器(1化1，20μ1，100μΙ，100化1)购于德国化pendorf公司。
[0193] 2)离屯、机:小型高速离屯、机(型号:5424)，购于德国化pendorf公司。
[0194] 3)离屯、机：Universal 32R型控溫高速离屯、机，购于德国Hettich zentri化gen公 司。
[01M] 4)满旋混合器:购于江苏海口其林贝尔仪器制造有限公司。
[0196] 5)全波长扫描式多功能读数仪:The;rmo Scientific Varioskan Flash全波长扫 描式多功能读数仪，购于化ermo Scientific公司。
[0197] 6)Real-Time PCR仪器：7500Fast Real-Time PCR system,购于美国Applied Biosystems公司；LightCycler 480,购于Roche公司。
[019引 7 )分析软件：7500sof tware V2.0.6，购于美国 Appl ied Biosystems公司； Lighixycler 480Software，购于Roche公司。
[0199]在下列实施例中（详细见下面的实施例1-3)，确定核酸样本的两个预定位点是否 具有已知突变的方法的步骤如下：
[0200] 1引物设计：
[0201] ApoE基因的DNA序列由美国国家生物科技信息中屯、（NCBI)网站提供，根据包含 ApoE基因多态性位点SNP rs429358和SNP rs7412的DNA序列信息，对引物进行如下设计：
[0202] 1)针对SNP rs429358位点核酸形式为T的正向PCR扩增引物(P112T)，其DNA序列 为：5 '-GCGGACATGGAGGACGTGT-3 ' 和5 '-CGGACATGGAGGACGTGT-3 '；
[0203] 2)针对SNP rs429358位点核酸形式为C的正向PCR扩增引物(P112C)，其DNA序列 为：5 '-CGGACATGGAGGACGTGC-3 '；
[0204] 3)针对SNP rs7412位点核酸形式为T的反向PCR扩增引物(P158T)，其DNA序列为： 5'-CCTGGTACACTGCCAGGCA-3'；
[0205] 4)针对SNP rs7412位点核酸形式为C的反向PCR扩增引物(P158C)，其DM序列为： 5 '-CTGGTACACTGCCAGGCG-3 '。
[0206] 2巧光DNA分子探针设计：
[0207] 根据美国国家生物科技信息中屯、(NCBI)网站提供的ApoE基因 DNA序列信息，该基 因 SNP rs429358位点与SNP rs7412位点之间的DNA序列为： t邑C邑邑CC邑cct邑邑t邑C曰邑t曰CC邑C邑邑C邑曰邑邑t邑C曰邑邑CC曰t邑etc邑邑CC曰邑曰邑C曰CC邑曰邑邑曰邑ct邑C邑邑邑t邑C邑cct cgcctcccacctgcgcaagctgcgtaagcggctcctccgcgatgccgatgacctgcagaagcgc,选取该序列中 的一段作为探针的互补核酸序列部分，该序列为5 ' -CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-3 '。选用巧光 探针，选取FAM巧光基团W及B册1泽灭基团，FAM巧光基团偶联在互补核酸序列的5 '端，B册！ 泽灭基团偶联在互补核酸序列的3 '端，巧光探针为：5 ' FAM-CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-BHQ1 3'。
[0208] W下部分W基因组DM样本为检测样品进行阐述：
[0209] 3操作流程
[0210] 2)基因组DNA提取：
[0別。曰、含有900μ1红细胞裂解液的1.5ml离屯、管中，上下颠倒5-6次。
[0212] b、室溫放置10分钟(期间颠倒2-3次），室溫条件下13000-16000g离屯、20秒。
[0213] C、吸去上清，剩下约10-20μ1于管底。
[0214] d、满旋振荡重悬白细胞，加入Nuclei Lysis Solution,吹吸5-6次，可选步骤加入 1.5μ1的RNA酶混匀，37 °C条件下放置15分钟。
[0215] e、加入lOOul Precipi1:ation Solution,满旋振荡10-20秒。
[0216] f、室溫条件下13000-16000g离屯、10分钟。
[0217] g、转移上清到新的1.5ml离屯、管，加入300ul异丙醇，上下轻轻颠倒直到有白色絮 状DNA出现。
[021引 h、室溫条件下13000-16000g离屯、1分钟。
[0219] i、吸去上清，加入70%乙醇，轻轻的上下颠倒几次洗涂DNA，室溫条件下13000- leooog离屯、1分钟。
[0220] j、轻轻吸去乙醇，将1.5ml离屯、管倒置在干净的吸水纸上10-15分钟。
[0221] k、加入lOOul无菌去离子水溶解DNA，65°C水浴1小时，也可W4°C过夜。
[0222] 1、利用全波长扫描式多功能读数仪中的DNA浓度测量程序测量所提DNA的浓度，取 一部分DNA溶液用无菌去离子水稀释至化g/ml，作为后续PCR检测模板，剩余DNA溶液存放于 2 ~8°C 或-2(TC。
[0223] 3)PCR反应体系配制：
[0224] 根据ApoE基因的Ξ个多态性，与Ξ种检测试剂（ε2试剂、ε3试剂和ε4试剂），分别用 于人群中存在6种不同4口〇6基因型62/62,63/63,64八4,62八3,62/64和63/64的检测。6种已 知ApoE基因型DNA已知样本（ε 2/ ε 2DNA已知样本、ε 3/ ε 3DNA已知样本、ε 4/ ε 4DNA已知样本、ε 2/ε 3DNA已知样本、ε 2/ε 4DNA已知样本和ε 3/ε 4DNA已知样本)作为对照
[02巧]其中。试剂包括：
[0。6]曰、对应ΑροΕε2等位基因型SNP位点rs429358SNP核酸形式的正向引物Ρ112Τ(该实 例中核酸序列为5 ' -GCGGACATGGAGGACGTGT-3 '）。
[0227] b、对应ΑροΕε2等位基因型SNP位点rs7412反向引物核酸形式的反向引物P158T(该 实例中核酸序列为5 ' -CCTGGTACACTGCCAGGCA-3 '）。
[022引 C、巧光探针
[0229] (该实例中探针形式为5'FAM-CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-B册13'）。
[0230] d、PCR预混液TaqMan Genotyping Master Mix。
[0231] 其各成分具体剂量为： 化qMan Geiiotyping Master Mix 4.85μ1 ε2 正向引物 pll2T (100μΜ) 0.05μ1 「02321 ε2 正向引物 ρ158Τ (100μΜ) 0.05μ1 癸光探针（100μΜ) 0.05μ1
[0233] 其中ε3试剂包括：
[0234] a、对应ΑροΕε3等位基因型SNP位点rs429358SNP核酸形式的正向引物ρ112Τ(该实 例中核酸序列为5 ' -CGGACATGGAGGACGTGT-3 '）。
[0235] b、对应ΑροΕε3等位基因型SNP位点rs7412反向引物核酸形式的反向引物P158C(该 实例中核酸序列为5 ' -CTGGTACACTGCCAGGCG-3 '）。
[0236] C、巧光探针
[0237] (该实例中探针形式为5'FAM-CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-B册13'）。
[02；38] cUPCR预混液TaqMan Genotyping Master Mix。
[0239] 其各成分具体剂量为： TaqMan Genotyping Master Mix 4.85μΙ ε3 正向引物 ρ112Τ (100μΜ) 0.05μ1
[0240] ε3 正向引物 pl58C ( 100μΜ) 0.05μ1 义化探针（100μΜ) 0 ()5μ1
[0241] 其中e4试剂包括：
[0242] a、对应ΑροΕε4等位基因型SNP位点rs429358SNP核酸形式的正向引物pll2C(该实 例中核酸序列为5 ' -CGGACATGGAGGACGTGC-3 '）。
[0243] b、对应ApoE ε 4等位基因型SNP位点rs7412反向引物核酸形式的反向引物P158C (该 实例中核酸序列为5 ' -CTGGTACACTGCCAGGCG-3 '）。
[0244] C、巧光探针
[0245] (该实例中探针形式为5'FAM-CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-B册13'）。
[0246] d、PCR预混液TaqMan Genotyping Master Mix。
[0247] 其各成分具体剂量为： 化qMan G州otyping Master Mix 4.85μΙ ε4 正向引物 pll2C (100μΜ) 0.05μ1 W2483 ε4 ιΚ|!\?引物 pl58C (100μΜ) 0.05μ1 巧化採针（?ΟΟμΜ) 0.05μ1
[0249] 使用ΑροΕ基因分型检测试剂需要10μ1反应体系就可W充分检测到信号。
[0250] ε2基因检测的PCR反应体系为：
[0巧1]。试剂： 5μ1
[0 巧2]待测 DNA 样品（2ngAU): 5μ1
[0253] ε2阳性对照检测体系1:
[0巧4]。试剂： 5μ1
[0 巧 5] e2A2DNA 已知样本（2pgAU): 5μ1
[0256] ε2阳性对照检测体系2:
[0巧7]。试剂： 5μ1
[0258] e2A3DNA 已知样本（2pg/ul): 5μ1
[0259] ε2阳性对照检测体系3:
[0260] ε2 试剂： 5μ1 惦61] e2A4DNA 已知样本（2pg/ul): 5μ1
[0262] ε2阴性对照检测体系1:
[0%3] ε2 试剂： 5μ1
[0264] e3A3DNA 已知样本（2pg/ul): 5μ1
[02化]ε2阴性对照检测体系2:
[0%6] ε2 试剂： 5μ1
[0%7] e4A4DNA 已知样本（2pg/ul): 5μ1
[0%引ε2阴性对照检测体系3:
[0269] ε2 试剂： 5μ1
[0270] e3A4DNA 已知样本（2pg/ul): 5μ1
[0271] ε3基因检测的PCR反应体系为：
[0272] ε3 试剂： 5μ1
[0273] 待测 DM 样品（2ngAU): 5μ1
[0274] ε3阳性对照检测体系1:
[0275] ε3 试剂： 5μ1
[0276] e3A3DNA 已知样本（2pg/ul): 5μ1
[0277] ε3阳性对照检测体系2:
[027引 ε3 试剂： 5μ1
[0279] e2A3DNA 已知样本（2pg/ul): 5μ1
[0280] 。阳性对照检测体系3:
[0281] ε3 试剂： 5μ1
[0282] e3A4DNA 已知样本（2pg/ul): 5μ1
[0283] 。阴性对照检测体系1:
[0284] ε3 试剂： 5μ1
[0285] e2A2DNA 已知样本（2pg/ul): 5μ1
[0286] ε3阴性对照检测体系2:
[0287] ε3 试剂： 5μ1
[028引 e4A4DNA 已知样本（2pg/ul): 5μ1
[0289] ε3阴性对照检测体系3:
[0巧0]。试剂： 5μ1
[0巧 1] e2A4DNA 已知样本（2pg/ul): 5μ1
[0巧2] ε4基因检测的PCR反应体系为：
[0巧3] e4 试剂： 5μ1
[0294]待测 DM 样品（2ngAU): 5μ1
[02巧]ε4阳性对照检测体系1:
[0 巧 6] e4 试剂： 5μ1
[0 巧 7] e4A4DNA 已知样本（2pg/ul): 5μ1
[029引ε4阳性对照检测体系2:
[0 巧9] e4 试剂： 5μ1
[0300] e2A4DNA 已知样本（2pg/ul): 5μ1
[0301] ε4阳性对照检测体系3:
[0302] ε4 试剂： 5μ1
[0303] e3A4DNA 已知样本（2pg/ul): 5μ1
[0304] ε4阴性对照检测体系1:
[0305] ε4 试剂： 5μ1
[0306] e2A2DNA 已知样本（2pg/ul): 5μ1
[0307] ε4阴性对照检测体系2:
[030引 ε4 试剂： 5μ1
[0309] e3A3DNA 已知样本（2pg/ul): 5μ1
[0310] ε4阴性对照检测体系3:
[0311] ε4 试剂： 5μ1
[0312] e2A3DNA 已知样本（2pg/ul): 5μ1
[0313] 4)PCR扩增反应：
[0314] 将待测样品即人血液提取的基因组DNA( 2ngAil)与已知ApoE基因型的DNA已知样 品分别加入ε2，ε3和ε4基因检测的10μ1 PCR反应体系中。用灭菌的去离子水作为整个PCR体 系的阴性对照。在PC財反中配制好所有PCR反应体系后，用PCR封板膜封闭好PC財反，残留在 PC財反孔壁上液体用化iversal 32R型控溫高速离屯、机离屯、到管底并排除气泡。然后，将该 PCR板放入750(Fast Rea^Time PCR system仪器中，打开7500software V2.0.6软件，选择 软件中的Genotyping模块，在Plate setup中设置对应放入PCR板上每孔的检测内容。然后 在Run method中设置PCR反应程序及反应体系，运些项目设置完毕后，便可运行程序，该程 序默认PCR反应之前先在60°C条件下预读取本底巧光强度值再进行PCR扩增W消除背景巧 光值。待PCR反应完成之后，仪器可自动在60°C条件下收集巧光数据。表1为该实例PCR反应 过程的标准热循环程序。
[031引表1 PCR反应程序
[0316]
[0317] 5)数据分析与结论：
[0318] 表2 Real-Time PCR仪读完巧光值之后导出巧光数值
[0319]
[0320] 表2是根据本发明一个实施例的确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变 的方法的实例样品检测巧光信号读值结果。
[0321] 在Real-Time PCR仪读完巧光值之后导出巧光数值，结果如表2所示。在ApoE基因 型为ε2/ε2的DNA已知样品中，ε2基因检测体系为阳性结果，其巧光值为2.23623729。63,64 基因检测体系为阴性结果，其巧光值分别为0.218611和0.51656318;在ApoE基因型为ε3/ε3 的DNA已知样品中，ε3基因检测体系为阳性结果，其巧光值为2.50921822。62,64基因检测体 系为阴性结果，其巧光值分别为0.1933465和0.40723515;在ApoE基因型为ε4/ε4的DNA已知 样品中，ε4基因检测体系为阳性结果，其巧光值为2.5952146Κε2，ε3基因检测体系为阴性 结果，其巧光值分别为0.17685843和0.22782183。作为阴性对照的无菌去离子水样品，在ε 2，ε3和ε4基因检测体系中，其巧光值分别为0.17888165,0.22742152和-0.0582402。运样， 在运一实例中最大的阴性结果巧光值为0.51656318,而所有阳性结果的巧光值均远大于最 大的阴性结果巧光值。在此定义W最大阴性结果巧光值的2倍数值作为巧光信号阳性和阴 性结果的分界值，该实例中运一分界值为1.03312636。
[0322] 根据表2中的巧光值可W作柱形图，柱形图如图5所示，在阳性与阴性结果分界值 处划一直线，可W直观的看出所有的阳性结果都在直线上方，而所有阴性结果都在直线下 方。该实例中待测DNA样品在ε2和ε3基因检测体系得到结果根据上述分析方法判断为阳性 结果，而在ε4基因检测体系得到结果根据上述分析方法判断为阴性结果。由此得知，该实例 中待测DNA样品的ApoE基因型为ε 2/ ε 3型。
[0323] 实施例1
[0324] 在实施例中，如图1所示，引物pi 12T仅与SNP rs429358为Τ的核酸序列匹配，引物 P112C仅与SNP rs429358为C的核酸序列匹配，引物Ρ158Τ仅与SNP rs7412为Τ的核酸序列匹 配，引物P158C仅与SNP rs7412为C的核酸序列匹配。由此，含引物对ρ112Τ/ρ158Τ的PCR体系 仅能扩增SNP rs429358为Τ同时SNP rs7412为Τ的ApoE等位基因（即ε2);含引物对ρ112Τ/ pl58C的PCR体系仅能扩增SNP rs429358为Τ同时SNP rs7412为C的ApoE等位基因（即ε3);含 引物对pll2C/pl58C的PCR体系仅能扩增SNP rs429358为C同时SNP rs7412为C的ApoE等位 基因（即ε4)。所W，利用上述Ξ种引物对，可W特异地扩增出ApoE的不同等位基因，并确定 DNA样品中人ApoE等位基因的类型。
[03巧]实施例2
[0326] 在实施例中，如图2所示，巧光基团（F)脱离的DNA分子探针3的两段分别偶联有巧 光基团和泽灭基团，此时由于泽灭基团能吸收巧光基团的激发能量，因此，体系中只能检测 到本底巧光信号。巧光基团（F)脱离的DNA分子探针3能与ApoE基因 DNA模板反义链1特异互 补匹配，且匹配序列位于正向扩增引物2和反向扩增引物5对应的DNA序列之间，当PCR扩展 反应开始后，正向扩增引物巧日巧光基团（F)脱离的DNA分子探针3将与ApoE基因 DNA模板反 义链1结合，反向扩增引物引尋与ApoE基因 DNA模板正义链4结合，在DNA聚合酶6的作用下开 始扩增模板DNA。
[0327] 实施例3
[032引在实施例中，如图3所示，DNA聚合酶6在PCR反应过程中从正向扩增引物2或反向扩 增引物5开始，WApoE基因 DNA模板反义链1或ApoE基因 DNA模板正义链4为模板，起始DNA的 延伸，当DNA聚合酶6在介导DNA延伸的过程中遇到结合在ApoE基因 DNA模板反义链1上的巧 光基团（F)脱离的DNA分子探针3，DNA聚合酶則尋利用其外切酶活性从巧光基团（F)脱离的 DNA分子探针3的5'端逐一切掉探针上的核巧酸，致使巧光基团从探针上脱离并与泽灭基团 分离，此时即能检测到巧光基团激发出的巧光信号，并由此确定检测样品含有该引物对所 对应的ApoE等位基因类型。
[0329] 发明人认为引物序列对于检测效果是有非常重要的影响的，引物序列的任何改变 都有可能造成检测效果的不可信。将正向引物或者反向引物的端点碱基进行改造，结果假 阳性几乎达到100 %。
[0330] 1、本发明的产品具有更高的灵敏度
[0331] 发明人把^种基因的阳性质粒用Tris-HCl缓冲液（10mM，pH8.0)进行稀释，得到 2400拷贝/μ1、240拷贝/μ1和24拷贝/μ1的，并对运些样本进行检测，95% (η>20)的阳性率 作为最低检测限的标准。
[0332] (1) ε2检测试剂Ξ种浓度的检测结果：
[0333] 图5ε2检测试剂中加入浓度为2400拷贝/μ1阳性质粒，重复检测20次，20个可检出 结果，检出率为100%。结果如图5所示:圓辆性结果阳性结果，ε2阳性质粒，浓度为2400拷 贝/μL
[0334] 图6ε2检测试剂中加入浓度为240拷贝/μ1阳性质粒，重复检测20次，20个可检出结 果，检出率为100%。结果如图6所示:画阴性结果阳性结果，ε2阳性质粒，浓度为240拷贝/ μΙο
[0335] 图7ε2检测试剂中加入浓度为24拷贝/μ1阳性质粒，重复检测20次，16个可检出结 果，检出率为80%。结果如图7所示阴性结果阳性结果，ε2阳性质粒，浓度为24拷贝/μ 1〇
[0336] (2) ε3检测试剂Ξ种浓度的检测结果：
[0337] 图8ε3检测试剂中加入浓度为2400拷贝/μ1阳性质粒，重复检测20次，20个可检出 结果，检出率为100%。结果如图8所示:圓阴性结果阳性结果，ε3阳性质粒，浓度为2400拷 贝/μL。
[0338] 图9ε3检测试剂中加入浓度为240拷贝/μ1阳性质粒，重复检测20次，20个可检出结 果，检出率为100%。结果如图9所示:圍阴性结果阳性结果，ε3阳性质粒，浓度为240拷贝/ μΙο
[0339] 图10ε3检测试剂中加入浓度为24拷贝/μ1阳性质粒，重复检测20次，18个可检出结 果，检出率为90%。结果如图10所示:圓阴性结果阳性结果，ε3阳性质粒，浓度为24拷贝/μ 1〇
[0340] (3) ε4检测试剂Ξ种浓度的检测结果：
[0%1 ]图11 ε4检测试剂中加入浓度为2400拷贝/μ1阳性质粒，重复检测20次，20个可检出 结果，检出率为100%。结果如图11所示:圓:阴性结果阳性结果，ε4阳性质粒，浓度为2400 拷贝/μL。
[0342] 图12ε4检测试剂中加入浓度为240拷贝/μ1阳性质粒，重复检测20次，20个可检出 结果，检出率为100%。结果如图12所示:圓阴性结果阳性结果，ε4阳性质粒，浓度为240拷 贝/μL。
[0343] 图13ε4检测试剂中加入浓度为24拷贝/μ1阳性质粒，重复检测20次，14个可检出结 果，检出率为70%。结果如图13所示阴性结果阳性结果，ε4阳性质粒，浓度为24拷贝/μ 1〇
[0344] 人类基因组约有30亿个碱基，1个细胞约为6pg的基因组，1个拷贝人类基因组DNA 约为化g，因此lOpg人类基因组DNA约有3个拷贝，lng的基因组DNA人类基因组DNA约有300个 拷贝。因此240个拷贝相当于0.8ng的人类基因组DNA，所W本试剂盒检测最低检出限为 0. Sng/μL，即4ng/反应。
[0345] 2、本发明的产品具有更高的特异性
[CX346] 我们选择考察了 1.5*106拷贝/反应、3*105拷贝/反应、6*104拷贝/反应、1.2*104 拷贝/反应、2.4*103拷贝/反应、4.8*102拷贝/反应、96拷贝/反应和19.2拷贝/反应，换算后 相当于基因组DNA含量为5000ng/反应、lOOOng/反应、200ng/反应、40ng/反应、8ng/反应、 1.6ng/反应、0.3化g/反应和0.064ng/反应，结果如图14所示。 ε2阳性质控品画ε3阳性质 巧品 ε4阳性质巧品。
[0347]图14 ΑΡ0Εε2基因检测试剂对阳性质控品的扩增效果。
[(Χ34引表3 ΑΡ0Εε2基因检测试剂对阳性质控品的扩增Ct值 [0349]

[0350] ~图15ΑΡ0Εε3基因检测试剂对阳性质控品的扩增效果，结果如图15所示。 ε2阳性I 质控品画。阳性质控品·ε4阳性质控品。
[0351] 表4 ΑΡ0Εε3基因检测试剂对阳性质控品的扩增Ct值
[0352]
[0353]
[0354] 图16ΑΡ0Εε4基因检测试剂对阳性质控品的扩增效果，结果如图16所示。 ε2阳性 质控品画。阳性质控品·ε4阳性质控品。
[0巧日]表5 ΑΡ0Εε4基因检测试剂对阳性质控品的扩增Ct值
[0356]____
惦57] 从图5-16和表3-5可W看出，ΑΡ0Εε2基因检测试剂对ε2阳性质控品浓度为1.5*10? 拷贝/反应、3*105拷贝/反应、6*104拷贝/反应、1.2*104拷贝/反应、2.4*10 3拷贝/反应、4.8* 1〇2拷贝/反应、96拷贝/反应时可W得到很好的扩增，但对ε3阳性质控品浓度为1.5*106拷 贝/反应、3*105拷贝/反应时出现了非特异的扩增;ΑΡ0Εε3扩增液对ε3阳性质控品浓度为 1.5*106拷贝/反应、3*105拷贝/反应、6*104拷贝/反应、1.2*10 4拷贝/反应、2.4*103拷贝/反 应、4.8*102拷贝/反应、96拷贝/反应时可W得到很好的扩增，但对ε4阳性质控品浓度为 1.5*106拷贝/反应时出现了非特异的扩增;ΑΡ0Εε4扩增液对ε4阳性质控品浓度为1.5*106拷 贝/反应、3*105拷贝/反应、6*10哦贝/反应、1.2*104拷贝/反应、2.4*10 3拷贝/反应、4.8*102拷贝/反应、96拷贝/反应时可W得到很好的扩增，但对ε3阳性质控品浓度为1.5*106拷贝/ 反应时出现了非特异的扩增。因此，表明ΑΡΟΕ基因检测试剂能够耐受总量为6*104拷贝/反 应的其它亚型的DNA，根据阳性质控品的大小，换算成基因组DNA的量为2(K)ng。
[0358] W上对本发明的【具体实施方式】进行了说明，但本发明并不W此为限，只要不脱离 本发明的宗旨，本发明还可W有各种变化。
【主权项】
1. 一种ApoE试剂盒，其特征在于，包括： 第一引物，所述第一引物的近3'端包含与所述两个预定位点之一已知突变对应的碱 基， 第二引物，所述第二引物的近3'端包含与所述两个预定位点另一个已知突变对应的碱 基， 核酸探针，所述核酸探针与两个预定位点之间至少一部分对应的核酸序列，并且所述 核酸探针具有： 发光基团，所述发光基团形成于所述核酸探针的5 '端， 调苄基团，所述调苄基团形成于所述核酸探针的3'端，并且所述调苄基团可以调节所 述发光基团的发光， 其中，所述预定位点是SNP rs429358和rs7412， 其中，所述述第一引物的近3'端包含与rs429358的已知突变对应的碱基，所述第二引 物的近3'端包含与rs7412的已知突变对应的碱基， 其中，所述第一引物的3'端碱基为与rs429358的已知突变对应的碱基，所述第二引物 的3'端碱基为与rs7412的已知突变对应的碱基， 其中，所述第一引物作为正向引物，所述第二引物作为反向引物， 其中，所述第一引物包括： 5，-CGGACATGGAGGACGTGT-3， 5，-GCGGACATGGAGGACGAGT-3， 5，-CGCGGACATGGAGGACGTTT-3， 5，-CGGACATGGAGGACGAGC-3， 5 '-GCGGACATGGAGGACGTGC-3 ' 5 '-CGCGGACATGGAGGACGTTC-3 '， 所述第二引物包括： 5 '-TGGTACACTGCCAGGTA-3 ' 5，-CTGGTACACTGCCAGTCA-3 ' 5 '-CCTGGTACACTGCCAGGCA-3 ' 5，-TGGTACACTGCCAGGCG-3 ' 5 '-CTGGTACACTGCCAGGTG-3 ' 5 '-CCTGGTACACTGCCAGTCG-3 '， 其中，所述核酸探针的长度为20个核苷酸。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述核酸探针的序列为：5'_ CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-3'。3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于:所述核酸探针的发光基团为荧光基团， 所述荧光基团为FAM，所述调苄基团为淬灭基团，所述淬灭基团为BHQ1。4. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒检测最低检出限为240个拷 贝/μL，根据换算为基因组DNA0.8ngAU，即4ng/反应； AP0E基因检测试剂能够耐受总量为6*104拷贝/反应的其它亚型的DNA，根据阳性质控品 的大小，换算成基因组DNA的量为200ng/反应。5. -种如权利要求1所述的ApoE试剂盒的引物，其特征在于，所述引物包括： 第一引物，所述第一引物的近3'端包含与所述两个预定位点之一已知突变对应的碱 基， 第二引物，所述第二引物的近3'端包含与所述两个预定位点另一个已知突变对应的碱 基， 所述第一引物的近3'端包含与rs429358的已知突变对应的碱基，所述第二引物的近3' 端包含与rs7412的已知突变对应的碱基， 所述第一引物的3'端碱基为与rs429358的已知突变对应的碱基，所述第二引物的3'端 碱基为与rs7412的已知突变对应的碱基， 所述第一引物作为正向引物，所述第二引物作为反向引物， 其中，所述第一引物包括： 5，-CGGACATGGAGGACGTGT-3， 5，-GCGGACATGGAGGACGAGT-3， 5，-CGCGGACATGGAGGACGTTT-3， 5，-CGGACATGGAGGACGAGC-3， 5 '-GCGGACATGGAGGACGTGC-3 ' 5 '-CGCGGACATGGAGGACGTTC-3 '， 所述第二引物包括： 5 '-TGGTACACTGCCAGGTA-3 ' 5，-CTGGTACACTGCCAGTCA-3 ' 5 '-CCTGGTACACTGCCAGGCA-3 ' 5，-TGGTACACTGCCAGGCG-3 ' 5 '-CTGGTACACTGCCAGGTG-3 ' 5 '-CCTGGTACACTGCCAGTCG-3 '，6. -种如权利要求1所述的ApoE试剂盒的用途，其特征在于，用于确定核酸样本的两 个预定位点是否具有已知突变。7. 根据权利要求6所述的用途，其特征在于:所述确定核酸样本的两个预定位点是否具 有已知突变的方法，包括以下步骤： a. 引物设计： b. 荧光DNA分子探针设计： c. PCR反应体系配制： d. PCR反应体系配制： 利用第一引物和第二引物对所述核酸样本进行PCR扩增，并且在所述PCR扩增体系中加 入核酸探针，所述核酸探针对应两个预定位点之间至少一部分的核酸序列；以及 e. 检测反应体系的发光， f. 数据分析与结论： 以便确定所述核酸样本的预定位点是否存在已知突变。8. 根据权利要求6所述的用途，其特征在于： 其中，所述第一引物的近3'端包含与所述两个预定位点之一已知突变对应的碱基， 所述第二引物的近3 '端包含与所述两个预定位点另一个已知突变对应的碱基， 所述第一引物和第二引物之一作为正向引物，所述第一引物和所述第二引物的另一个 作为反向引物， 所述核酸探针具有： 发光基团，所述发光基团形成于所述核酸探针的5 '端， 调苄基团，所述调苄基团形成于所述核酸探针的3'端，并且所述调苄基团可以调节所 述发光基团的发光， 其中，所述核酸样本来源于人体组织或细胞、重组核酸或转基因生物组织细胞， 其中，所述预定位点是SNP rs429358和rs7412， 其中，所述述第一引物的近3'端包含与rs429358的已知突变对应的碱基，所述第二引 物的近3'端包含与rs7412的已知突变对应的碱基， 其中，所述第一引物的3'端碱基为与rs429358的已知突变对应的碱基，所述第二引物 的3'端碱基为与rs7412的已知突变对应的碱基， 其中，所述第一引物作为正向引物，所述第二引物作为反向引物， 其中，所述第一引物包括： 5，-CGGACATGGAGGACGTGT-3， 5，-GCGGACATGGAGGACGAGT-3， 5，-CGCGGACATGGAGGACGTTT-3， 5，-CGGACATGGAGGACGAGC-3， 5 '-GCGGACATGGAGGACGTGC-3 ' 5 '-CGCGGACATGGAGGACGTTC-3 '， 所述第二引物包括： 5 '-TGGTACACTGCCAGGTA-3 ' 5，-CTGGTACACTGCCAGTCA-3 ' 5 '-CCTGGTACACTGCCAGGCA-3 ' 5，-TGGTACACTGCCAGGCG-3 ' 5 '-CTGGTACACTGCCAGGTG-3 ' 5 '-CCTGGTACACTGCCAGTCG-3 '。 其中，所述核酸探针的长度为20个核苷酸。9. 根据权利要求7所述的用途，其特征在于:所述核酸探针的序列为： 5 '-CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-3 '。10. 根据权利要求8所述的用途，其特征在于:所述核酸探针的发光基团为荧光基团，所 述荧光基团为FAM，所述调苄基团为淬灭基团，所述淬灭基团为BHQ1。
【文档编号】C12Q1/68GK106011298SQ201610629197
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年8月3日
【发明人】许华曦, 卜国军, 张含
【申请人】厦门人瑞生物医药科技有限公司