一种氰醇裂解酶、其制备方法及应用
【专利摘要】本发明提供了一种氰醇裂解酶、其制备方法及应用。具体地，获得一种突变的氰醇裂解酶，实验结果表明，所述突变的氰醇裂解酶的催化活性是野生型的氰醇裂解酶的200％以上。
【专利说明】
一种氰醇裂解酶、其制备方法及应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种氰醇裂解酶及其应用。
【背景技术】
[0002] 氰醇裂解酶是一种在化工生产中非常有用的工业用酶，其天然活性是催化氰醇的 裂解并释放出氢氰酸。氰醇裂解酶可以催化逆反应，即HCN与醛酮的加成，得到具有光学活 性的a-氰醇产物。
[0003] 天然的S-氰醇裂解酶存在于橡胶、木薯和高粱等少数几种植物组织中，丰度 低，纯化难度大。1995年，Wajant采用五步纯化法从木薯中分离得到了木薯氰醇裂解酶 MeHNL(Plant Sci.，1995, 108, 1) ;White等人采用三步法从木薯叶中提取了 MeHNL，采用 盐析和透析的方式得到了酶液，但是应用于化学催化的立体选择性不高（Plant Physiol 1998,116,1219)。来源于木薯（Manihot esculenta)的氰醇裂解酶（MeHNL)是一种 S-氰 醇裂解酶，已有文献报道将MeHNL用于催化S-型手性氰醇的化学合成，ee值〉99%，具有 重要的应用价值，例如S-间苯氧基苯甲醛氰醇是新型菊酯类农药的通用中间体。1993年， Wajant等人报道了编码MeHNL的cDNA序列和蛋白序列。
[0004] 采用微生物作为宿主菌是快速大量的得到氰醇裂解酶的有效方法。Effenberger 等人1996年在大肠杆菌中报道了 MeHNL在大肠杆菌中的重组表达，但是蛋白多为包涵体， 可溶性蛋白含量较低（Angew 1996,35,437)。陈树华等2001年将MeHNL基因克隆到质粒 pPic9K，实现了在酵母菌中的表达（生物工程学报，2001，17 (1)，78)，但是酶活仍然不够 高，难以达到实际应用的要求。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种氰醇裂解酶、其制备方法及应用。
[0006] 本发明的第一方面，提供了一种突变的氰醇裂解酶，所述突变的氰醇裂解酶在野 生型的氰醇裂解酶的对应于SEQ ID N0. : 1的第60位谷氨酸（E)、第128位色氨酸（W)、第 220位异亮氨酸（I)发生突变。
[0007] 在另一优选例中，所述氰醇裂解酶为木薯氰醇裂解酶（MeHNL)。
[0008] 在另一优选例中，所述第60位谷氨酸（E)突变为甘氨酸（G);和/或
[0009] 第128位色氨酸（W)突变为丙氨酸（A);和/或
[0010] 第220位异亮氨酸（I)突变为亮氨酸（L)。
[0011] 在另一优选例中，所述突变的氰醇裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID N0. : 5所示。
[0012] 在另一优选例中，所述突变的氰醇裂解酶的催化活性为同等条件下相应的野生型 氰醇裂解酶催化活性的150%~350%，优选地为180%~220%。
[0013] 本发明的第二方面，提供了一种多核苷酸分子，所述多核苷酸选自下组：
[0014] (a)编码如SEQ ID N0. : 5所示多肽的多核苷酸；
[0015] (b)序列如SEQ ID N0. :2或7所示的多核苷酸；
[0016] (c)核苷酸序列与SEQ ID NO. : 2或7所示序列的同源性彡95% (较佳地彡98%)， 且编码SEQ ID N0. : 1或5所示多肽的多核苷酸；
[0017] (d)与（a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
[0018] 本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明第二方面所述的核酸 分子。
[0019] 在另一优选例中，所述载体为PET28。
[0020] 在另一优选例中，所述载体还包括色氨酸启动子Trp2 ;优选地所述色氨酸启动子 Trp2的核苷酸序列如SEQ ID N0. :6所示
[0021] 本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第三方面所 述的载体或染色体整合有本发明第二方面所述的核酸分子。
[0022] 在另一优选例中，所述宿主细胞为原核细胞、或真核细胞。
[0023] 在另一优选例中，所述原核细胞为大肠杆菌。
[0024] 本发明的第五方面，提供了一种制备本发明第一方面所述的突变的氰醇裂解酶的 方法，其特征在于，包括步骤：
[0025] (i)在适合的条件下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而表达出所述的突 变的氰醇裂解酶；和
[0026] (ii)分离所述的突变的氰醇裂解酶。
[0027] 本发明的第六方面，提供了一种酶制剂，所述酶制剂包含本发明第一方面所述突 变的氰醇裂解酶。
[0028] 在另一优选例中，所述酶制剂还包括选自下组的一种或多种组分：柠檬酸，苹果 酸，和丁二酸。
[0029] 本发明的第七方面，提供了本发明第一方面所述的突变的氰醇裂解酶、如本发明 第六方面所述的酶制剂的用途，用于制备具有光学活性的S-氰醇产物。
[0030] 在另一优选例中，所述用途还包括催化HCN与醛酮的加成反应。
[0031] 本发明的第八方面，提供了一种制备S-氰醇的方法，包括步骤：
[0032] (1)将本发明第一方面所述的突变的氰醇裂解酶与反应底物接触，进行催化反应， 从而生成所述S-氰醇；
[0033] (2)分离并纯化所述S-氰醇产物。
[0034] 在另一优选例中，所述步骤（1)中，所述反应底物包括间苯氧基苯甲醛，和/或丙 酮氰醇。
[0035] 在另一优选例中，所述步骤（1)中，催化反应的温度为0-20°C。
[0036] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0037] 图1A显示了实施例1中PCR扩增产物的凝胶电泳图谱。
[0038] 图1B显示了本发明突变的氰醇裂解酶的凝胶电泳图谱。
[0039] 图2显示催化活性测定曲线。
[0040] 图3显示了本发催化反应的HPLC检测结果。
[0041] 图4显示了本发明所构建的质粒图谱。
【具体实施方式】
[0042] 本发明人通过广泛而深入的研究，意外地获得一种突变的氰醇裂解酶，实验结果 表明，所述突变的氰醇裂解酶的催化活性是野生型的氰醇裂解酶的200%以上。本发明还提 供了所述突变的氰醇裂解酶的用途。
[0043] 具体地，本发明对MeHNL的序列针对大肠杆菌进行了密码子优化，并根据定向进 化的方法在MeHNL的DNA序列中引入随机突变，筛选突变体文库得到最优序列，发现对其中 的60位突变为G，128位氨基酸突变为A，220位突变为L。并将该序列克隆到了大肠杆菌质 粒，启动子为色氨酸启动子Trp2,转化导入大肠杆菌，进行高密度发酵。采用这种方式得到 的MeHNL，比酶活高达300u/mL，高于已知的异源表达的氰醇裂解酶，且发酵周期短，不需要 诱导剂，成本低。
[0044] 在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这 类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并 且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
[0045] 除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域 的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语 "约"意指该值可以从列举的值变动不多于1 %。例如，如本文所用，表述"约100"包括99 和101和之间的全部值（例如，99. 1、99. 2、99. 3、99. 4等）。
[0046] 虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法 和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
[0047] 氰醇裂解酶
[0048] 氰醇裂解酶（Hydroxynitrile lyase)主要来源于橡胶、木薯和高粱等少数几种植 物组织。主要包括：木薯氰醇裂解酶（MeHNL)、漆树氰醇裂解酶（HbHNL)、杏仁氰醇裂解酶 (PaHNL) 〇
[0049] 在本发明优选的实施方式中，所述氰醇裂解酶为木薯氰醇裂解酶。
[0050] 在本发明优选的实施方式中，优选地木薯氰醇裂解酶野生型序列如下：
[0053] 在本发明的优选的实施方式中，所述突变的氰醇裂解酶的序列如下：
[0054]
[0055] 氰醇裂解酶基因序列优化
[0056] 在本发明中，提供了优化的、特别适合在大肠杆菌细胞中表达的氰醇裂解酶蛋白 的核酸编码序列。
[0057] 本发明人选用大肠杆菌偏好密码子，在不改变其氨基酸序列的前提下对氰醇裂解 酶的DNA序列进行了优化。然而，本发明人发现，仅依据密码子频率获得的优化序列并不完 全适合在大肠杆菌中表达。因此本发明人进行了二次优化，其中包括消除不利于表达的二 级结构（如发夹结构），改变基因中A+T组成、改变G+C含量等。
[0058] 经过大量测试和筛选，本发明人在众多优化序列中获得了一个特别优化的氰醇裂 解酶编码序列。所述优化的氰醇裂解酶的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，
[0060] 在本发明的一个优选实施方式中，编码本发明的突变型的氰醇裂解酶的多核苷酸 序列如下：
[0063] 载体和宿主细胞
[0064] 本发明还提供了一种包含本发明的优化的氰醇裂解酶基因的载体，以及含所述载 体的宿主细胞。
[0065] 在本发明的一个优选例中，所述述载体具有在大肠杆菌（更佳地在大肠杆菌 BL21(DE3)菌株）中表达的能力。
[0066] 本领域的普通技术人员可以使用的常规方法获得本发明的优化的氰醇裂解酶基 因序列，例如全人工合成或PCR法合成。一种优选的合成法为不对称PCR法。不对称PCR 法是用不等量的一对引物，PCR扩增后产生大量的单链DNA(SSDNA)。这对引物分别称为非 限制引物与限制性引物，其比例一般为50-100 : 1。在PCR反应的最初10-15个循环中，其 扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物（低浓度引物）消耗完后，非限制性引物（高浓 度引物）引导的PCR就会产生大量的单链DNA。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发 明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯 化扩增的DNA/RNA片段。
[0067] 本发明的多核苷酸序列可以通过常规的重组DNA技术，表达或生产目的蛋白，包 括步骤：
[0068] (1)用编码本发明蛋白的多核苷酸（或变异体），或用含有该多核苷酸的重组表达 载体转化或转导合适的宿主细胞，较佳地大肠杆菌细胞；
[0069] (2)在合适的培养基中培养宿主细胞；
[0070] (3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
[0071] 本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白的编码DNA序列和合适 的转录/翻译控制信号的表达载体，优选市售的载体：PET28。这些方法包括体外重组DNA 技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启 动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。 此外，表达载体优选包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的 表型性状。
[0072] 本发明还提供的重组载体，其包含本发明的经过优化的MeHNL DNA序列。在优选 的实施方式中，所述重组载体的启动子下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。需要表 达目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点，从而可操作地连接目的 基因与启动子。
[0073] 在另一优选的实施方式中，所述重组载体在5'到3'方向上包括：启动子，目的基 因和终止子。如果需要，所述重组载体还可以包括以下元件：蛋白纯化标签；3'多聚核苷 酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；选择标记（抗生素抗性基因、荧光蛋白 等）；增强子；或操作子。
[0074] 在本发明的一个优选的实施方式中，所述重组载体包括色氨酸启动子Trp2,优选 地，其序列如下：
[0076] 用于制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌 质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够 在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以被米用。
[0077] 本领域普通技术人员可以采用熟知的方法构建含有本发明启动子和/或目的基 因序列的载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。
[0078] 本发明的表达载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主转录目的RNA或表 达目的蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、链霉菌 属、农杆菌：或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般 技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技 术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物（如大肠杆菌）时，可以用CaCV法处理， 也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法， 常规机械方法（如显微注射、电穿孔、脂质体包装等）。转化植物也可使用农杆菌转化或基 因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器 官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。
[0079] 术语"可操作连接"是指将准备转录表达的目的基因以一种本领域的常规方式连 接到它的控制序列以被表达。
[0080] 工程菌的培养和目的蛋白发酵生产
[0081] 在获得工程细胞后，便可在适合的条件下培养工程细胞，表达本发明的基因序列 所编码的蛋白。根据宿主细胞的不同，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基，在适 于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法 (如温度转换或化学诱导）诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。工程细胞可以是快 速利用甲醇型（Mut +)或慢速利用甲醇型（Muts)。
[0082] 在本发明中，可采用常规的发酵条件。代表性的条件包括（但并不限于）：
[0083] (a)就温度而言，氰醇裂解酶的发酵及诱导温度保持在25_35°C ;
[0084] (b)就诱导期的pH值而言，诱导期pH控制在3-9 ;
[0085] (c)就溶氧（D0)而言，D0控制在20-90%，溶氧的维持可以用氧气/空气混合气 体的通入来解决；
[0086] (d)就补料而言，补料种类宜包括甘油、甲醇、葡萄糖等碳源，可单独补料或混合补 料；
[0087] (e)就诱导期IPTG浓度而言，常规诱导浓度都可用于本发明，通常iptg浓度控制 在 0? 1-1. 5mM ;
[0088] (f)就诱导时间而言，没有特别限制，通常为2-20小时，较佳地为5-15小时。
[0089] 本发明的目的蛋白氰醇裂解酶存在大肠杆菌细胞胞内，通过离心机收集宿主细 胞，然后通过高压、机器力、酶解细胞被或其他细胞破碎方法破碎宿主细胞，释放重组蛋白， 优选的是高压法。宿主细胞裂解液可通过盐析、超滤等方法进行初步纯化后再进行层析纯 化，也可直接进行层析纯化。
[0090] 层析技术包括阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和 层析等技术。常用的层析方法包括：
[0091] 1?阴离子交换层析：
[0092] 阴离子交换层析介质包括（但不限于）：Q_Sepharose、DEAE-Sepharose。如果发 酵样品的盐浓度较高，影响与离子交换介质的结合，则在进行离子交换层析前需降低盐浓 度。样品可以用稀释、超滤、透析、凝胶过滤层析等手段进行平衡缓冲液的更换，直至与对应 的离子交换柱平衡液系统相似，然后上样，进行盐浓度或pH的梯度洗脱。
[0093] 2?疏水层析：
[0094] 疏水层析介质包括（但不限于）：Phenyl_Sepharose、Butyl-Sepharose、 Octyle-Sepharose。样品通过添加NaCl、（NH 4)2S04等方式提高盐浓度，然后上样，通过降低 盐浓度方法洗脱。通过疏水层析除去疏水性有较大差异的杂蛋白。
[0095] 3.凝胶过滤层析
[0096] 疏水层析介质包括（但不限于）：Sephacryl、Superdex、Sephadex类。通过凝胶 过滤层析更换缓冲体系，或进一步精纯。
[0097] 4?亲和层析
[0098] 亲和层析介质包括（但不限于）：HiTrap? Heparin HP Columns。
[0099] 制备酶制剂组合物
[0100] 本发明还提供了一种酶制剂组合物，该酶制剂组合物中包含本发明的氰醇裂解 酶。
[0101] 本发明的酶制剂组合物还可以包含：柠檬酸、和/或乙酸。
[0102] S-氰醇的制备方法
[0103] 本发明还提供了一种S-氰醇的制备方法，所述方法包括步骤：
[0104] (1)将本发明的突变的氰醇裂解酶与反应底物接触，进行催化反应，从而生成所述 S-氰醇；
[0105] (2)分离并纯化所述S-氰醇产物。
[0106] 在本发明优选地实施方式中，所述步骤（1)中，所述反应底物为间苯氧基苯甲醛、 和丙酮氰醇（或，氰氢酸）。
[0107] 在本发明优选地实施方式中，所述步骤（1)中，催化反应的温度为0-20°C。
[0108] 本发明的主要优点在于：
[0109] (1)本发明的突变的氰醇裂解酶，催化反应活性远高于野生型的氰醇裂解酶，是野 生型的两倍左右；
[0110] (2)编码本发明的突变的氰醇裂解酶的多核苷酸序列，在大肠杆菌中表达量高，表 达稳定，能够显著降低制备氰醇裂解酶的成本。
[0111] (3)采用本发明的制备突变的氰醇裂解酶，周期短，成本低，适用于工业化生产。
[0112] 下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条 件如 Sambrook 等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和 份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获 得。
[0113] 实施例1突变体的构建
[0114] 根据Wajant报道的MeHNL的蛋白序列1 (SEQ ID N0. : 1)，根据大肠杆菌的密码子 偏好性，合成了 MeHNL DNA序列2(SEQ ID N0. :2)，克隆至质粒pET28(购自Invitrogene公 司）的Ndel-Hindlll位点。以该质粒为模板，设计引物，见序列3和序列4。使用随机诱 变试剂盒，通过改变MnS0 4浓度来进行多个反应，从而将1至3个点突变引入MeHNL基因， 使MeHNL酶氨基酸序列中1-3个氨基酸被替换。为扩增编码MeHNL酶，分别以引物SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4作为正向和反向引物。两个引物都含有与使用Gateway Technology 通过定点重组克隆获得的PCR扩增MeHNL基因片段相容的位点。PCR扩增产物的凝胶电泳 图谱如图1所示，获得扩增产物与预期相符。
[0115] 易错PCR扩增使用下述温度程序：94°C 2min，94°C 30s和68°C lmin的25个循 环，接着68°C lOmin。首先将易错PCR片段克隆进pDONR载体（购自Invitrogene公司）， 制备大规模口￡犯^(购自11^1廿呢 61^公司）质粒文库，起始超过20,000个菌落。然后以 pDEST 14为载体，将pENTR入门质粒文库构建为表达文库。然后将表达文库转入化学感受态 E. coil BL21Star(DE3)(购自Invitrogene公司），用于表达突变的MeHNL基因。
[0116] 转化大肠杆菌JM109 (DE3)，得到的Kana抗性的转化子，接种至LB培养基在37°C 进行培养。0D600 = 0. 6-1. 0之间时，加入IPTG至终浓度0.1 mM，降温至25-30°C，继续培养 16小时，4000rpm离心收集菌体。
[0117] 酶活测定：参考 Selmar 报道的方法（Analytical Biochemistry 166 (1987)， 208-211)，间苯氧基苯甲醛10mM，甲醇20uL，20mM柠檬酸缓冲液（pH5. 0)，丙酮氰醇50mM，粗 酶液10uL。上述反应液于25度温育，上述反应液于25度温育，分别在l-5min测定250nm 的吸光度变化。每分钟内催化产生lumole间苯氧基苯甲醛所需要的酶量定义为1个酶活 单位。变化速率最快的即为酶活最高的突变体。
[0118] 检测结果如图2所示，为突变体，▲为野生型，?为对照试验（不加酶）。突变体 酶活 / 野生型酶活=(0.2299-0. 086)八0. 1577-0. 086)*100%= 200.6%。
[0119] 从图中可以看出突变体的活性要显著高于野生型的活性，催化活性为野生型的 200%。测序获得该高活性的突变型为序列5 (SEQ ID N0. : 5)。
[0120] 本实施例中所用引物序列如下：
[0121] 正向引物：5' -GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTT CGA AGG AGA TAG AAC CAT GGT GAC CGC CCA TTT C-3, SEQ ID NO. :3 ；
[0122] 反向引物：5' -GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTC TTA AGC ATA AGC ACG GCC-3' SEQ ID NO. :4。
[0123] 实施例2菌种构建和高密度发酵
[0124] 合成含有序列6(3￡0 10勵.：6)的色氨酸启动子，并连接到？￡了28&的此〇1和制61 位点，然后分别将实施例1中的序列1和5的编码多核苷酸连接到前述的Ndel-Xhol位点， 得到含有串联色氨酸启动子的大肠杆菌质粒pTrp2-MeHNLl和pTrp2-MeHNL5 (质粒图谱如 图4所示）。将质粒转化大肠杆菌JM109 (购自Invitrogene公司），在Kana抗性平板上得 到相应的菌种，接种到LB培养基中，37°C过夜培养，用20%甘油保存菌种。
[0125] 将菌种接种于装有200mL LB培养基的1L摇瓶中，于37 °C，180-220rpm培养 10-16h。将上述培养好的种子按10% (v/v)的比例接种于3L上罐发酵培养基（M9)中 (葡萄糖4g/L，磷酸氢二钠12. 8g/L，磷酸二氢钾3g/L，氯化铵lg/L，硫酸钠0. 5g/L，氯化钙 0? 0152g/L，六水氯化镁 0? 41g/L。），在 25-35°C，300-800rpm，空气流量 2-6L/min 的条件下 培养。培养6-1011后，以5-2〇1111711的速率流加含60%甘油的补料培养基，持续至发酵结束。 流加补料培养基数小时至〇D_达到80-100时，放罐，5000rpm离心收集菌体。菌体裂解后 测定酶活，分别为73U/mg粗蛋白和143U/g粗蛋白。凝胶电泳检测与预期相符。
[0126] 实施例3MeHNL的固定化（交联酶聚集体，CLEA)
[0127] 分别取含有序列1和序列5的大肠杆菌50g湿菌体，重悬于200mL柠檬酸缓冲 液（50mM，pH 5. 5)，超声破菌，14000rpm离心30min收取上清液，加入硫酸铵固体至终浓 度60%，冰浴上搅拌15min，14000rpm离心收集沉淀。冰浴搅拌下，将蛋白硫酸铵沉淀加 入10%戊二醛的水溶液，离心收集沉淀，分别得到4. lg(序列1)和4. 5g(序列5)固定化 MeHNL〇
[0128] 实施例4-5固定化酶的使用（纯有机相）
[0129] 在 100mL MTBE (methyl tert-butyl ether，甲基叔丁基醚）（实施例 4)，或异丙醚 (实施例5)中，加入10mL间苯氧基苯甲醛，2.5g MeHNL固定化酶（序列5)，5mL丙酮氰醇， 20°C搅拌反应，搅拌速度为400-500rpm。反应4小时取样用HPLC检测反应转化率，过滤回 收固定化酶，投入下一批次。重复使用的情况见表1。
[0130]
[0131]
[0132] 注：A为突变型；WT为野生型。液相色谱检测，转化率计算方式为，转化率=产物 八产物+底物）*1〇〇%。
[0133] 实施例6-7固定化酶的使用（水+有机相）
[0134] 在50mL柠檬酸溶液（50mM，pH5)中，加入10mL间苯氧基苯甲醛，5g MeHNL (序列 1)固定化酶，5mL氰氢酸，分别加入50mL MTBE (实施例6)，或50mL异丙醚（实施例7)，20°C 搅拌反应，搅拌速度为400-500rpm。反应4小时后取样用HPLC检测转化率，结束反应后，过 滤回收固定化酶，投入下一批次。重复使用的情况见表2。
[0135] 表 2
[0136]
[0138] 根据实施例4-7的结果，本发明优选的反应体系为MTBE有机相；反应条件为： CLEA固定化酶为催化剂，MTBE为溶剂，底物为间苯氧基苯甲醛，丙酮氰醇（或，氰氢酸）， 20°C反应3-5小时，搅拌速度为400-500rpm。反应体系中间苯氧基苯甲醛浓度为0. 1-1. 2 摩尔/升，丙酮氰醇浓度为〇. 2 - 2摩尔/升），而且丙酮氰醇的浓度是间苯氧基苯甲醛浓 度的1. 5-3倍。
[0139] 实施例9分析检测
[0140] 采用高效液相色谱（HPLC)法监测反应：以水和乙腈（45:55)为流动相，色谱柱为 0DS-18反相柱，岛津LC-15C高效液相色谱，210nm下检测紫外吸收；反应体系用水和乙腈 (45:55)进行稀释，离心并用尼龙膜过滤后进样检测。在本发明优选地反应体系中，HPLC检 测反应进程（图3):反应1小时后，检测，17. 3min为间苯氧基苯甲醛，17. 5min为S-构型 氰醇.
[0141] 手性纯度采用Agilent 1260液相色谱进行分析，检测条件为：Chiralpak AD-H 柱，正己烧：乙醇（0. 1% DEA) = 90:10,0. 8mL/min，检测波长为220nm。经过比对本发明制 得的S-构型的产物与目标物质标准品（购自江西科苑生物药业有限公司）一致。
[0142] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 一种突变的氰醇裂解酶，其特征在于，所述突变的氰醇裂解酶在野生型的氰醇裂解 酶的对应于SEQ ID NO. : 1的第60位谷氨酸（E)、第128位色氨酸（W)、第220位异亮氨酸 (I)发生突变。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氰醇裂解酶为木薯氰醇裂解酶 (MeHNL)〇3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第60位谷氨酸（E)突变为甘氨酸（G); 和/或 第128位色氨酸（W)突变为丙氨酸（A);和/或 第220位异亮氨酸（I)突变为亮氨酸（L)。 优选地，所述突变的氰醇裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO. :5所示。4. 一种多核苷酸分子，其特征在于，所述多核苷酸选自下组： (a) 编码如SEQ ID NO. : 5所示多肽的多核苷酸； (b) 序列如SEQ ID NO. :2或7所示的多核苷酸； (c) 核苷酸序列与SEQ ID NO. :2或7所示序列的同源性彡95% (较佳地彡98% )，且 编码SEQ ID NO. : 1或5所示多肽的多核苷酸； (d) 与（a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。5. -种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求4所述的核酸分子。6. -种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求5所述的载体或染色体整 合有权利要求4所述的核酸分子。7. -种制备权利要求1所述的突变的氰醇裂解酶的方法，其特征在于，包括步骤： (i) 在适合的条件下，培养权利要求4所述的宿主细胞，从而表达出所述的突变的氰醇 裂解酶；和 (ii) 分离所述的突变的氰醇裂解酶。8. -种酶制剂，其特征在于，所述酶制剂包含权利要求1所述突变的氰醇裂解酶。9. 如权利要求1所述的突变的氰醇裂解酶、如权利要求8所述的酶制剂的用途，其特征 在于，用于制备具有光学活性的S-氰醇产物。10. -种制备S-氰醇的方法，其特征在于，包括步骤： (1) 将权利要求1所述的突变的氰醇裂解酶与反应底物接触，进行催化反应，从而生成 所述S-氰醇； (2) 分离并纯化所述S-氰醇产物。
【文档编号】C12P13/00GK106032531SQ201510481026
【公开日】2016年10月19日
【申请日】2015年8月7日
【发明人】田振华, 罗煜, 丁时诚, 瞿旭东
【申请人】南京博优康远生物医药科技有限公司