固定化反应装置及利用固定化技术进行反应的方法
【专利摘要】本发明提供了一种固定化反应装置及利用固定化技术进行反应的方法。所述固定化反应装置包括具有入口和出口的柱状反应器，该反应器具有由彼此相对的顶部和底部、以及连接该顶部和底部的侧壁限定的内部空腔。
【专利说明】
固定化反应装置及利用固定化技术进行反应的方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物工程领域，具体涉及固定化反应装置及利用固定化技术进行反应 的方法。
【背景技术】
[0002] 利用酶法生产各种化学药品是现今的常用技术，其优势在于低能耗和绿色生产。 但液体酶法有其限制：液酶仅可使用一次。因此，酶在整个生产成本中往往占有高比例，这 是酶法生产成本居高不下的主要原因。此外，大量使用液酶与绿色工业的本意背道而驰，并 且，液酶在酶法反应后残余于反应溶液中，增加了纯化产品的难度。固定化酶和固定化细胞 的使用则可避免上述缺点。
[0003] 中国专利CN1982445B公开了一种制备新型的固定化酶/细胞的方法和载体。所 述载体具有比表面积大、物理及化学性质稳定、酶载量高等优点。但该专利没有提供利用该 类型的固定化酶或固定化细胞进行工业化生产的反应装置和方法。
【发明内容】
[0004] 为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供了固定化反应装置及利用固定 化技术进行反应的方法。
[0005] 具体而言，本发明提供了：
[0006] (1) -种固定化反应装置，包括具有入口和出口的柱状反应器，该反应器具有由顶 部和底部、以及连接该顶部和底部的侧壁限定的内部空腔，其特征在于，固定有酶或细胞的 载体被填充在所述内部空腔中成为一个柱体，该柱体具有与所述反应器的侧壁相对的侧表 面，该侧表面与所述反应器的侧壁之间基本上不存在空隙。
[0007] (2)根据（1)所述的固定化反应装置，其中所述反应器能够允许反应流体以最高 达100V/分钟的流速通过该反应器，同时所述反应流体在所述入口和所述出口之间的压差 保持小于或等于〇. 3MPa，其中V表示所述反应器的内部空腔的容积。
[0008] (3)根据（1)所述的固定化反应装置，其中所述柱体的高度与所述内部空腔的高 度之比为（0. 3-1. 0) : 1。
[0009] (4)根据⑴所述的固定化反应装置，其中所述载体为开孔的多孔有机泡沫材料， 所述载体的形状包括颗粒状、块状、柱状、片状或条带状。
[0010] (5)根据（1)或（4)所述的固定化反应装置，其中所述载体具有至少为0. 2mm/s的 水自然湿润速率。
[0011] (6)根据（1)所述的固定化反应装置，其中所述反应器还包括夹在所述柱体的侧 表面与所述反应器的侧壁之间的吸水膨胀性材料或不透水材料，以使得所述柱体的侧表面 与所述反应器的侧壁之间基本上不存在空隙。
[0012] (7)根据（1)所述的固定化反应装置，其中所述固定化反应装置还包括反应调控 罐，所述反应调控罐与所述反应器之间形成循环回路。
[0013] (8)根据（7)所述的固定化反应装置，其中：
[0014] 所述反应器的下端具有入口，上端具有出口；
[0015] 所述反应调控罐的下端具有出口，上端具有入口；并且
[0016] 所述反应调控罐的出口与所述反应器的入口连通，所述反应器的出口与所述反应 调控罐的入口连通。
[0017] (9)根据（1)所述的固定化反应装置，其中所述固定化反应装置还包括栗，所述的 栗能够提供在〇. 01V/分钟至100V/分钟的范围内的流体流速，其中V表示所述反应器的内 部空腔的容积。
[0018] (10)根据（1)所述的固定化反应装置，其中所述固定化反应装置还包括pH调控装 置。
[0019] (11)根据⑴所述的固定化反应装置，其中所述反应器的内部空腔的高径比为 (0? 1-3. 0) :1〇
[0020] (12) -种利用固定化酶或固定化细胞进行反应的方法，其特征在于所述方法包括 采用（1)至（11)中任一项所述的固定化反应装置进行反应。
[0021] (13)根据（12)所述的方法，其中所述方法进一步包括使反应流体以0. 01V/分钟 至100V/分钟的范围内的流速通过所述反应器，其中V表示所述反应器的内部空腔的容积。
[0022] (14)根据（12)或（13)所述的方法，其中所述反应器的入口处的液压为大于OMPa 至0. 3MPa，并且反应流体在所述反应器的入口和出口之间的压差在小于或等于0. 3MPa。
[0023] (15)根据（12)所述的方法，其中所述反应流体的pH为2-12。
[0024] (16)根据（12)所述的方法，其中所述固定化酶选自肌酸激酶和S-腺苷甲硫氨酸 合成酶。
[0025] (17)根据（12)所述的方法，其中所述固定化细胞为大肠杆菌。
[0026] 本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：
[0027] 1.本发明的固定化反应装置通过使反应器采用一体式设计（即，固定有酶或细胞 的载体被填充在反应器的内部空腔中成为一个柱体，该柱体具有与所述反应器的侧壁相对 的侧表面，该侧表面与所述反应器的侧壁之间基本上不存在空隙），使得固定化酶或固定化 细胞充分发挥其通透性，由此实现了其与反应溶液之间的充分接触和反应。
[0028] 2.本发明的固定化反应装置能够在反应器中保持低压差，即使在高流量的情况下 也是如此，由此避免了固定化酶或固定化细胞在工业化生产时承受过大的压力。因此，本发 明的固定化反应装置为工业化放大生产创造了条件。
[0029] 3.在利用本发明的固定化反应装置进行固定化酶/固定化细胞反应时，反应流体 反复地沿反应器的纵轴方向流过，由此进一步提高了固定化酶或固定化细胞与反应溶液的 接触。
【附图说明】
[0030] 图1为本发明的一个实施方案中的固定化反应装置的结构的示意图。图中1为高 流量水栗；2为反应器；3为反应调控罐；4为pH调控装置；5为搅拌装置；6为pH探测电极； 7为酸碱度调节罐。
【具体实施方式】
[0031] 以下通过【具体实施方式】的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但这并非是对 本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只 要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
[0032] 本发明提供了 一种固定化反应装置，包括具有入口和出口的柱状反应器，该反应 器具有由彼此相对的顶部和底部、以及连接该顶部和底部的侧壁限定的内部空腔，固定有 酶或细胞的载体被填充在所述内部空腔中成为一个柱体，该柱体具有与所述反应器的侧壁 相对的侧表面，该侧表面与所述反应器的侧壁之间基本上不存在空隙。
[0033] 在本发明的固定化反应装置中，用来固定酶或细胞的载体可以为开孔的多孔有机 泡沫材料，因此该载体的内部也具有开放的孔，即所述的孔不是封闭的，在该载体的内部具 有至少两个互为连通的孔。利用这样的载体可以使所形成的柱体也具有开孔的三维网格结 构，反应流体可以贯穿该柱体的内部流动。这样可以显著提高反应流体与固定化酶或固定 化细胞的接触面积。
[0034] 所述载体的形状可以包括颗粒状、块状、柱状、片状或条带状。在固定有酶或细胞 的载体被填充在反应器的内部空腔中时，形成一个柱体。所述柱体基本上为均质的，即，该 柱体的各个部分的密度大体上相同。所述柱体的侧表面与反应器的侧壁之间基本上不存在 空隙。也就是说，本发明的反应器为一体式设计。采用这样的设计，固定化酶或固定化细胞 充分发挥了其通透性，由此实现了其与反应流体之间的充分接触和反应。
[0035] 在本文中，术语"基本上不存在空隙"是指不存在肉眼可见的空隙。可以紧密装填 固定有酶或细胞的载体，和/或利用吸水膨胀性材料或不透水材料进行填缝，以使所述固 定有酶或细胞的载体经填充而形成的柱体的侧表面与反应器的侧壁之间基本上不存在空 隙。
[0036] 在本文中，术语"通透性"是固定化酶或固定化细胞所具有的性质，其是指反应流 体通过固定化酶或固定化细胞的特性。通透性反应了固定化酶或固定化细胞与反应流体接 触和反应的程度，通透性越高，则接触和反应得越充分。
[0037] 优选地，所述反应器的内部空腔的高径比为（0.1-3. 0):1。
[0038] 在本文中，涉及反应器所用的术语"高径比"是指反应器的内部空腔的高与横截面 直径（也称为"内径"）之比。所述反应器可以为棱柱状（例如三棱柱、四棱柱）或圆柱状， 优选为圆柱状。在所述反应器的横截面为非圆形的情况下，所述"横截面直径"是指等效圆 直径，即，面积与所述反应器的横截面面积相等的圆的直径。
[0039] 本发明的发明人发现，如果所述内部空腔的高径比过小，则反应流体通过所述反 应器的流速往往不均匀；如果高径比过大，当反应流体以高流量通过反应器时，反应器入口 和出口之间的压力差则过大，这使得固定化酶或固定化细胞在工业化放大生产时容易承受 过大的压力，不利于生产（可参见对比例1)。根据本发明，所述反应器的内部空腔的高径 比可在（0.1_3.0):1的范围内。优选地，所述反应器的高径比为（0.3_1.5):1，更优选为 0. 4:1〇
[0040] 由于本发明的反应器具有所述的构造和高径比，其能够使反应器中保持低压差， 即使在高流量的情况下也是如此，这在工业化放大生产时尤其重要。因此，本发明的固定化 反应装置为工业化放大生产创造了条件。
[0041] 更具体而言，本发明的反应器能够允许反应流体以最高达100V/分钟的流速通 过该反应器，同时所述反应流体在所述反应器的入口和出口之间的压差保持小于或等于 0.3MPa，其中V表示所述反应器的内部空腔的容积（也就是反应器的容积）。在本发明中， 可以使用常规的压力仪表测量入口处和出口处的压力，从而确定压差。
[0042] 对反应器的材料没有限制，其可以为有机玻璃、不锈钢、塑料材料、搪瓷等。
[0043] 固定有酶或细胞的载体在反应器中的填充松紧程度通常不影响反应器入口和出 口之间的压差，只要不过松以致形成短路或过紧以致破坏载体的结构即可。
[0044] 例如，在下文所述的由固定有酶或细胞的片状载体卷绕成柱状卷轴的情况中，固 定有酶或细胞的载体在反应器中的填充松紧程度可以大致通过以下标准确定：
[0045] 表 1
[0047] 在本发明中，固定有酶或细胞的载体在反应器中的填充松紧程度符合2-4级，更 优选符合3级。
[0048] 用来固定酶或细胞的载体可以为颗粒状或块状的形状。在这种情况下，所述柱体 是由固定有酶或细胞的载体堆积而成的。
[0049] 用来固定酶或细胞的载体也可以为柱状的形状。在这种情况下，所述柱体可以是 由单一一个固定有酶或细胞的载体构成的，也可以是由多个这样的载体堆叠而成的。
[0050] 用来固定酶或细胞的载体还可以为片状或条带状的。在这种情况下，所述柱体可 以是由单独的固定有酶或细胞的载体卷绕而成的柱状卷轴，也可以是由多个所述柱状卷轴 作为模块上下堆积而成的柱体；所述柱状卷轴任选地具有无孔材质的内芯。可以理解，在这 种情况下，所述柱体也可以是由片状或条带状的固定有酶或细胞的载体堆积而成的柱体。
[0051] 在本文中，所述固定有酶或细胞的载体经填充而形成的柱体的"侧表面"是指所述 柱体的侧表面轮廓。例如，在本发明所述的柱体是由单一一个固定有酶或细胞的柱状载体 构成、或者是由固定有酶或细胞的片状载体卷绕成柱状卷轴的情况下，所述侧表面就是该 柱状载体或柱状卷轴的侧表面。由于该柱状载体或柱状卷轴的直径与反应器的横截面直径 基本上相等，因此所述柱体的侧表面基本上完全附着在所述反应器的侧壁上。在本发明所 述的柱体由固定有酶或细胞的片状、条带状、颗粒状、或块状载体堆积而成的情况下，所述 侧表面就是由所述载体堆积而成的柱体的侧表面。由于由所述载体堆积而成的柱体的直径 与反应器的横截面直径基本上相等，因此所述柱体的侧表面基本上完全附着在所述反应器 的侧壁上。
[0052] 在本发明中，所述柱体可以完全填满所述反应器的内部空腔，也可以在所述内部 空腔的顶部和/或底部留有一定的空间。优选地，所述柱体的高度与所述内部空腔的高度 之比为（0. 3-1. 0) :1。
[0053] 本发明所用的固定化酶或固定化细胞可以按照中国专利CN1982445B中所述的方 法制备，该专利的全部内容以引用方式并入本文。所述固定化酶或固定化细胞的载体为开 孔的多孔有机泡沫材料，优选为吸水性的。载体的开孔特性便于反应时反应流体充分有效 地与载体上的酶分子或细胞接触反应，以及便于酶反应后产物的传质。多孔材料的吸水性 越强，表现出来的水自然湿润速率就越大。水自然湿润速率高于0. 2mm/s、优选高于0. 4mm/ s的材料适用于作为固定化载体，水自然湿润速率低于0. 2mm/s的材料则不适用于作为固 定化载体。合适的载体材料包括（例如）PVA海绵、木浆海绵、三聚氰胺海绵等。水自然湿 润速率的测定可按照中国专利CN1982445B中所述的方法进行。
[0054] 在本发明中，单独的固定有酶或细胞的载体或其堆积组合形成的结构可用包裹材 料密封固定。包裹材料可以为PVA海绵或木浆海绵等。所述载体或包裹材料可具备吸水膨 胀特性，从而在吸水后消除载体与反应器内壁之间可能存在的空隙。或者，所述空隙也可用 不透水的材料填实。
[0055] 本发明的固定化反应装置在使用时，反应流体可以单方向与固定化酶或固定化细 胞反应，并且可以通过将出入口对换，从而按需切换流体循环方向。
[0056] 优选的是，本发明所述的固定化反应装置还包括反应调控罐，所述反应调控罐与 所述反应器之间形成循环回路。在本文中，术语"循环回路"是指在与水平方向垂直或平行 或成任何夹角的方向上形成循环回路。因此，所述装置在使用时，反应流体能够在所述循环 回路中顺时针方向或逆时针方向流动，从而单方向与固定化酶或固定化细胞接触并反应。
[0057] 更优选的是，所述反应器的下端具有入口，上端具有出口（或者下端具有出口，上 端具有入口）；所述反应调控罐的下端具有出口，上端具有入口；并且所述反应调控罐的出 口与所述反应器的入口连通，所述反应器的出口与所述反应调控罐的入口连通。在这样的 构造中，反应流体可以反复沿反应器的纵轴方向由下向上流过，由此进一步提高了固定化 酶或固定化细胞的通透性。
[0058] 在本文中，涉及反应器或反应调控罐所用的上端、下端不一定是最顶端或最底端， 例如，上端可以是位于所述反应器或反应调控罐的一半高度以上的任何合适的位置，下端 可以是位于所述反应器或反应调控罐的一半高度以下的任何合适的位置。另外，术语"连 通"表示两个部件流体相连，即，二者之间可以连接有其他的部件或装置，只要在使用时可 以形成流体通路即可。
[0059] 如图1所示，所述反应调控罐可以配备有搅拌装置。优选地，反应调控罐还可 配有恒温循环水锅（图中未示出），以便为反应流体提供合适的温度，该温度例如可以为 4-80°C，优选为10-70°C。搅拌装置和恒温循环水锅与反应调控罐之间的连接方式可以采用 本领域已知的各种常规的方式。反应调控罐可以为任何市售可得的产品。
[0060] 优选地，本发明的固定化反应装置包括栗，例如高流量水栗，该栗能够提供 0. 01-100倍反应器容积/分钟的流体流速，更优选为0. 5-20倍反应器容积/分钟的流体流 速。
[0061] 如图1所示，高流量水栗可以连接至反应器的下端入口。高流量水栗可以以匀速 或变速将反应调控罐中的反应流体栗入装有固定化酶或固定化细胞的反应器中。高流量水 栗与反应器的连接方式可以采用本领域已知的各种常规的方式，并且高流量水栗是市售可 得的。
[0062] 优选的是，本发明的固定化反应装置还包括pH调控装置以实时监测反应流体的 pH值。所述pH调控装置可具有pH探测电极和酸碱度调节罐。pH探测电极的一部分（例 如顶端）位于反应调控罐中，以确保该部分能够与反应流体充分接触，从而探测反应流体 的pH值。酸碱度调节罐中容纳有酸液或碱液并通过管路与反应调控罐连通，从而使pH调 控装置可根据需要自动添加酸或碱以维持所需的反应流体的pH。优选地，所述pH调控装置 可以在pH 1-13的范围内进行调节。本发明所用的pH调控装置可以为任何市售可得的产 品。
[0063] 本发明还提供了一种利用固定化技术进行反应的方法，其中所述方法采用本发明 所述的固定化反应装置进行反应。
[0064] 优选地，所述方法包括使反应流体以0? 01-100倍（优选0? 5-20倍）反应器容积/ 分钟的流速通过所述反应器，从而在所述反应器和所述反应调控罐之间循环流动。这可通 过使用上述高流量水栗来实现。
[0065] 当流量为0. 01倍反应器容积/分钟时，由于流量较小，因此不会产生较大的压差； 当流量为100倍反应器容积/分钟时，本发明的反应器的上述设计会降低和缓解此时所产 生的较大的压差，可顺利产生所需的反应产物。
[0066] 优选的是，所述反应流体的pH为2-12,优选为2-11，更优选为5-9。所述反应流体 可以包含缓冲液，例如磷酸盐缓冲液、Tris等。根据实际应用，所述反应流体也可以不包含 缓冲液。
[0067] 本发明所述的利用固定化技术进行的反应可以在4-80°C下进行，优选在10_70°C 下进行，例如在20-40°C下进行，根据固定化酶或固定化细胞的活性温度范围而定。
[0068] 在利用本发明的固定化反应装置进行反应时，所述反应器入口处的液压可以达到 大于OMPa至0. 3MPa，该范围内的液压可以避免固定化酶或固定化细胞由于承受过大的压 力而发生挤压变形的现象，这在工业化放大生产时尤其重要。
[0069] 在本发明的方法中，所述固定化酶优选选自肌酸激酶和S-腺苷甲硫氨酸合成酶。 所述固定化细胞优选为大肠杆菌。
[0070] 在本发明的一个具体的实施方案中，本发明的方法包括：(a)将承载有固定化酶 或固定化细胞的载体装入直径相配的反应器中，该反应器为高径比为（〇. 1-3) :1的柱体； (b)反应器的下端入口用硅胶喉管连接到高流量水栗的出口处，该水栗的入口也用喉管连 接至反应调控罐的出口；（c)反应调控罐同时配有搅拌装置和恒温循环水锅；（d)将pH调 控装置的pH探测电极安装至反应调控罐中，确保其顶端可与反应流体充分接触；（e) pH调 控装置在安装前利用酸碱度标准流体校正，并设定调控范围的最高pH值、最低pH值、以及 检测差值；（f)反应器的上端出口用硅胶喉管连接至流量计，最后连接至反应调控罐的入 口；（g)在反应调控罐中加入反应流体并启动搅拌装置，将搅拌方式设定为逆时针方向，转 速为5-1000rpm ; (h)启动高流量水栗以开始反应，从反应调控罐中实时抽取反应流体并进 行产物的含量分析，当产物的含量达到预定目标时，即关上高流量水栗停止反应，并停止搅 拌装置和酸碱度调控装置的调控栗；（i)从反应调控罐中取出反应流体，替换新的反应流 体进行下一批次反应。
[0071] 以下通过例子的方式进一步解释或说明本发明的内容，但这些例子不应被理解为 对本发明的保护范围的限制。
[0072] 实施例
[0073] 实施例中所用材料和设备的描述如下：
[0074] 反应调控罐：得自基因港（香港）生物科技有限公司，BR-1L ;
[0075] 可调节流量式吸水栗：得自SURGEFL0公司，FL-32 ;
[0076] 酸碱度调控装置：得自基因港（香港）生物科技有限公司，AR-1 ;
[0077] -水肌酸：得自江苏远洋化学股份有限公司；
[0078] 三磷酸腺苷二钠盐：得自开平牵牛医药公司；
[0079] DL-甲硫氨酸：得自湖北化峰药化公司。
[0080] 实施例1 :磷酸肌酸的生产
[0081] 根据中国专利申请公开号CN102808006的序列设计PCR引物，具体为：
[0082] 上游引物CPK1:
[0083] 5'-GGGAATTCCATATGCCGTTCGGCAACACCCACAAC-3'
[0084] 下游引物CPK2:
[0085] 5'-CCGCTCGAGCTTCTGCGCGGGGATCATGTCGTCG-3'
[0086] 根据中国专利申请公开号CN102808006所述的方法，得到肌酸激酶基因，并连接 至 pET-21a，得到 pET-21a (+)-CPK，转化大肠杆菌 BL21 (DE3)。
[0087] 将上述菌株接种于4ml LB培养基（含100ug/ml氨苄青霉素）中，培养16小时作 为初级种子液，完成后按1 %的数量比接种至l〇〇ml LB培养基（含100ug/ml氨苄青霉素） 中。在摄氏37°C、200rpm的条件下培养该二级种子10小时，再将1%的二级种子接种至含 60L LB培养基（含100ug/ml氨苄青霉素）的100L发酵罐中。发酵初始条件为摄氏37°C、 200rpm、pH7。发酵至9小时加入IPTG至终浓度为ImM，发酵20小时。发酵液在摄氏4°C下 以12, 500rpm离心10分钟，得含肌酸激酶的大肠杆菌细胞1. 12kg。
[0088] 根据中国专利申请公开号CN102808006的磷酸肌酸含量测定法对细胞进行酶活 力检测，酶活约为6U/ml。
[0089] 根据中国专利CN1982445B的实施例3的方法，在载体上制备肌酸激酶固定化大肠 杆菌细胞，载体的形状为条形：长20cm、阔5cm、厚5mm，实重43. 6g。
[0090] 将上述制得的承载有肌酸激酶固定化大肠杆菌细胞的载体安装于固定化酶/固 定化细胞反应器中。该反应器为有机玻璃制成的圆柱体，高7cm、半径4. 5cm。用刀将上述 载体头尾端约3cm以斜度45°整齐削去，紧握卷成高5cm、半径4. 5cm的均质圆柱体，重量 为30g。将该圆柱体插入反应器中，使其松紧程度符合表1中所述的3级标准，并且使其侧 壁与反应器的内壁之间不留空隙。完成安装后，按图1进行其它配备装置的安装程序，其中 反应调控罐容量为1L ;高流量水栗是可调节流量式吸水栗，流速为3L/分钟；酸碱度调控装 置采用0. 3M氢氧化钠溶液进行pH调控，其加液栗的流量为每分钟lml。
[0091] 反应溶液所含的底物为一水肌酸8. 94g/L，三磷酸腺苷二钠盐12. lg/L和六水氯 化镁4. lg/L。加入以上底物后用1升约45°C的去离子水搅拌溶解，至反应溶液澄凊，用2M 氢氧化钠溶液调节pH至8. 9。
[0092] 加入300ml上述反应溶液至反应调控罐中，温度为37 °C，pH调控为8. 85-8. 95,高 流量水栗的流量为3L/分钟，反应持续60分钟，用压力仪表测量反应器入口和出口处的压 差为0. 08MPa，产物磷酸肌酸含量为5mM。
[0093] 实施例2 :S-腺苷甲硫氨酸的生产
[0094] 根据中国专利CN101134948B的序列设计PCR引物，具体为：
[0095] 上游引物亲本S1:
[0096] 5'-AGCCTAGGTTAATTAACTTTAAGAAGGAGATACATATGAGAAACATAATTGTAAA-3，
[0097] 下游引物亲本S2:
[0098] 5'-ATAAGCTCAGCGGCGCGCCTTAGAATGTAGTTACTTTTCCTTCA-3'
[0099] 根据中国专利 CN101134948B 所述，以 M. Jannaschii ATCC 43067 (ATCC, USA) DNA为底物进行PCR，利用限制性内切酶PacI和AscI处理PCR产物并将其连接至 pGEMT-EASY(Promega，USA)中，得到pGEMT-SAM。将此重组表达载体转化至大肠杆菌HB101 中，得到表达S-腺苷甲硫氨酸合成酶的菌株。
[0100] 将含pGEMT-SAM的菌株接种于5ml LB培养基（含50mg/L氨苄青霉素）中培养16 小时作为初级种子液，完成后按1 %的数量比接种至l〇〇ml LB培养基（含50mg/L氨苄青霉 素）中作为二级种子。在37°C、200rpm的条件下培养10小时，最后，二级种子再以1%的 量接种至含60L LB培养基（含100ug/ml氨苄青霉素）的100L发酵罐中。发酵初始条件 为37°C、200rpm、pH7、发酵40小时。发酵液在4°C下以12, 500rpm离心10分钟，得到表达 S-腺苷甲硫氨酸合成酶的大肠杆菌细胞共1. 21kg。
[0101] 根据中国专利CN101134948B中所述的发酵后细胞的处理和提酶方法，获得1. 78L 液酶，S-腺苷甲硫氨酸合成酶的表达量为总蛋白的70重量％。
[0102] 根据中国专利CN1982445B的实施例3所述的方法，在载体上制备S-腺苷甲硫氨 酸合成酶的固定化酶，载体的形状为条形：长20cm、阔5cm、厚5mm，共得实重20. 3g。
[0103] 将上述制得的承载有固定化S-腺苷甲硫氨酸合成酶的载体安装于固定化酶/固 定化细胞反应器中。该反应器为有机玻璃制成的圆柱体，高7cm、半径4. 5cm。用刀将上述 载体的头尾端约3cm以斜度45°整齐削去，紧握卷成高5cm、半径4. 5cm的均质圆柱体，重 量为18g。将该圆柱体插入反应器中，使其松紧程度符合表1中所述的3级标准，并且使其 侧壁与反应器的内壁之间不留空隙。完成反应器的安装后，按图1进行其它配备装置的安 装程序，其中反应调控罐容量为1L，高流量水栗是可调节流量式吸水栗，流速为1L/分钟， 酸碱度调控装置采用〇. 5M氢氧化钠溶液进行pH调控，其加液栗的流量为lml/分钟。
[0104] 反应溶液含DL-甲硫氨酸1. 2g/L，三磷酸腺苷二钠盐4. 84g/L，六水氯化镁4. lg/ L，氯化钾7. 5g/L。加入以上底物后用1L离子水搅拌溶解，至反应溶液澄凊，最后利用2M氢 氧化钠溶液调节pH至7. 5。
[0105] 加入300ml上述反应溶液至反应调控罐中，温度为58 °C，pH调控为7. 45-7. 55,高 流量水栗的流量为1L/分钟，反应持续120分钟，用压力仪表测量反应器入口和出口处的压 差为0. 08MPa，产物S-腺苷甲硫氨酸含量ImM。
[0106] 实施例3
[0107] 按照实施例1的制备方法获得肌酸激酶基因和表达该基因的大肠杆菌细胞，并且 进行发酵并在载体上制备肌酸激酶固定化大肠杆菌细胞，载体的形状为条形：长22cm、阔 5cm、厚 5mm，实重 45. 8g〇
[0108] 将上述制得的承载有肌酸激酶固定化大肠杆菌细胞的载体安装于固定化酶/固 定化细胞反应器中。该反应器为有机玻璃制成的圆柱体，高1.8cm、半径9cm。用刀将上述 载体头尾端约3cm以斜度45°整齐削去，紧握卷成高1. 5cm、半径9cm的均质圆柱体，重量 为30g。将该圆柱体插入反应器中，使其松紧程度符合表1中所述的3级标准，并且使其侧 壁与反应器的内壁之间不留空隙。完成安装后，按图1进行其它配备装置的安装程序，其中 反应调控罐容量为1L ;高流量水栗是可调节流量式吸水栗，流速为3L/分钟；酸碱度调控装 置采用0. 3M氢氧化钠溶液进行pH调控，其加液栗的流量为每分钟lml。
[0109] 反应溶液所含的底物为一水肌酸8. 94g/L，三磷酸腺苷二钠盐12. lg/L和六水氯 化镁4. lg/L。加入以上底物后用1升约45°C的去离子水搅拌溶解，至反应溶液澄凊，用2M 氢氧化钠溶液调节pH至8. 9。
[0110] 加入300ml上述反应溶液至反应调控罐中，温度为37 °C，pH调控为8. 85-8. 95,高 流量水栗的流量为3L/分钟，反应持续60分钟，用压力仪表测量反应器入口和出口处的压 差为0. 08MPa，产物磷酸肌酸含量为4. 7mM。
[0111] 实施例4
[0112] 按照实施例1的制备方法得肌酸激酶基因和表达该基因的大肠杆菌细胞，并且 进行发酵并在载体上制备肌酸激酶固定化大肠杆菌细胞，载体的形状为条形：长25cm、阔 6cm、厚 5mm，实重 48. 2g〇
[0113] 将上述制得的承载有肌酸激酶固定化大肠杆菌细胞的载体安装于固定化酶/固 定化细胞反应器中。该反应器为有机玻璃制成的圆柱体，高16. 5cm、半径2. 8cm。用刀将上 述载体头尾端约3cm以斜度45°整齐削去，紧握卷成每卷高5. 5cm、半径2. 8cm的均质圆柱 体，共3卷，总重量为30g。将圆柱体首尾相接插入反应器中，使其松紧程度符合表1中所述 的3级标准，并且使其侧壁与反应器的内壁之间不留空隙。完成安装后，按图1进行其它配 备装置的安装程序，其中反应调控罐容量为1L ;高流量水栗是可调节流量式吸水栗，流速 为3L/分钟；酸碱度调控装置采用0. 3M氢氧化钠溶液进行pH调控，其加液栗的流量为每分 钟 lml 〇
[0114] 反应溶液所含的底物为一水肌酸8. 94g/L，三磷酸腺苷二钠盐12. lg/L和六水氯 化镁4. lg/L。加入以上底物后用1升约45°C的去离子水搅拌溶解，至反应溶液澄凊，用2M 氢氧化钠溶液调节pH至8. 9。
[0115] 加入300ml上述反应溶液至反应调控罐中，温度为37 °C，pH调控为8. 85-8. 95,高 流量水栗的流量为3L/分钟，反应持续60分钟，用压力仪表测量反应器入口和出口处的压 差为0. 09MPa，产物磷酸肌酸含量为4. 5mM。
[0116] 实施例5
[0117] 按照实施例1的制备方法得肌酸激酶基因和表达该基因的大肠杆菌细胞，并且 进行发酵并在载体上制备肌酸激酶固定化大肠杆菌细胞，载体的形状为条形：长30cm、阔 5cm、厚 5mm，实重 52. 4g。
[0118] 将上述制得的承载有肌酸激酶固定化大肠杆菌细胞的载体安装于固定化酶/固 定化细胞反应器中。该反应器为有机玻璃制成的圆柱体，高3. 8cm、半径6. 2cm。用刀将上 述载体头尾端约3cm以斜度45°整齐削去，紧握卷成高3. 7cm、半径6. 2cm的均质圆柱体， 重量为32g。将该圆柱体插入反应器中，使其松紧程度符合表1中所述的3级标准，并且使 其侧壁与反应器的内壁之间不留空隙。完成安装后，按图1进行其它配备装置的安装程序， 其中反应调控罐容量为1L ;高流量水栗是可调节流量式吸水栗，流速为3L/分钟；酸碱度调 控装置采用〇. 3M氢氧化钠溶液进行pH调控，其加液栗的流量为每分钟lml。
[0119] 反应溶液所含的底物为一水肌酸8. 94g/L，三磷酸腺苷二钠盐12. lg/L和六水氯 化镁4. lg/L。加入以上底物后用1升约45°C的去离子水搅拌溶解，至反应溶液澄凊，用2M 氢氧化钠溶液调节pH至8. 9。
[0120] 加入300ml上述反应溶液至反应调控罐中，温度为37 °C，pH调控为8. 85-8. 95,高 流量水栗的流量为3L/分钟，反应持续60分钟，用压力仪表测量反应器入口和出口处的压 差为0.1 MPa，产物磷酸肌酸含量为5. 8mM。
[0121] 实施例6
[0122] 按照实施例1的制备方法得肌酸激酶基因和表达该基因的大肠杆菌细胞，并且 进行发酵并在载体上制备肌酸激酶固定化大肠杆菌细胞，载体的形状为条形：长24cm、阔 5cm、厚 5mm，实重 46. 5g〇
[0123] 将上述制得的承载有肌酸激酶固定化大肠杆菌细胞的载体安装于固定化酶/固 定化细胞反应器中。该反应器为有机玻璃制成的圆柱体，高11cm、半径3. 5cm。用刀将上述 载体头尾端约3cm以斜度45°整齐削去，紧握卷成每卷高5cm、半径3. 5cm的均质圆柱体， 共2卷，总重量34g。将圆柱体首尾相接插入反应器中，使其松紧程度符合表1中所述的3级 标准，并且使其侧壁与反应器的内壁之间不留空隙。完成安装后，按图1进行其它配备装置 的安装程序，其中反应调控罐容量为1L ;高流量水栗是可调节流量式吸水栗，流速为3L/分 钟；酸碱度调控装置采用〇. 3M氢氧化钠溶液进行pH调控，其加液栗的流量为每分钟lml。
[0124] 反应溶液所含的底物为一水肌酸8. 94g/L，三磷酸腺苷二钠盐12. lg/L和六水氯 化镁4. lg/L。加入以上底物后用1升约45°C的去离子水搅拌溶解，至反应溶液澄凊，用2M 氢氧化钠溶液调节pH至8. 9。
[0125] 加入300ml上述反应溶液至反应调控罐中，温度为37 °C，pH调控为8. 85-8. 95,高 流量水栗的流量为3L/分钟，反应持续60分钟，用压力仪表测量反应器入口和出口处的压 差为0.1 MPa，产物磷酸肌酸含量为4. 7mM。
[0126] 对比例1 :
[0127] 按实施例1的制备方法得肌酸激酶基因和表达该基因的大肠杆菌细胞，并且进行 发酵并在载体上制备肌酸激酶固定化大肠杆菌细胞，载体的形状为条形：长20cm、阔5cm、 厚 5mm，实重 43. 6g。
[0128] 将上述制得的承载有肌酸激酶固定化大肠杆菌细胞的载体安装于固定化酶/固 定化细胞反应器中。该反应器为有机玻璃制成的圆柱体，高22cm、半径2. 5cm。用刀将上述 载体头尾端约3cm以斜度45°整齐削去，紧握卷成每卷高5cm、半径2. 5cm的均质圆柱体， 共四卷，总重量为30g。将圆柱体首尾相接插入反应器中，使其松紧程度符合表1中所述的 3级标准，并且使其侧壁与反应器的内壁之间不留空隙。完成安装后，按图1进行其它配备 装置的安装程序，其中反应调控罐容量为1L ;高流量水栗是可调节流量式吸水栗，流速为 3L/分钟；酸碱度调控装置采用0. 3M氢氧化钠溶液进行pH调控，其加液栗的流量为每分钟 lml 〇
[0129] 反应溶液所含的底物为一水肌酸8. 94g/L，三磷酸腺苷二钠盐12. lg/L和六水氯 化镁4. lg/L。加入以上底物后用1升约45°C的去离子水搅拌溶解，至反应溶液澄凊，用2M 氢氧化钠溶液调节pH至8. 9。
[0130] 加入300ml上述反应溶液至反应调控罐中，温度为37 °C，pH调控为8. 85-8. 95,高 流量水栗的流量为3L/分钟，反应持续60分钟，应为高径比过高，用压力仪表测量反应器入 口和出口处的压差为0. 36MPa，固定化细胞因压差过大出现挤压情况，反应溶液未能与固定 化细胞充分接触进行反应，产物磷酸肌酸含量为〇. 3mM。
【主权项】
1. 一种固定化反应装置，包括具有入口和出口的柱状反应器，该反应器具有由顶部和 底部、以及连接该顶部和底部的侧壁限定的内部空腔，其特征在于，固定有酶或细胞的载体 被填充在所述内部空腔中成为一个柱体，该柱体具有与所述反应器的侧壁相对的侧表面， 该侧表面与所述反应器的侧壁之间基本上不存在空隙。2. 根据权利要求1所述的固定化反应装置，其中所述反应器能够允许反应流体以最高 达100V/分钟的流速通过该反应器，同时所述反应流体在所述入口和所述出口之间的压差 保持小于或等于〇. 3MPa，其中V表示所述反应器的内部空腔的容积。3. 根据权利要求1所述的固定化反应装置，其中所述柱体的高度与所述内部空腔的高 度之比为（0. 3-1. 0) : 1。4. 根据权利要求1所述的固定化反应装置，其中所述载体为开孔的多孔有机泡沫材 料，所述载体的形状包括颗粒状、块状、柱状、片状或条带状。5. 根据权利要求1或4所述的固定化反应装置，其中所述载体具有至少为0. 2mm/s的 水自然湿润速率。6. 根据权利要求1所述的固定化反应装置，其中所述反应器还包括夹在所述柱体的侧 表面与所述反应器的侧壁之间的吸水膨胀性材料或不透水材料，以使得所述柱体的侧表面 与所述反应器的侧壁之间基本上不存在空隙。7. 根据权利要求1所述的固定化反应装置，其中所述固定化反应装置还包括反应调控 罐，所述反应调控罐与所述反应器之间形成循环回路。8. 根据权利要求7所述的固定化反应装置，其中： 所述反应器的下端具有入口，上端具有出口； 所述反应调控罐的下端具有出口，上端具有入口；并且 所述反应调控罐的出口与所述反应器的入口连通，所述反应器的出口与所述反应调控 罐的入口连通。9. 根据权利要求1所述的固定化反应装置，其中所述固定化反应装置还包括栗，所述 的栗能够提供在〇. 01V/分钟至100V/分钟的范围内的流体流速，其中V表示所述反应器的 内部空腔的容积。10. 根据权利要求1所述的固定化反应装置，其中所述固定化反应装置还包括pH调控 装置。11. 根据权利要求1所述的固定化反应装置，其中所述反应器的内部空腔的高径比为 (0· 1-3. 0) :1〇12. -种利用固定化酶或固定化细胞进行反应的方法，其特征在于所述方法包括采用 权利要求1-11中任一项所述的固定化反应装置进行反应。13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述方法进一步包括使反应流体以0. 01V/分钟 至100V/分钟的范围内的流速通过所述反应器，其中V表示所述反应器的内部空腔的容积。14. 根据权利要求12或13所述的方法，其中所述反应器的入口处的液压为大于OMPa 至0. 3MPa，并且反应流体在所述反应器的入口和出口之间的压差在小于或等于0. 3MPa。15. 根据权利要求12所述的方法，其中所述反应流体的pH为2-12。16. 根据权利要求12所述的方法，其中所述固定化酶选自肌酸激酶和S-腺苷甲硫氨酸 合成酶。17.根据权利要求12所述的方法，其中所述固定化细胞为大肠杆菌。
【文档编号】C12M1/40GK106032520SQ201510111592
【公开日】2016年10月19日
【申请日】2015年3月13日
【发明人】潘永强, 萧游龙, 陈军明, 沈冬, 王骏, 孙梁
【申请人】基因港(香港)生物科技有限公司