一种小激活rna及其制备方法和应用

文档序号:10665084阅读:562来源:国知局
一种小激活rna及其制备方法和应用
【专利摘要】本发明提供了一种小激活RNA,所述小激活RNA由包含25~30个核苷酸的正义序列和包含25~30个核苷酸的反义序列组成,所述反义序列中至少有80%的序列与所述正义序列形成互补;所述正义序列或反义序列中包含具有19~25个核苷酸的匹配片段,所述匹配片段至少有80%的序列与靶基因调控序列的片段互补。本发明的作为Dicer底物的小激活RNA能在转录和表观遗传水平激活基因表达,有效地模仿内源性双链小RNA的自然成熟过程,并有效提高RNA激活的效率。
【专利说明】
_种小激活RNA及其制备方法和应用
技术领域
[0001 ] 本发明涉及分子生物学领域,具体涉及双链小RNA在RNA激活技术领域的应用。
【背景技术】
[0002] 1998年Fire和Mello在线虫中发现了双链小RNA分子(dsRNA)能触发一种进化 保守的基因表达沉默机制,该机制被称为RNA干扰(RNAi),这种小RNA分子被称为小干扰 RNA(siRNA)。由于siRNA能够特异性地沉默靶基因的表达,因而被认为非常有希望开发成 新的治疗疾病的基因靶向药物。RNA干扰是通过内源性dsRNA分子或者是外源性导入siRNA 而触发的。内源性的dsRNA是由更长的单链RNA在形成发卡型结构后被细胞内的一种称为 Dicer的蛋白处理而成的。由细胞外将成熟的siRNA引入细胞也可以触发RNA干扰。这些 成熟的dsRNA在细胞内被一种称为Argonaute (AGO)的蛋白装载,然后dsRNA引导AGO与 细胞浆内序列互补的mRNA序列结合,AGO进而切割并降解mRNA,导致基因表达沉默。2006 年Li等发现针对于基因调控序列如启动子的dsRNA能触发与RNA干扰完全相反的作用, 即在基因转录及表观遗传水平增加基因表达,并命名该现象为RNA激活(RNAa),将这种针 对基因启动子的小RNA称为小激活RNA (small activating RNA,saRNA)。saRNA为小的双 链RNA,长度为21个核苷(nt),并在3'末端含有2个核苷酸的脱氧核糖核酸(DNA)突出。 saRNA导入细胞后也需要AGO蛋白参与其作用,与AGO形成saRNA-AGO复合物,该复合物进 入胞核后,结合到染色体上的靶位点,例如结合到基因的启动子区域,然后AGO蛋白募集其 他蛋白如RNA聚合酶II,组蛋白修饰因子等形成RNA介导的转录激活复合物(RNA-induced transcriptional activation, RITA),最终触发基因转录增加和表观遗传的活化。除 了从细胞外导入,saRNA也存在于细胞内。典型的例子是长度为20-26个核苷酸的微小 RNA(miRNA)。miRNA由基因组转录生成长度为80多到几千个核苷酸的原miRNA(primary miRNA)。在经过Drosha/DGCR8复合物处理后,原miRNA成为长度为80核苷酸左右的miRNA 前体(precursor miRNA)。前体miRNA经过Exportin5转运到胞衆,经过一种被称为Dicer 的酶处理,而生成成熟的miRNA。这些miRNA也可以通过RNA激活机制参与基因表达调控。 由于RNA激活能够有目的地激活基因表达,因此RNA激活可以被用作一种分子工具来研究 基因功能,治疗各种疾病如癌症,及对细胞进行重新编程。
[0003] 在申请号为US 60/671,666、授权专利号为8, 877, 721的美国专利申请,以及申请 号为PCT/US2006/013559的专利申请中公开了一种将至少一种saRNA分子导入细胞核内来 激活目的基因表达的方法。该saRNA分子包含一条和基因的非编码区互补的核糖核苷酸分 子。saRNA结合的区域被选择用来激活基因的表达。在核糖核苷酸的3'端通常有两个突出 碱基,且不和目的基因的非编码区互补,比如两个脱氧核糖核苷酸dTdT。核苷酸分子的互补 区域大于14个碱基,少于21个碱基。saRNA分子是一种双链分子,它的第二条链和第一条 链互补形成双链,在两条链的3'端至少有2个突出碱基。saRNA分子也可以以单链分子的 形式存在,这种单链分子可以形成双链结构。这种单链核酸分子的第一部分区域由核糖核 苷酸组成,并和目的基因的非编码区互补结合,第二部分区域和第一部分区域互补,形成双 链结构。在这种单链核酸分子的3'端至少有两个突出碱基。但是,根据上述专利申请设计 的saRNA分子存在以下问题:1)设计效率不高,按照上述saRNA设计规则设计saRNA的成 功率仅为10%~20%;2)按照上述^1^4设计规则设计的^1^4对靶基因激活效果低下。
[0004] 尽管RNA激活具有巨大的潜在用途,但目前对于很多基因的RNA激活存在效率低 下的问题。一方面可能是因为saRNA需要进入胞核发挥作用;另一方面,也可能是现有技术 设计的saRNA与内源性自然发生的saRNA的序列组成、化学结构等方面仍然有较大差别。

【发明内容】

[0005] 针对目前saRNA在设计和应用中存在的saRNA设计成功率低以及RNA激活效 率低下的问题,本申请提供了一种dsaRNA的设计方法,以提高RNA激活的效率,扩展RNA 激活的用途。根据本发明的saRNA实质上为作为Dicer底物的saRNA (dicer substrate saRNA, dsaRNA),为了与现有技术的saRNA相区分,本发明的发明人将其命名为Dicer底物 saRNA,如无特别指明,在本发明中作为Dicer底物的saRNA以dsaRNA表示 。
[0006] -种小激活RNA,其由包含25~30个核苷酸的正义序列和包含25~30个核苷酸 的反义序列组成,所述反义序列中至少有80%的序列与所述正义序列互补;所述正义序列 或反义序列包含具有19~25个核苷酸的匹配片段,所述匹配片段中至少有80%的序列与 靶基因调控序列的靶位点匹配。应当理解,本发明所述的靶基因调控序列是指位于细胞核 内的DNA上,对于基因转录启动或者延伸起增强作用,或者能通过表观遗传机制对基因转 录起正性调控作用的DNA序列。
[0007] 优选地,所述正义序列和/或反义序列还含有1-5个脱氧核糖核苷酸;优选地,所 述正义序列和/或反义序列中位于3'末端的2个核苷酸为脱氧核糖核苷酸。发明人在研 究中发现在正义序列和/或反义序列中加入脱氧核糖核苷酸可以增加dsaRNA对细胞内RNA 酶降解的抵抗,增强其稳定性。
[0008] 优选地,所述靶基因调控序列片段是靶基因启动子序列片段;优选地,所述靶基因 启动子序列片段选自自靶基因转录起始点起上游前5000个碱基到自靶基因转录起始点起 上游前一个碱基形成的启动子区域。
【申请人】在研究中发现由于该区域含有基因转录所需的 特定序列,包括RNA聚合酶或者转录因子结合位点,从而使针对该区域设计的dsaRNA具有 更高的激活效率。
[0009] 根据本发明的一个实施方案中,所述dsaRNA的靶基因为人基因p21 ;优选地,所述 靶基因的靶位点序列选自 SEQ ID N0:64、SEQ ID N0:65、SEQ ID N0:66、SEQ ID N0:67、SEQ ID NO:68 或 SEQ ID NO:69。
[0010] 在根据本发明的一个实施方案中,所述dsaRNA的正义序列和反义序列选自以下 组合之一:
[0011] 正义序列为3£〇10勵:2,反义序列为3£〇10勵:3;
[0012] 正义序列为3£〇10勵:4,反义序列为3£〇10勵:5;
[0013] 正义序列为3£〇10勵:6,反义序列为3£〇10勵:7;
[0014] 正义序列为3£〇10勵:8,反义序列为3£〇10勵:9;
[0015] 正义序列为SEQ ID N0:10,反义序列为SEQ ID N0:11 ;
[0016] 正义序列为SEQ ID NO: 12,反义序列为SEQ ID NO: 13。
[0017] 在根据本发明的一个实施方案中,所述靶基因为人胰-十二指肠同源盒基因 PDX1 ;优选地,针对所述人胰-十二指肠同源盒基因roXl的dsaRNA的正义序列和反义序列 选自以下组合之一:
[0018] 正义序列为SEQ ID N0:54,反义序列为SEQ ID N0:55 ;
[0019] 正义序列为SEQ ID NO: 56,反义序列为SEQ ID NO: 57 ;
[0020] 正义序列为SEQ ID NO: 58,反义序列为SEQ ID NO: 59 ;
[0021] 正义序列为SEQ ID NO: 60,反义序列为SEQ ID NO: 61 ;
[0022] 正义序列为SEQ ID NO: 62,反义序列为SEQ ID NO: 63。
[0023] 在根据本发明的一个实施方案中,所述靶基因为人的基因NKX3. 1 ;优选地,针对 所述基因NKX3. 1的小激活RNA的正义序列和反义序列选自以下组合之一:
[0024] 正义序列为SEQ ID N0:70,反义序列为SEQ ID N0:71 ;
[0025] 正义序列为SEQ ID NO: 72,反义序列为SEQ ID NO: 73 ;
[0026] 正义序列为SEQ ID NO: 74,反义序列为SEQ ID NO: 75 ;
[0027] 正义序列为SEQ ID NO: 76,反义序列为SEQ ID NO: 77 ;
[0028] 正义序列为SEQ ID NO: 78,反义序列为SEQ ID NO: 79。
[0029] 本发明进一步提供了上述的小激活RNA的制备方法,所述方法包括以下步骤:
[0030] 1)由靶基因的启动子序列片段选取长度为19~25nt的序列作为靶位点;
[0031] 2)合成与步骤1)所述的靶位点对应的核苷酸序列作为基础序列,在所述基础序 列的两侧添加核苷酸至长度为25~30nt,得到正义序列;
[0032] 3)合成长度为25~30nt的反义序列,并使所述反义序列中至少有80 %的序列与 步骤2)得到的正义序列互补;
[0033] 4)将步骤2)得到的正义序列与步骤3)得到的反义序列以相同的摩尔数在RNA退 火缓冲液中混合,加热至97°C,然后自然冷却至室温,即得到双链的小激活RNA。
[0034] 在根据本发明的一个实施方案中,在步骤2)中,合成所述正义序列和/或反义序 列时加入1~5个脱氧核糖核苷酸;优选地,所述正义序列和/或反义序列中位于3'末端 的2个核苷酸为脱氧核糖核苷酸。
[0035] 另一方面,根据本发明的小激活RNA可应用于制备增加靶基因表达的药物,优选 为应用于制备抗肿瘤药物。
[0036] 再一方面,本发明还提供一种增加靶基因表达的方法,该方法包括将根据本发明 的作为Dicer底物的小激活RNA引入受试者的细胞。
[0037] 又一方面,本发明还提供一种预防和/或治疗肿瘤的方法,该方法包括将根据本 发明的作为Dicer底物的小激活RNA引入具有患有肿瘤风险和/或患有肿瘤的受试者的细 胞;优选地,所述肿瘤选自膀胱癌、前列腺癌及肝癌。
[0038] 本发明的发明人在研究中发现,细胞内存在内源性的双链小RNA,它们是从更长的 单链RNA经过多步处理而生成的。这些处理过程需要多个RNA酶的参与。最后一步处理是 包含27-70个核苷酸左右的具有发卡结构的RNA被一种称为Dicer酶的蛋白处理生成成熟 的、包含21~22个核苷酸的双链小RNA。因此,本发明人在研究中发现通过设计并合成比 现有技术中的21个核苷酸的saRNA更长的dsaRNA,当dsaRNA导入细胞后,
【申请人】发现它们 会被Dicer酶处理,生成了更自然saRNA,因而可以更有效地模仿内源性双链小RNA的自然 成熟过程,并有效地提高了 RNA激活的效率。
【附图说明】
[0039] 图la~b是根据本发明制备的dsaP21在p21基因启动子上的位置以及序列信息。 其中,图la显示dsaP21在人p21启动子区域的分布。图lb显示设计的dsaP21核酸双链 序列信息(黑色加粗的碱基表示脱氧核糖核苷酸)。
[0040] 图2是显示根据本发明制备的dsaRNA激活p2ImRNA表达效果的条形图。
[0041 ] 图3是显示根据本发明制备的dsaRNA激活p2ImRNA表达效果的条形图。
[0042] 图4是将根据本发明制备的dsaP21应用于抑制肿瘤细胞生长的效果的条形图,表 明dsaRNA能有效抑制肿瘤细胞生长。
[0043] 图5是将本发明制备的dsaP21转染PC-3细胞后抑制肿瘤细胞生长的细胞形态 图,表明dsaRNA能有效抑制肿瘤细胞增殖。
[0044] 图6是显示本发明制备的长度为23个核苷酸的核酸分子激活p21mRNA表达效果 的条形图。
[0045] 图7是显示本发明制备的长度为35个核苷酸的核酸分子激活p21mRNA表达效果 的条形图。
[0046] 图8是显示本发明制备的dsaPDXl激活非肿瘤相关基因roXlmRNA表达效果的条 形图。
[0047] 图9是显示本发明制备的dsaNKX3. 1激活前列腺癌细胞PC_3mRNA表达的效果条 形图。
[0048] 图10是将本发明制备的dsaNKX3. 1转染PC-3细胞后抑制肿瘤细胞生长的细胞形 态图,表明dsaRNA能有效抑制肿瘤细胞增殖。
【具体实施方式】
[0049] 为了更好地说明本发明,便于理解本发明的技术方案,现结合附图和实施例进一 步阐述本发明,应当理解,本发明的具体实施例仅是用于说明目的,而非对本发明的限制。
[0050] 实施例1
[0051] 材料和方法
[0052] 1. Dicer 底物 saRNA (dsaRNA)的设计:
[0053] 本发明的dsaRNA的靶位点的选择基于以下的原则:1.选取的靶序列为基因的正 义序列;2.指导RNA链(guide RNA strand)的5'端和祀序列的3'端结合;3.革E序列的 GC含量为40-65%;4.避免靶序列包含有4个及以上连续重复的碱基序列;5.靶序列的3' 比5'端的热动力学稳定性低。6.选取的靶位点应该避免CpG岛以及高GC的区域。
[0054] 在基因启动子区域,设计的靶位点的序列长度为19个到25个碱基。选取的基因 启动子区域为转录起始位点上游5000个碱基到基因转录起始位点前一个碱基。
[0055] 以p21基因为例,从ENSEMBL基因组数据库下载人P21(CDKN1A)启动子序列片段 (SEQ ID N0:1),从-1000位点到转录起始位点共1000碱基对(bp)。以该序列片段为模板, 设计6个saRNA靶位点(如图la所示),每个靶位点的序列长度为25个碱基,具体命名如 下:
[0056] dsaP21-l 靶序列:SEQ ID N0:645' -GCTCCAGGTGCTTCTGGGAGAGGTG-3'
[0057] dsaP21-2 靶序列:SEQ ID N0:655' -GTATTAATGTCATCCTCCTGATCTT-3'
[0058] dsaP21-3 靶序列:SEQ ID N0:665' -CCTGGAGAGTGCCAACTCATTCTCC-3'
[0059] dsaP21-4 靶序列:SEQ ID N0:675' -GGATCAGTGGGAATAGAGGTGATAT-3'
[0060] dsaP21-5 靶序列:SEQ ID N0:685' -CCAGATTTGTGGCTCACTTCGTGGG-3'
[0061] dsaP21-6 靶序列:SEQ ID N0:695' -TGCCAACTCATTCTCCAAGTAAAAA-3'。
[0062] 根据上述靶位点合成dsaRNA正义序列和反义序列,正义序列前23个为核糖 核苷酸,最后两个为脱氧核糖核苷酸,反义序列长度为27个核苷酸,全部为核糖核苷 酸。靶位点的位置以及合成的dsaRNA正义序列和反义序列如图la-图lb所示。设计 的 6 条 dsaRNA 具体如下:dsaP21-l (正义序列:SEQ ID N0:2GCUCCAGGUG CUUCUGGGAG AGGtg ;反义序列:SEQ ID NO: 3CACGAGGUCC ACGAAGACCC UCUCCAC),dsaP21-2 (正义序 列:SEQ ID N0:4GUAUUAAUGU CAUCCUCCUG AUCtt ;反义序列:SEQ ID N0:5UACAUAAUUA 反义序列:SEQ ID N0:7GAGGACCUCUCACGGUUGAG UAAGAGG),dsaP21-4(正义序列:SEQ ID N0:8GGAUCAGUGG GAAUAGAGGU GAUat;反义序列:SEQ ID N0:9UCCCUAGUCA CCCUUAUCUC CACUAUA),dsaP21-5(正义序列:SEQ ID N0:10CCAGAUUUGU GGCUCACUUCGUGgg;反义 序列:SEQ ID N0:11UCGGUCUAAA CACCGAGUGA AGCACCC),dsaP21-6(正义序列:SEQ ID N0:12UGCCAACUCA UUCUCCAAGUAAAaa;反义序列:SEQ ID N0:13UCACGGUUGA GUAAGAGGUU CAUUUUU);dsaControl:(正义序列:SEQ ID N0:14AGTCACUACU GAGUGACAGUAGAat;反义序 列:SEQ ID N0:15AUUCUACUGU CACUCAGUAG UGACUGC)。
[0063] 2.根据本发明的dsaRNA与常规设计的saRNA的RNA激活效率的比较
[0064] 本申请的发明人同时设计了 6个与上述dsaRNA相对应的长度为21个核苷酸的标 准saRNA,其中正义序列和反义序列的末端两位均为脱氧核糖核苷酸,具体序列为:
[0065] saP21-l (正义序列:SEQ ID NO: 16GCUCCAGGUGCUUCUGGGAGAdTdT ; 反义序列:SEQ ID NO: 17UCUCCCAGAAGCACCUGGAGCdTdT)。saP2卜2 (正 义序列:SEQ ID NO : 18GUAUUAAUGUCAUCCUCCUGAdTdT ;反义序 列:SEQ ID N0:19UCAGGAGGAUGACAUUAAUACdTdT)〇saP21-3(正 义序列:SEQ ID NO : 20CCUGGAGAGUGCCAACUCAUUdTdT ;反义序 列:SEQ ID N0:21AAUGAGUUGGCACUCUCCAGGdTdT)〇saP21-4(正 义序列:SEQ ID N0:22GGAUCAGUGGGAAUAGAGGUGdTdT;反义序列: SEQ ID NO:23CACCUCUAUUCCCACUGAUCCdTdT)〇 saP21_5(正义序 列:SEQ ID N0:24CCAGAUUUGUGGCUCACUUCGdTdT;反义序列:SEQ ID NO:25CGAAGUGAGCCACAAAUCUGGdTdT) 〇 saP2 1-6 (正义序列:SEQ ID NO: 26UGCCAACUCAUUCUCCAAGUAdTdT ;反义序列:SEQ ID NO: 27UACUUGGAGAAUGAGUUGGCAdT dT) 〇
[0066] 3. dsaRNA 及 saRNA 合成:
[0067] 分别化学合成上述dsaRNA的单链,进行去盐纯化,然后分别将相同摩尔数的含有 互补区域的两条单链(即正义序列和反义序列)加入同一 RNA退火缓冲液中,加热到97°C, 然后使溶液自然冷却到室温,即得到双链的dsaRNA。
[0068] 4?细胞培养及转染:
[0069] 取指数生长期人前列腺癌细胞株PC-3,用胰酶消化,然后悬浮在含有10%胎牛血 清的RPMI-1640培养基内,以4x 105细胞/孔的密度种入6孔细胞培养板,其中培养基为 2ml。取 6. 25 y 1 浓度为 20 y M 的 dsaRNA,与 243. 5 y 1 Opti-MEM 培养基(购自 Lifetech 公司)混合,同时,用 245yl Opti-MEM稀释 5yl Lipofectamine RNAiMax(购自 Lifetech 公司),将稀释后的dsaRNA与RNAiMax混合,室温放置20分钟。然后将转染混合液(500 y 1) 加入6孔板的细胞中。混合均匀后,将细胞放入C02培养箱,在37 °C的5 % C0 2浓度下培养 72-96小时。
[0070] 5.细胞总RNA提取:
[0071] 细胞总mRNA提取采用Qiagen公司RNeasy试剂盒进行。在细胞转染72-96小时 后,移去培养基,加入lml PBS缓冲液清洗细胞,然后加入350 y 1 RTL缓冲液,收集细胞裂 解液,加入等量70 %乙醇,最后加入50 y 1 DEPC处理水,离心收集RNA。所得RNA溶液采用 Nanodrop仪测定其浓度。
[0072] 6. cDNA 合成:
[0073] 取 lyg RNA,加入DEPC处理水至 10yl,加入 lyl(0.5yg)01ig〇-dT 引物,70摄 氏度孵育10分钟,转移至冰上,然后加入2. 5 y 1 RT反应缓冲液,1. 0 y 1 25mM dNTP,0. 5 y 1 RNA酶抑制剂,加水至25 y 1。反应在45摄氏度进行1小时,然后70摄氏度10分钟。最后 用去RNA酶水将所得cDNA溶解稀释至100 y 1。
[0074] 7. mRNA 表达分析:
[0075] mRNA 表达分析用 Power Sybrgreen qPCR 混合液(购自 Lifetech 公司)及 ABI 7500快速实时定量PCR扩增仪进行。取1 y 1 cDNA产物,加入1 y 10. 67 yM引物,3 y 1水, 5yl Sybrgreen试剂。反应在PCR扩增仪中用标准程序进行。同时扩增GAPDH基因作为内 部对照。正义引物为:3£0 10勵:285'-六!1^〇^1'(:11'〇^66六606六-3',反义引物为:5£0 10 N0:295' -TTCTCCATGGTGGTGAAGACG-3'。
[0076] 8.细胞增殖分析:
[0077] 细胞转染在96孔板进行。细胞增殖的检测采用Promega公司提供的 CellTiter96 K AQuecius One Solution Cell Proliferation Assay 试剂盒完成。在细胞 转染后0-6天,每天进行一次细胞增殖分析,共6个时间点。分析前在培养基中加入20 y 1 solution one试剂,然后在37摄氏度继续培养细胞30分钟,用酶标仪在490nm波长测量吸 光值。
[0078] 9.细胞形态分析:
[0079] 将PC-3肿瘤细胞均匀接种在6孔板种,次日转染细胞,在转染后72小时在相差显 微镜下观察并拍照记录。
[0080] 结果
[0081] 1. dsaRNA 触发 RNAa
[0082] 为了评价 dsaRNA 的 RNAa 活性,用 dsaRNA 转染 PC-3 细胞,Mock 和 dsaControl 作 为对照,dsaControl的作为非特异性dsaRNA的对照,为一段不和细胞内任何基因序列互补 的分子。。转染后72小时收集细胞,提取细胞总RNA,进行逆转录反应获得cDNA,用cDNA为 模板,用人P21基因引物实时定量PCR扩增p21mRNA,同时扩增GAPDH作为内部对照。如图2 所示,在设计的 6 个 dsaRNA 中,其中 3 个(dsaP21-4、dsaP21-5、dsaP21-6)能激活 p21mRNA 表达达到3倍以上。
[0083] 为了比较dsaRNA与常规设计的saRNA的RNA激活功效,用saRNA转染PC-3细胞, Mock和dsaControl作为对照。转染后72小时收集细胞,按上述方法分析p21mRNA表达。 如图3所示,在设计的6个saRNA中,只有2个(saP21-4)能激活p21mRNA表达,激活倍数 为1. 5~2. 2倍。
[0084] 2. dsaRNA抑制肿瘤细胞增殖
[0085] p21基因是重要的细胞周期负性调控基因,因此具有肿瘤抑制作用。为了评价 p21dsaRNA对肿瘤细胞生长的影响,用p21dsaRNA转染PC-3细胞,在转染后72小时采用 Promega 公司 CellTiter :9.6:*AQ_US One Solution Cell Proliferation Assay 试剂盒分 析细胞活性。如图4所示,dsaP21_4, dsaP21_5, dsaP21_6能够显著降低PC-3细胞的存活 率。而且这种效应是随着dsaRNA对p21基因的促进表达的能力相关联。
[0086] 3. dsaRNA抑制肿瘤细胞生长
[0087] 将PC-3细胞均匀地培养在6孔板中,将设计的靶向p21启动子不同位点的dsaRNA 分别转染PC-3细胞,设置空白Mock对照组和dsaControl对照组,72小时后采用相差显微 镜观察细胞。如图5所示,转染了 dsaP21_4, dsaP21_5, dsaP21_6的实验组PC-3生长速度 放缓,数目显著比对照组数目少。转染了 dsaP21_4的实验组细胞数比转染了 dsaP21_5的 实验组细胞多,而比转染了 dsaP21_6的实验组细胞数目少。说明dsaP21的抑制细胞生长 的效应与dsaP21促进p21基因表达的能力紧密相关。dsaP21促进p21基因表达的能力越 强,其抑制细胞生长的能力就越强。这些说明这种dsaP21是一种有效的抑制肿瘤细胞生长 的抑制剂。
[0088] 相比现有的技术,本发明证实了在Dicer酶的剪切的作用下,从活性saRNA得到的 Dicer酶的底物saRNA分子(dsaRNA)可以显著提高靶基因的激活效率。现有的saRNA方法 的方法是模拟dicer酶的产物,从而绕过了其与Dicer酶的相互作用。本专利设计出来的 dsaRNAs能够提高RNA激活的效能,使靶DNA分子可以更容易和dsaRNA作用,从而更容易, 更高效激活目的基因的表达。
[0089] 实施例2
[0090] (一)短于25个核苷酸的saRNA的激活效率
[0091] 针对p21基因启动子6个位点设计23个核苷酸长度的dsRNA。分别 命名为:dsP21_la, dsP21_2a, dsP21_3a, dsP21_4a, dsP21_5a, dsP21_6a。 其序 列为:dsP21-la(正义序列:SEQ ID N0:30GCUCCAGGUGCUUCUGGGAGAGG,反义序 列为:SEQ ID N0:31UCUCCCAGAAGCACCUGGAGCAC) ;dsP21-2a(正义序列:SEQ ID N0:32GUAUUAAUGUCAUCCUCCUGATC,反义序列为:SEQ ID N0:33UCAGGAGGAUGACAUUAAUACAU); dsP21-3a(正义序列:SEQ ID N0:34CCUGGAGAGUGCCAACUCAUUCU,反义序列为: SEQ ID N0:35AAUGAGUUGGCACUCUCCAGGAG);dsP21-4a(正义序列为:SEQ ID N0:36GGAUCAGUGGGAAUAGAGGUGAT,反义序列为:SEQ ID N0:37CACCUCUAUUCCCACUGAUCCCT); dsP21-5a(正义序列为:SEQ ID N0:38CCAGAUUUGUGGCUCACUUCGTG,反义序列 为:SEQ ID N0:39CGAAGUGAGCCACAAAUCUGGCT);dsP21-6a(正义序列为:SEQ ID N0:40UGCCAACUCAUUCUCCAAGUAAA,反义序列为:SEQ ID N0:41UACUUGGAGAAUGAGUUGGCACT), 其中正义序列的最后两个碱基为脱氧核糖核苷酸。结果表明,如图6所示,dsP21-3a, dsP21_5a,dsP21_6a虽然可以激活p21基因的表达,但其激活的效率明显较低。
[0092] (二)长于30个核苷酸的激活效率的效果
[0093] 针对p21基因启动子6个位点设计35个核苷酸长度的dsRNA,分别命名 为:dsP21-lb,dsP21-2b,dsP21-3b,dsP21-4b,dsP21-5b,dsP21-6b。其序列为: (^&?21-113(正义序列 :5£〇10勵:42?]〇^661^〇]〇^661^〇]1]〇^66464661^4(:,反义 序列为:SEQ ID N0:43CACCUCUCCCAGAAGCACCUGGAGCACCUAGACAC) ;dsaP21-2b(正义序 列为:SEQ ID N0:44AUUUUUAUGUAUUAAUGUCA UCCUCCUGAUCUUIT,反义序列为:SEQ ID NO: 45AAGAUCAGGAGGAUGACAUU AAUACAUAAAAAUTC) ;dsaP2l-3b (正义序列为:SEQ ID NO: 4 6UGUGUCCUCCUGGAGAGUGCCAACUCAUUCUCCAA,反义序列为:SEQ ID NO: 47GGAGAAUGAGUUGGCA CUCUCCAGGAGGACACAGC) ;dsaP2l-4b (正义序列为:SEQ ID NO: 48CUAGUGAGGGAUCAGUGGGAA UAGAGGUGAUAUTG,反义序列为:SEQ ID N0:49AUAUCACCUCUAUUCCCACUGAUCCCUCACUAGGT); dsaP21-5b (正义序列为:SEQ ID N0:50AAAAAAAGCCAGAUUUGUGGCUCACUUCGUGGGGA,反义序列 为:SEQ ID N0:51CCCACGAAGUGAGCCACAAAUCUGGCUUUUUUUAC) ;dsaP21-6b (正义序列为:SEQ ID N0:52CUGGAGAGUGCCAACUCAUUCUCCAAGUAAAAAAA,反义序列为:SEQ ID N0:53UUUUUACUUG GAGAAUGAGUUGGCACUCUCCAGGA),其中正义序列最后两个为脱氧核糖核苷酸。
[0094] 结果表明,如图7所示,dsP21-3b,dsP21-5b,dsP21-6b虽然可以激活p21基因的 表达,但其激活的效率明显较低。
[0095] 实施例3
[0096] 根据本发明专利设计的dsaRNA具有高效激活胰-十二指肠同源盒基因(PDX1) 的表达。roxi基因是调节胰岛功能的重要基因,同时roxi还可以促使非e细胞如肝细 胞中的胰岛素基因表达,对治疗糖尿病具有重要的应用价值。我们在roxi基因启动子区 域设计了针对不同位点的dsaRNA。如下所示的序列中以小写黑体表示dsaRNA序列中的 脱氧核糖核苷酸。dsaPDXl-1 (正义序列为:SEQ ID N0:54CACACUAUGUCCAUUAUCAAAUA ta, 反义序列为:SEQ ID N0:55UAUAUUUGAUAAUGGACAUAGUGUGUU) ;dsaPDXl-2(正义序列为:SEQ ID N0:56CCGACAUCUUUGUGGCUGUGAACaa,反义序列为:SEQ ID N0:57UUGUUCACAGCCACAAAG AUGUCGGUU) ;dsaPDXl-3(正义序列为:SEQ ID N0:58GACCUAGAGAGCUGGGUCUGCAAac,反义 序列为:SEQ ID N0:59GUUUGCAGACCCAGCUCUCUAGGUCAG);dsaPDXl-4(正义序列为:SEQ ID NO: 60ACAACGAAUGCCAGAGUUUCGUGtg,反义序列为:SEQ ID NO: 61CACACGAAACUCUGGCAUUCG UUGUGU) ;dsaPDXl-5(正义序列为:SEQ ID N0:62GUACUUGCAGCACAUCCACAAGUaa,反义序列 为:SEQ ID N0:63UUACUUGUGGAUGUGCUGCAAGUACUU),其中正义序列最后两个碱基为脱氧核 糖核苷酸。将设计的dsaPDXl分别转染IfepG2细胞,使用的dsaPDXIRNA浓度为50nM,转染 96小时后收集细胞,提取总RNA,然后检测H)X1基因的表达。实验结果表明,dsaPDXl-1, dsaPDXl-3, dsaPDXl-4可以高效的激活IfepG2细胞中H)X1基因的表达(图8)。
[0097] 实施例4
[0098] 根据本发明专利设计的dsaRNA具有高效激活NKX3. 1基因的表达。NKX3. 1是 前列腺特异性和雄激素调苄基因。在人前列腺组织高度表达,是一种前列腺特异性肿瘤 抑制因子,对前列腺癌的治疗具有重要的作用。本发明在NKX3.1启动子设计了针对不 同位点的dsaRNA。如下所示的序列中以小写黑体表示dsaRNA序列中的脱氧核糖核苷 酸。其中 dsaNKX-1 (正义序列为:SEQ ID NO: 70GAGGAGAGCUGGAGAAGGAGAGGaa,反义序 列为:SEQ ID N0:71UUCCUCUCCUUCUCCAGCUCUCCUCCC) ;dsaPDXl-2(正义序列为:SEQ ID N0:72AGAGCUAACUGGACUGUUU⑶CUtg,反义序列为:SEQ ID N0:73CAAGACAAACAGUCCAGUUA GCUCUUC) ;dsaPDXl-3(正义序列为:SEQ ID N0:74CUGUAAUUGGCUCUGACGGUCCUga,反义序 列为:SEQ ID N0:75UCAGGACC⑶CAGAGCCAAUUACAGGG) ;dsaPDXl-4(正义序列为:SEQ ID NO: 76AGAGCACCCAGAACUCUCACGGUac,反义序列为:SEQ ID NO: 77GUACCGUGAGAGUUCUGGGUGCU CUCU) ;dsaPDXl-5(正义序列为:SEQ ID N0:78AGAUAUUGCAGAUCUGAGUUUGCac,反义序列为: SEQ ID NO: 79GUGCAAACUCAGAUCUGCAAUAUCUAC),其中正义序列最后两个碱基为脱氧核糖核 苷酸。将设计的dsaNKX分别转染前列腺癌PC-3细胞,使用的dsaNKX RNA浓度为50nM,转染 96小时后收集细胞,提取总RNA,然后检测NKX3. 1基因的表达。实验结果表明,dsaNKX-1, dsaNKX-2, dsaNKX-3, dsaNKX-4, dsaNKX-5都可以高效的激活PC-3细胞中NKX3. 1基因的表 达,其中dsaNKX-1和dsaNKX-5激活的效果更明显(图9),其能有效抑制PC-3细胞的增值 (图 10)。
[0099] 尽管已经对本发明的【具体实施方式】进行了详细说明和描述,但应当认识到,本发 明不受所述【具体实施方式】的限制。在不脱离本发明精神和范围的情况下,可以对本发明做 出各种改进、修饰和变化,而这些改进、修饰和变化均在本发明的范围之内。
【主权项】
1. 一种小激活RNA,其特征在于,所述的小激活RNA由包含25~30个核苷酸的正义序 列和包含25~30核苷酸的反义序列组成,所述反义序列中至少有80%的序列与所述正义 序列形成互补;所述正义序列或反义序列中包含具有19~25个核苷酸的靶基因调控序列 匹配片段,所述匹配片段至少有80%的序列与靶基因调控序列的靶位点匹配。2. 如权利要求1所述的小激活RNA,其特征在于,所述正义序列和/或反义序列中还含 有1-5个脱氧核糖核苷酸;优选地,所述正义序列和/或反义序列中位于3'末端的2个核 苷酸为脱氧核糖核苷酸。3. 如权利要求1或2所述的小激活RNA,其特征在于,所述靶基因调控序列片段是靶基 因启动子序列片段;优选地,所述靶基因启动子序列片段为靶基因转录起始点上游5000个 碱基到革E基因转录起始点前一个碱基形成的启动子区域。4. 如权利要求1~3中任一项所述的小激活RNA,其特征在于,所述靶基因为人基因 P21;优选地,所述靶基因调控序列的靶位点序列选自SEQ ID N0:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68 或 SEQ ID NO:69 中的一个。5. 如权利要求4所述的小激活RNA,其特征在于,所述小激活RNA的正义序列和反义序 列选自以下组合之一: 正义序列为SEQ ID NO: 2,反义序列为SEQ ID NO: 3; 正义序列为SEQ ID NO: 4,反义序列为SEQ ID NO: 5; 正义序列为SEQ ID NO: 6,反义序列为SEQ ID NO: 7; 正义序列为SEQ ID NO: 8,反义序列为SEQ ID NO: 9; 正义序列为SEQ ID NO: 10,反义序列为SEQ ID NO: 11 ;或者, 正义序列为SEQ ID NO: 12,反义序列为SEQ ID NO: 13。6. 如权利要求1-3中任一项所述的小激活RNA,其特征在于,所述靶基因为人胰-十二 指肠同源盒基因 roxi;优选地,针对所述人胰-十二指肠同源盒基因 roxi的小激活RNA的 正义序列和反义序列选自以下组合之一: 正义序列为SEQ ID NO: 54,反义序列为SEQ ID NO: 55; 正义序列为SEQ ID NO: 56,反义序列为SEQ ID NO: 57; 正义序列为SEQ ID NO: 58,反义序列为SEQ ID NO: 59; 正义序列为SEQ ID NO: 60,反义序列为SEQ ID NO:61 ; 正义序列为SEQ ID NO: 62,反义序列为SEQ ID NO: 63。7. 如权利要求1-3中任一项所述的小激活RNA,其特征在于,所述靶基因为人的基因 NKX3. 1 ;优选地,针对所述基因 NKX3. 1的小激活RNA的正义序列和反义序列选自以下组合 之一: 正义序列为SEQ ID NO: 70,反义序列为SEQ ID NO: 71 ; 正义序列为SEQ ID NO: 72,反义序列为SEQ ID NO: 73; 正义序列为SEQ ID NO: 74,反义序列为SEQ ID NO: 75; 正义序列为SEQ ID NO: 76,反义序列为SEQ ID NO: 77; 正义序列为SEQ ID NO: 78,反义序列为SEQ ID NO: 79。8. 如权利要求1-7中任一项所述的小激活RNA的制备方法,其特征在于,所述方法包括 以下步骤: 1) 在靶基因的启动子序列片段选取包含19~25个碱基的序列作为靶位点; 2) 合成与步骤1)所述的靶位点对应的RNA序列作为基础序列,在所述基础序列的一侧 或两侧添加核苷酸至长度为25~30个核苷酸,得到正义序列; 3) 合成长度为25~30nt的反义序列,并使所述反义序列至少有80%的序列与步骤2) 得到的正义序列互补; 4) 将步骤2)得到的正义序列与步骤3)得到的反义序列以相同的摩尔数在RNA退火缓 冲液中混合,加热至97°C,然后自然冷却至室温,即得到双链的小激活RNA。9. 如权利要求8所述的方法,其特征在于,在步骤2)中,合成所述正义序列和/或反义 序列时加入至少一个脱氧核糖核苷酸,优选地,合成所述正义序列和/或反义序列时3'末 端两个核苷酸为脱氧核糖核苷酸。10. 如权利要求1~6所述的小激活RNA在制备增加靶基因表达的药物中的应用,优选 为在制备抗肿瘤药物中的应用; 优选地,所述肿瘤选自膀胱癌、前列腺癌、及肝癌。
【文档编号】A61P35/00GK106032532SQ201510115335
【公开日】2016年10月19日
【申请日】2015年3月17日
【发明人】李龙承, 龙波, 郭丹
【申请人】中国医学科学院北京协和医院
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