一种用于检测猪细小病毒的lamp引物组、试剂盒及检测方法
【专利摘要】一种用于检测猪细小病毒的LAMP引物组、试剂盒及检测方法，该LAMP引物组序列分别为引物F3：5’?ACGGAGGTAAAATTGGACA?3’；引物B3：5’?TCCCTTTAGCTTTTTTTTTAGC?3’；FIP：5’?GAGATGTAGTTGGTGAGTCTGTTTTTTTTTCTTCAGAGCAAAGCGTG?3’；引物BIP：5’?CAACCAGAGGTAAGAAGATCGCTTTTAAAAATATGTCTTGGAGCAGGT?3’。本发明还提供了含有上述引物组的检测试剂盒及检测方法，通过向LAMP反应产物中加入荧光染料后的颜色变化来判断被测样品是否含有PPV，实现了可视化，反应结果易判定，非常易于临床推广。
【专利说明】
-种用于检测猪细小病毒的LAMP引物组、试剂盒及检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于兽用生物制品领域，具体设及一种用于检测猪细小病毒的LAMP引物 组、试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 猪细小病毒(Porcine Parvoviru，PPV)，它是属于细小病毒科的细小病毒属。猪细 小病毒会引起猪的一种繁殖障碍性疾病，受到该病感染的母猪，特别是受到该病感染的初 产母猪会出现产死胎、崎形胎、木乃伊胎及病弱仔猪、偶有流产的特征，而母猪本身并无明 显症状。
[0003] 猪细小病毒病在世界各地分布广泛并且在大多数猪场流行，猪细小病毒可W通过 多种途径对猪感染，比如水源、食物、交配和胎盘等。猪细小病毒对热、消毒药和酸碱的抵抗 力均很强，pH适应范围很广。病毒对外界环境的抵抗力也很大，能在被污染的猪舍内生存数 月之久，容易造成长期连续传播。当被污染的圈舍按照常规消毒方法处理后，再放入易感染 猪时，仍有被病毒感染的可能。由于该病难W防治，给养猪业带来巨大损失和危害，因此，建 立一种快速、特异、灵敏并且适合在基层推广的检测方法就非常必要，将运种检测方法研制 成试剂盒进行推广使用更具有很强的实用价值。
[0004] 国内外猪细小病毒现有常用诊断技术主要包括：临床诊断、病原诊断、血清学诊 断、分子生物学诊断等。临床诊断主要依据流行病学、临床症状和尸体剖检来判断疾病种 类，难W做到确诊。病原分离是最经典和可靠的病原诊断方法，特异性高，可直接确诊，但病 毒分离所需时间较长，成本较高。
[0005] 血清学诊断技术主要包括:血清中和试验(Neu化alization test,NT)、凝集性试 验(Agglutination test,AT)、巧光抗体技术(Fluorescent-labelled abt;Lbody technic, FA)、酶联免疫吸附试验化LISA)、斑点金免疫渗滤法、胶体金免疫层析法(Colloidal gold immimochromatogra地y assay ,CGICA)等。应用最多的血清学方法主要是E：LISA，该方法具 有灵敏、特异性强、快速、简便等特点，常被用于大规模的血清学检查，且目前己经建立了检 测PPV的化ISA方法。但由于PPV已经在猪场广泛存在，所W，ELISA的检测结果不能作为判定 猪群发生猪细小病毒相关疾病的决定性依据。
[0006] 分子生物学诊断技术包括聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)、 反牵专录-聚合酉每链式反应（Reverse transcription polymerase chain reaction,RT- PCR)、实时巧光定量PCR(Real-time fluorescence 如anti化tive PCR，FQ-PCR)、实时巧光 定量RT-PCR(Rea]_-time fluorescence Quanti1:ative RT-PCR,RQ-RT-PCR)、环介导等溫扩 增化oop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术、依赖于核酸序列扩增 (Nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)技术、核酸探针技术、基因忍片检 测技术等。核酸探针技术特异性强，准确可靠，可用于不同毒株的分离和鉴定，但诊断费用 较高。基因忍片包括cDNA忍片、寡核巧酸忍片、基因组忍片等，主要目标是用于DNA序列的测 定、基因表达谱鉴定、基因突变体的检测分析，W及基因组的功能研究等。它们都是比较理 想的检测方法，但是也存在耗时费力、设备要求特殊等局限性。LAMP是2000年开发的一种新 颖的恒溫核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种用于检测猪细小病毒(PPV)的LAMP引物组、试剂盒及 检测方法，利用LAMP技术，实现猪细小病毒的可视化、快速检测。
[000引为达到上述目的，本发明的技术方案是：
[0009] -种用于检测猪细小病毒的LAMP引物组，其包括如下引物： 引物 F3: 5'-ACGGAGGTAAAATTGGACA-3'; 引物 B3; 5 '-TCCCTTTAGCTTTTTTTTTAGC-3 '; . 5 '-GAG ATGTAGTTGGTG AGTCTGTTTTTTTT
[0010] 引物的P:; TCTTCAGAGCA AAGCGTG-3 ' ； L 5 '-CA ACC AGAGGTA AGA AGATCGCTTTT A A 引物班P:; AAATATGTCTTGGAGCAGGT-3 '。
[0011]本发明所述用于检测猪细小病毒的LAMP引物组在制备猪细小病毒的LAMP检测试 剂盒中的应用。
[001^ 本发明所述包含上述LAM巧I物组的猪细小病毒的LAMP检现聯剂盒。
[OOU] 本发明所述LAMP检测试剂盒还包括LAMP反应体系：该LAMP反应体系包括:MgS〇4、 dNTP、buf f er缓冲液、引物FIP、引物BIP、引物F3、引物B3、甜菜碱、模板、Bst酶。
[0014] 优选的，所述25化LAMP反应体系中各成分的用量为：MgS〇4:2〇-30nmol，dNTP: 0. 5-1. Onmol，10 Xbuffer，引物FIP: 5-40pmol，引物BIP: 5-40pmol，引物F3:2.5-40pmol，引 物 B3:2.5-40pmo 1，甜菜碱：15-25μπιο 1，Bs t酶：6.4-9.6U。
[001引更优选的，所述25化LAMP反应体系中各成分的用量为：MgS04:20nmol，dNTP: 1. Onmol，10 X buffer，FIP: 5pmol，BIP: 5pmol，F3:20pmol，B3:20pmol，甜菜碱：25皿01，Bst 酶：9.抓。
[0016]本发明所述LAMP检测试剂盒还包括:显色剂、阳性对照、无模板对照。
[0017]优选的，所述显色剂为SY服Green I染料;所述阳性对照为PPV质粒。
[0018]本发明所述LAMP检测试剂盒的检测反应程序为：首先59-65Γ恒溫30-60min，再 80-85 °C 恒溫 3-5min。
[0019]优选的，所述lamp检测试剂盒的检测反应程序为：首先59°C恒溫45min，再80°C恒 溫3min。
[0020] -种检测猪细小病毒的LAMP检测方法，其包括如下步骤：
[0021] 1)提取猪细小病毒DNA作为反应模板；
[0022] 2)配制LAMP检测体系
[0023] LAMP检测体系包含如下成分，按总体积25化配制：1旨504:20-30醒〇1，(1卿？:0.5- 1. Onmol，10 X buff er，引物FIP: 5-40pmol，引物BIP: 5-40pmol，引物F3: 2.5-40pmol，引物 B3:2.5-40pmol，甜菜碱：15-25皿〇1，Bst酶:6.4-9.6U;还包括步骤1)提取的DNA模板；
[0024] 3) LAMP 反应
[00巧]LAMP反应程序为：首先59-65Γ恒溫30-60min，再80-85Γ恒溫3-5min;
[0026] 4)步骤3)LAMP反应结束后，向反应物中加入SYBR Green I染料，观察颜色变化:显 色为绿色的样品为阳性，含有猪细小病毒;显色为橘红色的样品为阴性，不含猪细小病毒。
[0027] 优选的，所述LAMP检测体系中各成分的用量为:MgS〇4:20nmol，dNTP: 1 .Onmol，10 Xbuffe;r，FIP:5pmol，BIP:5pmol，F3:20pmol，B3:20pmol，甜菜碱：25皿〇1，Bst酶：9.6U。
[002引优选的，所述LAMP反应程序为:首先59°C恒溫45min，再80°C恒溫3min。
[0029] 本发明利用LAMP技术建立针对猪细小病毒的检测方法，该方法具有多引物同时扩 增，并在两端形成了带有引物功能的环状结构，运种多引物结合和可自产生引物的原理使 其具有了灵敏度高、特异性强等特点，由于lamp反应操作步骤简单及反应产物中包含大量 核酸和焦憐酸儀的沉淀，巧光剂显色后可W用肉眼观察判定反应结果，适用于各种实验条 件下检测工作的使用。
[0030] 本发明根据LAMP的工作原理，WPPV的VP1基因为目标基因，在优化相关反应条件 的基础上，建立了适用于临床应用的用于检测猪细小病的LAMP方法，并将该方法研制成诊 断试剂盒进行推广应用，为猪细小病毒的防控提供必要的技术。
[0031] 本发明的有益效果：
[0032] 本发明根据猪细小病毒的VP1基因序列，设计合成4个引物，通过对LAMP条件的优 化，W及敏感性、特异性试验，建立猪细小病毒的LAMP检测方法，通过向LAMP反应产物中加 入巧光染料后的颜色变化来判断被测样品是否含有PPV，为猪细小病毒的现场快速诊断提 供了一种简便快速的方法，该方法具有反应条件简单、结果读判方便、敏感性高、特异性强、 快速等优点。
[0033] 本发明的优势还在于已经将运种LAMP检测方法研制成试剂盒，并进行推广应用。 该试剂盒特异性强，灵敏度高，检测限为1〇1拷贝。
[0034] 本发明所提供的猪细小病毒的LAMP快速检测试剂盒，操作简单，且直接通过产物 颜色变化进行判定，实现了可视化，使反应结果易判定，非常易于临床推广。
【附图说明】
[0035] 图1为本发明实施例2的LAMP检测的可视化结果。
[0036] 图2为本发明实施例4灵敏度试验的可视化结果。
[0037] 图3为本发明实施例5特异性试验的可视化结果。
【具体实施方式】
[0038] 下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但不作为对本发明的限制。
[0039 ] 实施例1检巧UPPV的LAMP引物组设计
[0040] PPV有Ξ种结构蛋白VPUVP2和VP3,其VP3是VP2水解后的产物，而VP2完全重叠于 VP1中。根据GenBank中的猪细小病毒(PPV)的VP1基因序列（如SEQ ID NO. 1所示），针对祀基 因的六个不同的区域，基于祀基因3'端的F3c、F2c和Flc区W及5'端的B1、B2和B3区共6个不 同的位点设计4种引物，具体序列如表1所示。
[0041] 表 1
[0042]
[0043] 实施例2PPV的LAMP检测方法的建立和验证，包括如下步骤：
[0044] 1)病毒DNA的提取
[0045] 参照EZgeneTM Blood Viral DNA/RNA Miniperp Kit(VR6511)试剂盒说明书，对 上海市农业科学院畜牧研究所李春华老师提供的含有PPV的猪血清样品进行DNA提取，将提 取的DNA放在4°C保存。
[0046] 2)LAMP反应体系的建立
[0047] 最终优化的反应体系如下：
[004引 LAMP反应体系（2化L)的配置为：d地20 5.扣L，浓度25mmol/L的MgS04 0.祉L，浓度 2.5mmol/L 的 IXdNTP 4.0yL，10Xbuffer 2.扣 L，浓度 lOpmol/yL 的 FIP 0.扣 L，浓度 10口11101/化的引物81?0.化^浓度10口11101/化的引物尸3 2.化^浓度10口11101/化的引物83 2. OyL，浓度如mol/化甜菜碱化L，模板化L，811/化的Bst酶1.化L。
[0049] 反应程序：59°C45min，80°C3min。
[0050] W阳性对照模板(步骤1)提取PPV DNA，即阳性质粒）、无模板对照分别进行LAMP反 应。反应结束后，向两个反应的LAMP产物里加入化L的SYBR Green I染料，观察颜色变化，显 色结果如图1所示。图1中显示：阳性质粒的反应产物颜色变为绿色，无模板对照（图1中阴性 质粒组)的反应产物不发生颜色变化，为橘红色。由此可见，本发明的LAMP反应结果易判定， 易于临床推广。
[0051] 实施例3PPV LAMP检测试剂盒的组装
[0052] 根据W上LAMP反应体系组装检测试剂盒，W方便使用。
[0053] 1)试剂盒的包装规格为200次/盒，试剂盒组成如表2所示：
[0054] 表 2
[ο化5]
[0化6]
[0057] 2)试剂盒运输及保存方法
[005引低溫运输，短期使用放至4°C避光保存，长期保存请置于-20°C或-80°C冰箱避光保 存。
[0059] 实施例4PPV LAMP检测试剂盒的使用
[0060] 1)样品DNA的提取
[0061 ]参照EZgeneTM Blood Viral DNA/RNA Miniperp Kit(VR6511)试剂盒说明书，提 取待测猪血清样品DNA作为模板。
[0062] 2)反应液的配置
[0063] 取表1中各成分进行配置，具体取d地2〇 5.5化，PPV预混合液12.3化，引物FIP 0.5 yL，引物BIP 0.扣L，引物F3 2.化L，引物B3 2.化L，模板化L加入反应小管中，混匀后在95°C 水浴锅中加热5min，放置冰上冰浴5min;然后加入1.化L Bst酶混合均匀。
[0064] 3)反应的进行
[0(?日]LAMP反应程序为:先59 Γ恒溫45min，再80 Γ恒溫3min;
[0066] 4)结果判定
[0067] LAMP反应结束后，向反应物中加入化L SYBR Green I染料，观察颜色变化:显色为 绿色的样品为阳性，含有猪细小病毒;显色为橘红色的样品为阴性，不含猪细小病毒。
[0068] 实施例5猪细小病毒LAMP检测试剂盒的灵敏度试验
[0069] 首先将实施例2步骤1)中所得病毒DNA通过转化将目的片段连接至T3Cloning Vector(T3克隆载体)上，参照博满生物柱离屯、式质粒小量快速抽提试剂盒说明书制备质 粒，并测其浓度，按照病毒学方法计算对应的拷贝数，-20°C保存备用。
[0070] 将提取到的质PPV粒制备9个样品：1:无模板对照，2:PPV质粒10叫考贝，3:PPV质粒 1〇1拷贝，4: PPV质粒1〇2拷贝，5: PPV质粒1〇3拷贝，6: PPV质粒1〇4拷贝，7: PPV质粒1〇5拷贝，8: PPV质粒ΙΟ6拷贝，9:PPV质粒ΙΟ7拷贝。使用实施例3组装的检测试剂盒并参照实施例4的使用 方法对上述9个样品进行3次重复性LAMP检测试验，具体结果参见图2,图2中竖向为同一样 品重复3次的显示结果，横向为不同样品的显示结果。
[0071] 由图2可知，样品1-2均为橘红色，样品3-9 (1〇1拷贝-107拷贝）均呈明显绿色，且随 着模板浓度的升高，绿色越来越深，最低DNA浓度为PPV质粒1〇1拷贝。
[0072] W上证明本发明所提供PPV的LAMP检测方法和试剂盒针对PPV模板的扩增具有很 高的效率，即建立的PPV的LAMP检测下限为10墙贝，符合日常检测要求。
[0073] 实施例6猪细小病毒LAMP检测试剂盒的特异性试验
[0074] 特异性实验测试材料设置7个样品分别为：1:无模板对照，02:PCV2病毒(猪圆环病 毒)样品，3:PRRSV病毒(猪蓝耳病病毒)样品，4:PRV病毒(猪伪狂犬病病毒)样品，5:CSFV病 毒(猪攝病毒)样品，6: PPV病毒样品，7: PPV质粒。将2-6号样品DNA提取方法同实施例4步骤 1)。
[0075] 用本发明的猪细小病毒LAMP检测试剂盒对供试的特异性实验测试7种材料样品 DNA进行LAMP检测，共Ξ次重复试验，具体结果参见图3,图3中竖向为同一样品重复3次的显 示结果，横向为不同样品的显示结果。
[0076] 由图3可知，本发明提供的PPV引物组(FIP、BIP、F3和B3)在非PPV病毒样品（样品1- 5)中颜色反应均为橘红色，而在所有供试PPV病毒样品（样品6-7)中颜色反应均为绿色，说 明本发明设计的PPV引物组特异于PPV病毒样品检测，本发明提供的LAMP检测方法和试剂盒 对PPV病毒具有良好的特异性。
[0077] 实施例6PPV LAMP检测试剂盒的临床应用试验
[0078] 使用本发明提供的LAMP检测试剂盒检测1100个血清样品是否感染PPV。结果检出 其中有320个临床样品感染ΡΡν,ΡΡν感染率29%。
【主权项】
1. 一种用于检测猪细小病毒的LAMP引物组，其包括如下引物： 引物 F3: 5，-ACGGAGGTAAAATTGGACA-3，； 引物 B3: 5^tccctttagctttttttttagc-S'； L Si-GAGATGTAGTTGGTGAGTCTGTTTTTTTTTCTT 引物FIP. CAGAGCA AAGCGTG-3，； …k 5，-CAACCAGAGGTAAGAAGATCGCTTTTAAAAA 引物BIP: TATGTCTTGG AGC AGGT-3，。2. 如权利要求1所述用于检测猪细小病毒的LAMP引物组在制备猪细小病毒的LAMP检测 试剂盒中的应用。3. -种包含权利要求1所述的LAMP引物组的猪细小病毒的LAMP检测试剂盒。4. 根据权利要求3所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述LAMP检测试剂盒包含LAMP 反应体系，该LAMP反应体系包括:MgS〇4、dNTP、buffer^^FIP^^BIPd^F3d^B3、 甜菜碱、模板、Bst酶。5. 根据权利要求4所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述25yL LAMP反应体系中各 成分的用量为:MgS〇4:20-30nmol，dNTP: O · 5-1 · Onmol，10 X buffer，引物FIP: 5-40pmol，弓丨 物BIP: 5-40pmol，引物F3: 2 · 5-40pmo 1，引物B3: 2 · 5-40pmol，甜菜碱：15-25μπιοI，Bst酶： 6.4-9.6U〇6. 根据权利要求4或5所述的猪细小病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述25yL LAMP反应体系中各成分的用量为:MgS〇4:20nmoI，dNTP: 1 · Onmol，10 X buff er，FIP: 5pmo 1， BIP:5pmol，F3:20pmol，B3:20pmol，甜菜喊：25ymol，Bst酶：9.6U。7. 根据权利要求3-6所述的猪细小病毒的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述LAMP检测 试剂盒还包括:显色剂、阳性对照、无模板对照。8. -种检测猪细小病毒的LAMP检测方法，其包括如下步骤： 1) 提取待测样品DNA作为模板； 2) 配制LAMP检测体系 LAMP检测体系包含如下成分，按总体积25yL配制：]\^3〇4:2〇-3〇11111〇1，(1町？：0.5-1 · Onmol，10 X buffer，引物FIP: 5-40pmol，引物BIP: 5-40pmol，引物F3: 2 · 5-40pmol，引物 B3:2.5-40pmol，甜菜碱：15-25μπιο1，Bst酶:6.4-9.6U;还包括步骤1)提取的DNA模板;其中， 引物FIP、引物BIP、引物F3、引物Β3的序列如权利要求1所述； 3. LAMP反应 LAMP反应程序为:首先59-60 °C恒温30-60min，再80-85 °C恒温3-5min; 4) 步骤3)LAMP反应结束后，向反应物中加入SYBR Green I染料，观察颜色变化:显色为 绿色的样品为阳性，含有猪细小病毒;显色为橘红色的样品为阴性，不含猪细小病毒。9. 根据权利要求8所述的猪细小病毒的LAMP检测方法，其特征在于，所述LAMP检测体系 中各成分的用量为：MgS〇4:20nmoI，dNTP: 1 · OnmoI，10 X buf f er，FIP: 5pmoI，BIP: 5pmoI，F3: 20pmol，B3:20pmol，甜菜喊：25ymol，Bst酶：9.6U。10. 根据权利要求8所述的猪细小病毒的LAMP检测方法，其特征在于，所述LAMP反应程 序为：首先59 °C恒温45min，再80 °C恒温3min。
【文档编号】C12N15/11GK106011314SQ201610613054
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年7月29日
【发明人】赵凯, 倪建平, 李春华, 赵笑, 胡瑞丽, 杜亚楠, 赵庆, 赵斌安, 史斌, 赵桓震, 潘磊, 范小瑞, 赵本进, 蒋风英, 张春玲
【申请人】上海佳牧生物制品有限公司, 上海市农业科学院