一种合成白藜芦醇的基因工程菌及其构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种合成白藜芦醇的基因工程菌，该基因工程菌是在E.coli BW25113中敲除限制葡萄糖合成酪氨酸的基因tyrR和trpED，并其染色体重组有粘红酵母的酪氨酸脱氨酶基因tal、欧芹的4-香豆酸:辅酶A连接酶基因4cl和葡萄的芪合酶基因sts；该基因工程菌以葡萄糖为底物合成白藜芦醇。
【专利说明】
一种合成白藜芦醇的基因工程菌及其构建方法
技术领域
[0001] 本发明属于合成生物学与代谢工程领域，具体涉及利用基因敲除与基因重组等技 术构建能够合成白藜芦醇的大肠杆菌工程菌及其构建方法。
【背景技术】
[0002] 白藜芦醇是一种非黄酮类多酚化合物，化学名为3, 4'，5_三羟基二苯乙烯 (3, 4'，5-trihydroxystilbene)，主要存在于葡萄、花生、桑树和虎杖等植物中。大量研究表 明，白藜芦醇具有抗癌、抗炎、保护心血管等多种药理作用 [1]~[5]。白藜芦醇还可以作为化 妆品与保健品的添加剂，目如市场上也有相关广品，如菊康利（Shaklee)VIVIX天然植物萃 取液、美国斯旺森红酒精华营养胶囊和红酒素等。
[0003] 白藜芦醇合成方法有植物提取法、化学合成法及微生物合成法。从天然植物中提 取白藜芦醇面临着提取工作繁杂、时间周期长、产量低和资源短缺等问题，而化学合成具有 合成路线长、能耗高，且易造成环境污染等问题。微生物合成法具有在短时间内得到大量目 的产物的特点，并且环境污染小、自然资源破坏少、操作相对简便等优点。因此，构建高产白 藜芦醇的工程菌株合成白藜芦醇具有极大的市场价值。
[0004] 目前的研究报道主要是将白藜芦醇合成途径的关键基因与质粒进行重组，进而将 重组载体导入重组菌株细胞内，最后重组菌株以对香豆酰、苯丙氨酸或酪氨酸等为底物发 酵合成白藜芦醇 [6]~[13]。中国专利CN102605006A和CN103540561A记载的技术方案中，将 苯丙氨酸羟化酶基因、酪氨酸氨解酶基因、4-香豆酰：辅酶A连接酶基因和白藜芦醇合酶 基因或将表达酪氨酸脱氨酶TAL、4-香桂酸：辅酶A连接酶4CL、芪合酶STS、丙二酸转运酶 mate以及丙二酸吸收酶matB的基因分别转化到菌种中，得到用于表达白藜芦醇的重组工 程菌种；但这些研究面临着2个问题：1)质粒表达具有不稳定性，即遗传不稳定性和环境不 稳定性，如在高温发酵的环境下，质粒容易丢失；2)对香豆酰、苯丙氨酸或酪氨酸等底物价 格高昂，不利于生产工艺的产业化。
[0005] 参考文献如下：
[0006] [1] Schuster S, Penke M, Gorski T, et al. Resveratrol differentially regulates NAMPT and SIRTlin hepatocarcinoma cells and primary human hepatocytes [J]. PLoS One, 2014, 9 (3) : e91045.
[0007] [2] Tome-Carneiro J, Larrosa M, Yanez-Gascon MJ, et al. One-year supplementation with a grape extract containing resveratrol modulates inflammatory-related microRNAs and cytokines expression in peripheral blood mononuclear cells of type 2diabetes and hypertensive patients with coronary artery disease[J]. Pharmacol Res, 2013, 72:69-82.
[0008] [3]. Ferretta A, Gaballo A, Tanzarella P, et al. Effect of resveratrol on mitochondrial function:Implications in parkin-associated familiar Parkinson's disease[J]. Biochim Biophys Acta,2014,1842 (7):902-915.
[0009] [4].Gu XS, Wang ZB,Ye Z, et al. Re s veratro 1, an activator of SIRT1，upregulates AMPK and improves cardiac function in heart failure[J]. Genet Mol Res，2014, 13(1) : 323-335.
[0010] [5]. Yao R，Yasuoka A，Kamei A，et al. Nuclear receptor-mediated alleviation of alcoholic Fatty liver by polyphenols contained in alcoholic beverages [J]. PLoS One, 2014, 9 (2) : e87142.
[0011] [6]. Becker JV, Armstrong GO, van der Merwe MJ, et al. Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for the synthesis of the wine-related antioxidant resveratrol[J]. FEMS Yeast Res, 2003, 4(1):79-85.
[0012] [7]. Beekwilder J,ffolswinkel R, Jonker H, et al. Production of resveratrol in recombinant microorganisms[J] ? Appl Environ Microbiol, 2006, 72(8):5670-5672.
[0013] [8]. Huang LL, Zhu QQ. Method for the production of resveratrol in a recombinant oleaginous microorganism[P]. W02006125000A2,2006.
[0014] [9].Shin SY,Jung SM, Kim MD,et al. Production of resveratrol from tyrosine in metabolically engineered Saccharomyces cerevisiae[J]. Enzyme Microb Technol，2012, 51(4) :211-216.
[0015] [10]. Watts KT, Lee PC,Schmidt-Dannert C. Biosynthesis of plant-specific stilbene polyketides in metabolically engineered Escherichia coli[J]. BMC Biotechnol，2006, 6:22.
[0016] [11]. Huang LL, Zhu QQ. Method for the production of resveratrol in a recombinant bacterial host cell[P]. US2007/0031951A1, 2007.
[0017] [12]. Lim CG, Fowler ZL, Hueller T，et al. High-yield resveratrol production in engineered Escherichia coli [J]. Appl Environ Microbi ol，2011，77(10) :3451-3460.
[0018] [13] ? Wu J，Liu P，Fan Y，et al. Multivariate modular metabolic engineering of Escherichia coli to produce resveratrol from L-tyrosine[J]. J Biotechn ol，2013, 167(4) :404-411.
【发明内容】
[0019] 本发明针对上述的现有问题，采用以染色体的整合的方式，将白藜芦醇合成途径 的关键基因重组到大成杆菌染色体上，得到能够以葡萄糖为底物合成白藜芦醇的重组菌 种，藉此解决重组质粒表达不稳定的问题并解决原料成本高不利于产业化的问题。
[0020] 本发明一方面提供了一种合成白藜芦醇的基因工程菌，该基因工程菌是在E. coli BW25113中敲除限制葡萄糖合成酪氨酸的基因tyrR和trpED，并其染色体重组有酪氨酸脱 氨酶基因tal、4-香豆酸：辅酶A连接酶基因4cl和芪合酶基因sts ;该基因工程菌以葡萄 糖为底物合成白藜芦醇。
[0021] 其中，上述基因可以通过密码子优化，所述的酪氨酸脱氢酶基因tal的核苷酸序 列如SEQ ID NO: 1所示；所述4-香豆酸：辅酶A连接酶基因4cl的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述的芪合酶基因sts核苷酸序列如SEQ IN NO:3所示。
[0022] 本发明还涉及构建合成白藜芦醇的基因工程菌的方法，步骤如下：
[0023] 1)分别获取芪合酶基因sts、酪氨酸脱氢酶基因tal和4-香豆酸：辅酶A连接酶 基因4cl，并构建重组质粒pET-sts和pET-tal-4cl ;
[0024] 2)以步骤1)中重组质粒pET-sts和pET-tal-4cl为模板分别PCR扩增出携带有 T7启动子和终止子的sts基因片段和tal_4cl基因片段，然后将所述扩增后的基因片段导 入质粒pTKIP-cat中并构建重组质粒pTKIP-sts和pTKIP_tal_4cl ;
[0025] 3)以线性化的质粒pTKS/CS为模板，分别用含有基因tyrR和trpED同源重组序列 的引物PCR扩增出带有上述同源重组序列的四环素抗性基因tetA序列；
[0026] 4)将步骤3)携带有基因tyrR同源重组序列的tetA序列转化于携带pTKRed质 粒的E. coli BW25113菌株细胞中，并筛选出阳性菌株E. coli BW25113( A tyrR: :tetA)/ pTKRed ;其中，所述携带pTKRed质粒的E. coli BW25113菌株在转化前经IPTG诱导；
[0027] 5)将步骤2)中构建的重组质粒pTKIP-sts转化于步骤4)中阳性菌种E. coli BW25113( A tyrR: :tetA)/pTKRed的菌株细胞中，然后涂布于含有抗生素的固体培养基上 后培养；
[0028] 6)将步骤5)中培养基上的重组菌种置于含有大观霉素和氨苄霉素的M9培养基中 活化，后接种于只含有大观霉素的M9培养基中，待0D 6。。~0. 6时加入IPTG和L-阿拉伯糖 诱导过夜后，再加入氯霉素培养后，涂布于含有氯霉素抗性平板中培养过夜；
[0029] 7)挑取步骤6)中菌落中分别点于四环素抗性平板、氨苄霉素抗性平板及氯 霉素抗性平板上后培养，选择四环素抗性平板和氨苄霉素抗性平板不生长，而氯霉素抗 性平板上生长的菌落再经过PCR验证后，进一步经测序验证后，得到阳性菌种E. coli BW25113(AtyrR::sts_cat);然后，敲除菌种 E.coli BW25113(AtyrR::sts_cat)中基因 sts下游的氯霉素基因cat，获得菌种E. coli BW25113( A tyrR:: sts);
[0030] 8)利用步骤7)制备的菌种E. coli BW25113 ( A tyrR: : sts)导入质粒pTKRed并构 建E. coli BW25113( A tyrR: : sts)/pTKRed菌种，然后将带有基因trpED同源重组序列的 tetA序列采用步骤4)中同样的方法导入上述菌种中并构建得到E. coli BW25113( A tyrR: :sts, A trpED:: tetA)/pTKRed 菌种；
[0031] 9)将步骤2)中所述的重组质粒pTKIP-tal-4cl转入步骤8)中构建的E. coli BW 25113 (A tyrR: : sts, A trpED: : tetA) /pTKRed菌种中并获得菌种E. coli BW25113 (A tyrR: :8七8，八1：印￡0:16七六)/^1'1(1^(1/^1'1(]^31-4(31，并采用步骤5)-7)中同样的方法获得阳性 菌种 E.coli BW25113(AtyrR::sts, AtrpED::tal_4cl_cat);随后米用步骤 7)中同样的 方法敲除tal_4cl基因下游的氯霉素基因cat，获得合成白藜芦醇的基因工程菌E. coli BW 25113 ( A tyrR::sts, A trpED::tal-4cl)〇
[0032] 本发明解决的技术问题是以E. coli BW25113为起始菌株，敲除限制葡萄糖合成酪 氨酸的2个基因（tyrR和trpED)，提高葡萄糖到酪氨酸的产量；并且将涉及从酪氨酸到白 藜芦醇合成的基因（酪氨酸解氨酶基因tal、4-香豆酸辅酶A连接酶基因4cl及芪合酶基 因sts)重组到菌株染色体上。这样达到从葡萄糖经酪氨酸途径合成白藜芦醇的目的，并且 重组到染色体上的目的基因能够稳定表达相关产物，实现白藜芦醇真正工业化的产出。
【附图说明】
[0033] 图1为实施例2中E. coli BW25113(AtyrR: :sts)构建成功的琼脂糖凝胶电泳图； 其中，
[0034] 泳道 1 为 E. coli BW25113，
[0035] 泳道 2 为 E. coli BW25113(AtyrR: :tetA)，
[0036] 泳道 3 为菌株 E. coli BW25113 ( A tyrR: : sts-cat)，
[0037] 泳道 4 为 E.coli BW25113(AtyrR::sts)，
[0038] M :分子量 Marker DL5000。
[0039] 图 2 为 E. coli BW25113 ( A tyrR: : sts, A trpED: : tal_4cl)成功构建的琼脂糖凝 胶电泳图；其中，
[0040] 泳道 1 为 E. coli BW25113(AtyrR: :sts)，
[0041 ]泳道 2 为 E. coli BW25113 ( A tyrR: : sts，A trpED: : tetA)，
[0042] 泳道 3 为 E. coli BW25113 ( A tyrR: : sts，A trpED: : tal_4cl_cat)，
[0043] 泳道 4 为 E. coli BW25113 ( A tyrR: : sts，A trpED: : tal_4cl)，
[0044] M :分子量 Marker DL5000。
[0045] 图 3 为 E. coli BW25113 ( A tyrR: : sts, A trpED: : tal_4cl)菌种诱导 SDS-PAGE 电泳图；其中，
[0046] 泳道 1 为 IPTG 诱导 4h 的 E. coli BW25113 ;泳道 2 为 IPTG 诱导前的 E. coli BW25 113(AtyrR::sts, AtrpED::tal_4cl);泳道3为诱导3.5h后的E.coli BW25113(AtyrR: :sts, AtrpED::tal_4cl);泳道4为诱导4h后的E.coli BW25113(AtyrR::sts, AtrpED: :七&1_4(：1);泳道5为诱导4.511后的￡.(3〇111^25113(八七5^1?::8七8，八1:印￡0::七&1-4(31); M表不Marker，单位KDa。
[0047] 图4为白藜芦醇标准品（lOOmg/L)的检测图谱；
[0048] 图 5 为 E. coli BW25113 ( A tyrR: : sts, A trpED: : tal_4cl_cat)菌种发酵后样品 的检测图谱；
[0049] 图6为对照菌种E. coli BW25113的发酵后样品的检测图谱；
【具体实施方式】
[0050] 本申请中将与白藜芦醇合成相关的基因---粘红酵母（Rhodotorula glutinis) 的酪氨酸脱氨酶基因tal、欧序（Petroselinum crispum)的4-香豆酸：辅酶A连接酶基因 4cl和葡萄（Vitis vinifera)的苗合酶基因sts重组于大肠杆菌的染色体上，并且替换敲 除了大肠杆菌染色体上限制葡萄糖合成酪氨酸的基因tyrR和trpED，同时上述相关基因在 T7启动子的控制下，在IPTG的诱导下即可完成表达。
[0051] 根据 Kuhlman 等发表的方法（Site-specific chromosomal integration of large synthetic constructs[J]， Nucleic Acids Research，2010,38(6)，e92)，利用 lambda-Red重组酶和I-Scel核酸酶完成外源基因在大成杆菌染色体上的整合；在IPTG 诱导其lambda-Red表达后，具有线性着落区片段（linear landing pad fragments)的基 因片段（扩增于来自质粒pTKS\CS)同源整合到大肠杆菌的染色体上；L-阿拉伯糖诱导的 I-Scel表达后，I-Scel识别位于供体质粒（带有目的基因的pTKIP)和菌种染色体上的识 别区并将其进行剪切；然后再次加入IPTG诱导表达lambda-Red ( A -Red)，将来源于供体质 粒的目的基因片段整合到经过剪切的染色体上完成整合。
[0052] 本申请中，采用质粒pTKRed、pTKIP_cat和pTKS/CS，其具体信息可参照Addgene组 织公布质粒信息；其中pTKRed包含A -Red重组酶表达框（乳糖操作子控制）和I-Scel核 酸酶表达框（阿拉伯糖操纵子控制），同时携带大观霉素抗抗性基因；PTKS/CS包含四环素 抗性基因，其中四环素抗性基因两侧含有25bp的染色体着落区片段（Landing pad region) 和I-Scel识别位点；pTKIP-cat含有氨苄霉素抗性基因和多克隆位点（可插入目的基因）， 其氨节霉素抗性基因和多克隆位点两侧也具有染色体着落区片段（Landing pad region) 和I-Scel识别位点，插入目的基因下游为氨苄霉素抗性基因，cat抗性基因的一侧（位于 抗性基因下游）具有flippse识别位点（FRT)。本申请中，将相应的目的基因置换敲除限 制葡萄糖合成酪氨酸的基因tyrR和trpED ;首先，pTKRed质粒导入到大肠杆菌中，诱导表 达出A-Red重组酶，含有重组序列的tetA基因在A-Red重组酶的作用下置换tyrR基因； 随后将携带目的基因的PTKIP导入上述含有tetA基因的菌种中，诱导表达出I-Scel核酸 酶；I-Scel核酸酶剪除位于染色体上的tetA基因和水解出位于质粒pTKIP上的目的基因， 然后再次诱导表达的A-Red重组酶将目的基因sts替换染色体上的tetA基因；同时完成 基因sts的替换重组后，利用相同的方法和工艺将目的基因tal-4cl替换染色体上的trpED 基因。总之，利用tetA作为中间过度基因片段完成目的基因sts替换大肠杆菌染色体上限 制葡萄糖合成酪氨酸的基因tyrR。
[0053] pTKIP-cat质粒在其插入片段包含抗性基因，正如上述的pTKIP质粒结构，插入 的目的基因下游为cat的抗性基因，同时目的基因和抗性基因的两侧为同源序列、染色体 着落区片段和识别片段（包括I-Scel核酸酶识别位点），最终染色体上插入的片段包括 目的基因和抗性基因，但可以在抗性基因cat的两侧引入flippse识别位点（flippase recognition target site)，根据文献(One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K_12using PCR products, Proc. Natl Acad. Sci.USA 2000 ;97:6640-6645)中的记载，利用pCP20质粒转化菌种，质粒pCP20诱导表达出的 FLP(flippase recombination enzyme)可识别cat抗性基因的两侧的flippse识别位点， 从而去除位于染色体上的抗性基因。
[0054] 结合以下实施例对本申请做进一步的说明；
[0055] 其中：LB培养基、M9培养基为生物技术实验的常规基础培养基，另外某些实验技 术步骤可以参照《分子克隆实验指南》和分子生物学实验手册。
[0056] 实施例1 :重组载体pTKIP-sts和pTKIP-tal_4cl的构建；
[0057] (1)从NCBI网站获得已报道的粘红酵母（Rhodotorula glutinis)的tal、欧序 (Petroselinum crispum)的4cl和葡萄（Vitis vinifera)的sts，经密码子优化后全合成 这3个基因（由上海捷瑞生物工程有限公司提供），得到克隆载体pUC57-tal、pUC57-4cl和 口1^57-8七8 ;基因七31、4(：1和8七8的序列如5￡〇10勵：1、5￡〇10勵：2和5￡〇10勵：3所 不。
[0058] (2)分别以携带目的基因的pUC57为模板扩增基因sts、tal和4cl，基因片段sts 与载体pETDuet-1经限制性内切酶BamH I和Xho I酶切、连接后，构建重组载体pET-sts ; 基因片段tal与载体pETDuet-1经限制性内切酶Nco I和Hind III酶切、连接后，构建重 组载体pET-tal ;基因片段4cl与pET-tal经限制性内切酶Nde I和Avr II酶切、连接后， 构建重组载体pET-tal-4cl。
[0059] (4)利用引物Duet-F与Duet-R，分别以重组载体pET-sts和pET-tal_4cl为模板 扩增包含T7启动子和T7终止子的sts、tal-4cl基因片段，将其分别与载体pTKIP-cat经 过限制性内切酶Apa I与Nhe I酶切、连接后，构建重组载体pTKIP-sts和pTKIP-tal_4cl。
[0060] h游引物 Duet-F :ATA GGGCCC TCGATCCCGCGAAATTAAT(SRQ ID NO: 4);划线加 粗序列为Apa I酶切位点；
[0061] 下游引物 Duet-R:
[0062] T G C GCTXGCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTC 01'111^604444440：0：1'(3￡〇10勵:5);划线加粗序列为他6 1酶切位点，斜体加粗序列为 FRT序列。
[0063] 实施例 2E. coli BW25113(A tyrR: :sts)的构建
[0064] (1)将质粒pTKS/CS双酶切线性化后作为模板，tyrR-CSl/tyrR-CS2为引物扩增四 环素抗性基因（tetA)。
[0065] tyrR-CSl ：GTGTCATATCATCATATTAATTGTTCTTTTTTCAGGTGAAGGTTCCCA tg TCACGAGGCCCTTTCTACCT (seq ID N〇：6);
[0066] tyrR-CSl ：TGGTGTTGCACCATCAGGCATATTCGCGCTTACTCTTCGTTCTTCTTC TGCGTTTTATTTGATGCCTTGG (SEQ ID NO：7)；
[0067] 其中，引物中，划线加粗为tetA基因两端的序列，划线加粗序列上游为大肠杆菌 染色体上tyrR基因的两侧的同源序列。
[0068] (2)E. coli BW25113/pTKRed 的构建：利用电转法将质粒 pTKRed 导入 E. coli BW25113(N〇vagen)菌株细胞内，涂布100mg/L大观霉素抗性平板，30摄氏度下培养12~ 16h〇
[0069] (3) tetA重组到菌株染色体上替代tyrR基因，达到tyrR敲除的目的：E. coli BW25113/pTKRed菌株按照1 %的比例接种于50mL的LB液体培养基内，待0D600~0. 3时， 加IPTG至终浓度为2mM ;待0D600~0. 6时制备电转化感受态细胞；感受态细胞制备完成 后，加10 yL步骤（1)制备的tetA片段与100 yL感受态细胞进行混合电转，复苏后，涂布 于含100mg/L大观霉素与10mg/L四环素的LB固体培养基，置于30摄氏度温箱培养12~ 16h〇
[0070] (4)次日经过菌落PCR验证并挑选出阳性菌株E.coli BW25113(AtyrR::tetA)/ pTKRed〇
[0071] (5)E. coli BW25113( A tyrR: :tetA)/pTKRed/pTKIP-sts 的构建：利用电转化将 质粒pTKIP-sts导入步骤（4)构建的重组菌株细胞内，复苏后的重组菌株涂布于含10mg/ L四环素、100mg/L大观霉素和100mg/L氨苄霉素的LB固体培养基，30摄氏度下温箱培养 12 ~16h〇
[0072] (6)将（5)构建的重组菌株挑于M9培养基（100mg/L大观霉素与100mg/L氨苄霉 素）内进行活化，次日按2%接种于20mL新鲜的M9培养基内（只加100mg/L大观霉素）。 待0D600~0. 6时加IPTG至终浓度2mM，L-阿拉伯糖至终浓度0. 2% (质量比），诱导过 夜。次日上午加入34mg/L氯霉素，待下午稀释菌液10 5,取100 y L稀释菌液涂布于34mg/ L氯霉素抗性平板，37摄氏度的温箱培养12~16h。
[0073] (7)挑取单菌落分别点于10mg/L四环素抗性平板、100mg/L氨苄霉素抗性平板 及34mg/L氯霉素抗性平板上。选择四环素抗性平板和氨苄霉素抗性平板不生长，而氯霉 素抗性平板上生长的菌落再经过PCR验证，验证正确的菌株进一步经测序验证，阳性菌株 E.coli BW25113(AtyrR::sts_cat)进行保藏。
[0074] (8)E. coli BW25113 ( A tyrR: : sts)的构建：敲除sts下游的氯霉素基因cat，以 免影响后续的重组验证工作。敲除cat的方法：利用电转化将质粒pCP20导入菌株细胞内； 电转复苏后涂布于l〇〇mg/L氨苄霉素抗性平板，置于30°C温箱培养12~16h，次日菌落PCR 验证cat基因的敲除，阳性菌株进行保藏；请见图1。
[0075] 上述 PCR验证的上游引物 tyrR-up :CTGTATGGCAITGAACTGGGGTAIT(SEQ ID N0:8);
[0076] 下游引物 tyrR-down :GCTGAACAmTCCCGAGTAITGAT(SEQ ID N0:9);
[0077] 这两对引物是tyrR两端的序列，参照图1所示，敲除前的扩增序列长度为2. 4kb， 敲除后（tetA重组）扩增序列长度为2. 3kb，sts-cat重组后扩增序列长度为4. Okb，cat敲 除后扩增序列长度为2. 7kb。
[0078] 实施例 3 :E. coli BW25113 ( A tyrR: : sts, A trpED: : tal_4cl)的构建
[0079] 采用实施例2中同样的构建方法，步骤如下：
[0080] (1)用于敲除trpED的tetA片段的扩增，所用引物为trpED-CSl与trpED-CS2。
[0081] trpED-CSl : CCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTGAACAAAATTAGAGAATAACAA TG TCACGAGGCCCTTTCTACGG (SEQ ID NO： 10)；
[0082] trpED-CS2 : ACGATTTTCGCTAAAACGGTTTGCATCATTTACCCTCGTGCCGCCAGT GCCGTTTTATTTGATGCCTTGG (SEQ ID NO： 11)；
[0083] 其中，引物中，划线加粗为tetA基因两端的序列，划线加粗序列上游为大肠杆菌 染色体上trpED基因的两侧的同源序列。
[0084] (2)E. coli BW25113( A tyrR: :sts)/pTKRed 的构建，同实施例 2(2)
[0085] (3)将步骤（1)获得的tetA重组到trpED基因的位置，并构建E. coli BW25113( A tyrR: :sts, A trpED: :tetA)/pTKRed，构建方法同实施例 2 的步骤（3)与（4)。
[0086] (4)E.coli BW25113(A tyrR::sts， A trpED::tetA)/pTKRed/pTKIP-tal_4cl 的 构建：利用电转化将质粒pTKIP-tal-4cl导入（3)构建的重组菌株细胞内。
[0087] (5) tetA的敲除与tal-4cl_cat的重组工作，同实施例2 (6)。
[0088] (6)同实施例2,选择四环素抗性平板和氨苄霉素抗性平板不生长，而氯霉素抗性 平板上生长的菌落进行PCR验证，验证正确的菌株进一步经测序验证，阳性菌株E. coli BW 25113(AtyrR::sts, AtrpED::tal_4cl_cat)进行保藏。
[0089] 上述 PCR 验证上游引物 trpED-up :CGAGGAACTCACACATTAGC(SEQ ID N0:12);
[0090] 下游引物 trpED-down :CGGTCAGCACCCCCATCTCC(SEQ ID N0:13);
[0091] 这两对引物是trpED两端的序列，敲除前扩增序列长度为4. 2kb，敲除后（tetA重 组）扩增序列长度为2. 5kb，tal-4cl_cat重组后扩增序列长度为6. 7kb，cat敲除后扩增序 列长度为5.4kb。
[0092] (7)E. coli BW25113 ( A tyrR: : sts, A trpED: : tal_4cl)的构建：敲除 tal_4cl 下 游的cat，同实施例2 (8)，见图2。
[0093] 实施例 4E. coli BW25113 ( A tyrR: : sts, A trpED: : tal_4cl)菌种诱导表达情况
[0094] 芪合酶sts基因序列长度为1179bp，蛋白STS由392个氨基酸组成，相对分子量为 43. 12KDa ;酪氨酸解氨酶tal基因序列长度为2082bp，蛋白TAL由693个氨基酸组成，相对 分子量为76. 23KDa ;4_香豆酸：辅酶A连接酶4cl基因序列长度为1632bp，4-香豆酸：辅 酶A连接酶由543个氨基酸组成，相对分子量为59. 73Kda。
[0095] 将实施例 3 制备的 E. coli BW25113 (A tyrR: : sts, A trpED: : tal_4cl)和 E. coli BW25113,分别接种于液体LB培养基内，37°C培养15h后，按1 %接种于新鲜液体LB培养基 内（100倍扩大），37°C培养近2h后，添加终浓度为ImM的IPTG进行诱导，诱导4. 5小时后 结束，并行SDS-PAGE电泳检测。菌体中蛋白质表达情况请见附图3所示的电泳图。
[0096] 发酵检测白藜芦醇的产量；
[0097] 1)将制备的 E. coli BW25113 ( A tyrR: : sts, A trpED: : tal_4cl_cat)与 E. coli BW25113按1 %的接种量分别接种于液体LB培养基内，220rpm，30°C，培养12~16h。
[0098] 取活化后的菌液按1 %的接种量接于20mL发酵培养基内，37°C，220rpm，培养2h 后，加终浓度为ImM的IPTG，之后转入30°C进行培养，发酵48h后取样检测。
[0099] 发酵培养基如下：
[0100] 发酵培养基
[0101]
[0102] 另单独配制300g/L的MgS04 ? 7H20,400g/L的葡萄糖；每20mL发酵培养基内加 300g/L 的 MgS04 ? 7H20 200 y L，400g/L 的葡萄糖 200 y L。
[0103] 2)发酵样品的制备：
[0104] 取lmL菌液进行离心，8000rpm，10min，去上清，加lmL丙酮后，振荡，再置于超声清 洗机内进行超声3h。
[0105] 超声后的菌液离心，同上。取上清进行旋蒸干燥，再加lmL甲醇进行溶解，即得待 测样品。
[0106] 3)HPLC 检测
[0107] 仪器：依利特P1201高效液相色谱仪（P1201高压恒流栗、UV1201紫外-可见检测 器、手动进样阀和EC2006色谱数据工作站）
[0108] 色谱条件：层析住：Ultimate AQ-C18 (55 y m) (14X 150mm);流动相：42 % 甲醇， 58%水；流速：lmL/min ;柱温：35°C ;进样量：10 y L ;紫外检测器波长：306nm ;以E. coli BW 25113( A tyrR: :sts, A trpED: :tal_4cl_cat)菌种发酵样品为实验检测样品，以 E. coli BW25113菌种的发酵样品为对照检测样品。
[0109] 图4为白藜芦醇标准品（100mg/L)的检测图谱，图5为而E. coliBW25113(A tyrR ::sts，A trpED: :tal-4cl-cat)菌种发酵后样品的检测图谱，图6为对照E. coli BW25113 菌种的发酵后样品的检测图谱；白藜芦醇标准品（l〇〇mg/L)的峰（图4所示）保留时间为 10. 67417min，峰面积为8883. 54mv. sec，对照菌种的发酵样品（图6所示）的峰的保留时间 为峰保留时间10. 64917min，峰面积为0. 56mv. sec，实施例3制备的E. coli BW25113( A tyr R: :sts, A trpED: :tal_4cl_cat)所得的发酵样品的峰（图5所示）保留时间10. 65250min， 峰面积65. 03mv. sec ;所制备的菌种的发酵样品中的白藜芦醇较空白菌种样品中的量有较 大提尚。
[0110] 本发明虽然已以较佳实施例公开如上，但其并不是用来限定本发明，任何本领域 技术人员在不脱离本发明的精神和范围内，都可以利用上述揭示的方法和技术内容对本发 明技术方案做出可能的变动和修改，因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明 的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化及修饰，均属于本发明技术方案 的保护范围。
【主权项】
1. 一种合成白藜芦醇的基因工程菌，其特征是，该基因工程菌是在E. coli BW25113菌 种中敲除限制葡萄糖合成酪氨酸的基因 tyrR和trpED，并且其染色体重组有粘红酵母的酪 氨酸脱氨酶基因 tal、欧芹的4-香豆酸：辅酶A连接酶基因4cl和葡萄的芪合酶基因 sts ; 该基因工程菌以葡萄糖为底物合成白藜芦醇。2. 如权利要求1所述的一种合成白藜芦醇的基因工程菌，其特征是，所述的酪氨酸脱 氨酶基因 tal置换敲除所述限制葡萄糖合成酪氨酸的基因 tyrR ;所述4-香豆酸：辅酶A连 接酶基因4cl和芪合酶基因 sts置换敲除所述限制葡萄糖合成酪氨酸的基因 trpED。3. 如权利要求1或2所述的一种合成白藜芦醇的基因工程菌，其特征是，所述的酪氨 酸脱氢酶基因 tal的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示；所述4-香豆酸：辅酶A连接酶基因 4cl的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示；所述的芪合酶基因 sts核苷酸序列如SEQ IN NO: 3 所示。4. 构建权利要求1-3所述合成白藜芦醇的基因工程菌的方法，其特征是，步骤如下： 1) 分别获取芪合酶基因 sts、酪氨酸脱氢酶基因 tal和4-香豆酸：辅酶A连接酶基因 4cl，并构建重组质粒pET-sts和pET-tal-4cl ; 2) 以步骤1)中重组质粒pET-sts和pET-tal-4cl为模板分别PCR扩增出携带有T7启 动子和终止子的sts基因片段和tal-4cl基因片段，然后将所述扩增后的基因片段导入质 粒 pTKIP-cat 中并构建重组质粒 pTKIP-sts-cat 和 pTKIP-tal-4cl_cat ; 3) 以线性化的质粒pTKS/CS为模板，分别用含有基因 tyrR和trpED同源重组序列的引 物PCR扩增出分别带有同源重组序列的四环素抗性基因 tetA序列； 4) 将步骤3)带有基因 tyrR同源重组序列的tetA序列转化于携带pTKRed质粒 的E. coli BW25113菌株细胞中，并筛选出阳性菌株E. coli BW25113(AtyrR::tetA)/ pTKRed ;其中，所述携带pTKRed质粒的E. coli BW25113菌株在转化前经IPTG诱导； 5) 将步骤2)中构建的重组质粒pTKIP-sts-cat转化于步骤4)中阳性菌种E.coli BW25113( Λ tyrR: :tetA)/pTKRed的菌株细胞中，然后涂布于含有抗生素的固体培养基上 后培养； 6) 将步骤5)中培养基上的重组菌种置于含有大观霉素和氨苄霉素的M9培养基中活 化，后接种于只含有大观霉素的M9培养基中，待0D 6。。~0. 6时加入IPTG和L-阿拉伯糖诱 导过夜后，再加入氯霉素培养后，涂布于含有氯霉素抗性平板中培养过夜； 7) 挑取步骤6)中菌落中分别点于四环素抗性平板、氨苄霉素抗性平板及氯霉 素抗性平板上后培养，选择四环素抗性平板和氨苄霉素抗性平板不生长，而氯霉素抗 性平板上生长的菌落再经过PCR验证后，进一步经测序验证后，得到阳性菌种E.coli BW25113(AtyrR::sts_cat);然后，敲除菌种 E.coli BW25113(AtyrR::sts_cat)中基因 sts下游的氯霉素基因 cat，获得菌种E.coli BW25113( Λ tyrR:: sts); 8) 利用步骤7)制备的菌种E.coli BW25113( Λ tyrR: : sts)导入质粒pTKRed并构建 E. coli BW25113 (Λ tyrR: : sts) /pTKRed菌种，然后将带有基因 trpED同源重组序列的tetA 序列采用步骤4)中同样的方法导入上述菌种中并构建得到E.coli BW25113( Λ tyrR:: sts ，Λ trpED: : tetA)/pTKRed 菌种； 9) 将步骤2)中所述的重组质粒pTKIP-tal-4cl-cat转入步骤8)中构建的E. coli BW 25113 (Λ tyrR:: sts, Λ trpED:: tetA) /pTKRed菌种中并获得菌种E. coli BW25113 (Λ tyrR: :sts, Λ trpED: : tetA)/pTKRed/pTKIP-tal-4cl_cat，并采用步骤 5)-7)的方法获得阳性菌 种 E.coli BW25113(AtyrR::sts, AtrpED::tal_4cl_cat);随后米用步骤 7)中同样的 方法敲除tal-4cl基因下游的氯霉素基因cat，获得合成白藜芦醇的基因工程菌E.coli BW 25113 ( Δ tyrR::sts, Λ trpED::tal_4cl)〇5. 如权利要求4所述的构建合成白藜芦醇的基因工程菌的方法，其特征是，所述步骤 2) 中PCR所用正向引物如SEQ NO ID:4所示，反向引物如SEQ NO ID:5所示。6. 如权利要求4所述的构建合成白藜芦醇的基因工程菌的方法，其特征是，所述步骤 3) 中用于PCR扩增含有基因 tyrR同源重组序列的正向引物如SEQ NO ID:6所示，反向引物 如 SEQ NO ID:7 所示。7. 如权利要求4或6所述的构建合成白藜芦醇的基因工程菌的方法，其特征是，所述步 骤3)中用于PCR扩增含有基因 trpED同源重组序列的正向引物如SEQN0ID:10所示，反 向引物如SEQ NO ID: 11所示。8. 如权利要求4所述的构建合成白藜芦醇的基因工程菌的方法，其特征是，所述步骤 4) 中携带pTKRed质粒的E. coli BW25113菌种首先接种于LB液体培养基中，待0D6。。~0. 3 时，加 IPTG至终浓度为2mM ;继续诱导培养，待0D600~0. 6时，制备用于转化的感受态细 胞。9. 如权利要求4所述的构建合成白藜芦醇的基因工程菌的方法，其特征是，所述步 骤6)中IPTG的终浓度为2mM，L-阿拉伯糖的终浓度为0. 2% ;所述的大观霉素的浓度为 100mg/L，所述氨苄霉素的浓度为100mg/L，所述氯霉素的浓度为34mg/L。10. 如权利要求4所述的构建合成白藜芦醇的基因工程菌的方法，其特征是，步骤7)和 步骤9)中所述敲除氯霉素基因 cat的方法如下： 将质粒PCP20转化入菌种细胞中并涂布于氨苄霉素抗性平板上，置于温箱中培养后， 经菌落PCR验证后筛选得到阳性菌种。
【文档编号】C12N15/60GK106032525SQ201510107705
【公开日】2016年10月19日
【申请日】2015年3月12日
【发明人】朱宝泉, 刘学珍, 林军, 胡海峰, 周斌
【申请人】上海医药工业研究院, 中国医药工业研究总院