一种具有线粒体靶向功能的磷光铱配合物探针及其制备和应用

文档序号:10678172
一种具有线粒体靶向功能的磷光铱配合物探针及其制备和应用
【专利摘要】本发明涉及一种具有线粒体靶向功能的磷光铱配合物探针及其制备方法和应用,具体涉及一类既含有线粒体靶向基团又含有次氯酸根(ClO?)识别基团的磷光铱配合物探针及其应用,属于有机光电功能材料技术领域。该类配合物材料由含肟基团的环金属配体、金属中心和含有三苯基膦的线粒体靶向基团的N^N配体组成,结构通式如下式所示。该材料合成步骤简单、条件温和,在次氯酸根检测、线粒体靶向成像和生物标记中有非常好的应用前景。
【专利说明】
一种具有线粒体靶向功能的磷光铱配合物探针及其制备和 应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种具有线粒体靶向功能的磷光离子型铱配合物探针,具体涉及一类 既含有线粒体靶向基团又含有次氯酸根(CKT)识别基团的磷光铱配合物探针及其应用,属 于有机光电功能材料技术领域。
【背景技术】
[0002] 分子氧是所有耗氧有机体维持其生命活动的必需组分,活性氧物种(R0S)是人体 代谢过程中产生的分子氧的一种,它包括过氧化物、羟基、过氧自由基、过氧化氢、单线态的 氧和次氯酸/次氯酸根。人体内的活性氧物种R0S主要是通过线粒体呼吸过程产生的氧气, 同时,也可通过外部干扰诱导有机体内生成,例如外源性化学物质,传染剂和紫外线。ROSS 与广泛的生理和病理过程,如信号转导,炎症,癌变和神经组织衰退性损伤。虽然在正常的 细胞环境中产生R0S对于生命是必须的,但是当它们在外源性刺激下生成过量时,对有机体 也是有危害的。过量的R0S通过生物分子的氧化引起的氧化应激,例如,脂质、蛋白质和DNA 的氧化作用,并诱导细胞死亡。
[0003] R0S调节各种各样的生理过程。次氯酸(H0C1),一个生物学意义的活性氧,是在活 化白细胞内,通过髓过氧化酶催化过氧化氯离子产生的。在自然防御中,次氯酸也是一种重 要的杀菌剂。然而,次氯酸水平的异常与许多炎症相关的疾病有着密切的联系,包括心血管 疾病,人体红细胞的损伤,肺病,类风湿关节炎和癌症。所以,次氯酸的检测是非常重要的。 目前,已经发展了许多检测次氯酸的方法,例如,电解法,电势法,分光光度法,化学发光检 测等。Weiying Lin组合成了一种检测CKT的比率荧光探针,当作用于分析物时,荧光发射 比率(15〇9/1 439)的可从〇.28增加到2.74,且具有较高的选择性((^11^1^.入,2009,15, 2305-2309)。此探针是基于荧光信号的检测。相比于荧光信号,磷光信号检测具有以下优 势:具有大的Stokes位移、可见光激发、良好的光稳定性、长的发射寿命、高的量子效率和发 射波长易调节等。我们课题组已开发出基于磷光信号检测的次氯酸根探针(CN 201310525077.6),实现了对次氯酸根的磷光信号检测。
[0004] 不同的活性氧对各种疾病的致病机理作用不同,为了更加深入的研究某种活性氧 物种对疾病的作用机制,这就要求广大科研工作者设计出能够专一性检测某种活性氧的荧 光分子探针。
[0005] 线粒体是细胞中的"能量加工厂",对细胞存亡起着至关重要的作用。如果线粒体 机能发生紊乱,就会引发一系列的疾病,例如:代谢紊乱和某些癌症。线粒体也是细胞内产 生活性氧的重要部位,同样,当这些活性氧的产生发生紊乱的时候也会产生一系列的疾病, 如:癌症、糖尿病、阿尔茨海默病、神经退行性疾病等等。因此开发出能特定实现线粒体中次 氯酸根检测的探针是非常重要的。

【发明内容】

[0006] 为解决上述技术问题,本发明的目的在于提供一种具有线粒体靶向功能的磷光铱 配合物探针,给出它们的制备方法,并提出这类配合物在次氯酸根检测、细胞成像以及生物 标记中的应用。本发明所采用的技术方案如下:
[0007] 为了解决上述其中一个技术问题提出的技术方案是:本发明涉及具有线粒体靶向 功能的磷光铱配合物探针,其环金属配体上含有次氯酸根(CKT)识别基团肟基(C = N-〇H), 辅助N~N配体上含有线粒体靶向基团三苯基膦,可以用于线粒体的靶向成像以及其中的次 氯酸根检测;
[0008] 所述的铱配合物探针具有如下结构通式:
[0010] 其中:
jSl-lO的正整数。
[0011] -种具有线粒体靶向功能的磷光离子型铱配合物探针的制备方法,该制备方法的 合成路线如下:
S
[0013] 其中,
η为1-10的正整数。
[0014] 具体是在氮气保护下,
与三水合三氯化铱在2-乙氧基乙醇/ 水(3:1,v: v)混合液中110 °C密闭反应24小时得到相应的铱二氯桥化合物;再将得到的铱二 氯桥化合物与化合物2在二氯甲烷/甲醇(2:1,v:v)混合液中氮气保护下40°C密闭反应4小 时,冷却至室温后加入六氟磷酸钾继续反应1小时,分离提纯得到含有醛基(CHO)的铱配合 物3;再将含有醛基的铱配合物再与盐酸羟胺在乙醇/三乙胺混合液中氮气保护下60°C密闭 反应3小时,分离提纯得到含有肟基团(C = N-〇H)的配合物4;最后将4和三苯基磷溶于DMF 中,在氮气气氛中l〇〇°C回流72小时,反应结束后减压旋蒸除去DMF,再经过柱层析提纯得到 最终的配合物探针5.
[0015] 所述的具有线粒体靶向功能的磷光离子型铱配合物探针,该磷光离子型铱配合物 应用于次氯酸根检测。
[0016] 所述的具有线粒体靶向功能的磷光离子型铱配合物探针,该磷光离子型铱配合物 应用于细胞成像和生物标记。
[0017] 所述的具有线粒体靶向功能的磷光离子型铱配合物探针,该磷光离子型铱配合物 该材料应用于活细胞线粒体的标记。
[0018] 有益效果:
[0019] 本发明合成的材料用作CKT磷光探针,在CKT存在下磷光发射显著增强,为turnon 型磷光探针,检测效果显著。本发明制备的磷光探针材料对 CKT 具有高的选择性,并且响 应快。
[0020] 本探针材料具有低生物毒性,具有一定的水溶性,且容易进入细胞线粒体中,使得 这类探针可用于细胞内线粒体中CKT检测,这对深入研究CKT在生物体体内的生理和毒理 作用具有重要意义。
【附图说明】
[0021] 下面结合附图对本发明的作进一步说明。
[0022] 图1.为实施例1中配合物Irl的CH30H/H20混合溶液的磷光发射光谱对CKT的响应 性。
[0023] 图2.为实施例1中配合物Irl对C1(T的选择性示意图。
[0024]图3.为实施例1中配合物Irl的MTT细胞毒性实验。
[0025] 图4.为实施例1中配合物Irl与商业线粒体染料的共染细胞成像。
【具体实施方式】
[0026] 以下结合说明书附图对本发明创造作进一步的详细说明。
[0027]为了更好地理解本发明专利的内容,下面通过具体的实例来进一步说明本发明的 技术方案。但这些实施实例并不限制本发明。
[0028] 实施例1:当n = 2
时,探针Irl的制备:
[0029]合成路线如下所示:
[0031] 化合物2a的制备:在反应瓶中加入氢氧化钾51mmol和2-吡啶基苯并咪唑 10.2mmol,并加入离子液体20ml。混合物预先搅拌5分钟后,加入1,6-二溴己烧8ml,在室温 下搅拌反应5h。反应完成后,用乙醚萃取三次,合并油相,采用旋转蒸发仪除去溶剂。得到的 粗产物用柱层析进行分离,淋洗液为石油醚:乙酸乙酯= 3:1,最后得到无色油状液体2.2g, 产率60%</Η NMR(400MHz,CDCl3)j = 8.70(d,J = 4.80Hz,lH),8.41(d,J = 7.97Hz,lH), 7.88-7.33(m,2H),7.46-7.44(m,lH),7.37-7.30(m,3H),4.84(t,J=7.6Hz,2H),3.38(t,J =6·8Hz,2H),1·95-1·88(m,2H),1·86-1·79(m,2H),1·53-1·44(m,2H),1·42-1·35(m,2H)。
[0032] 配合物3a的制备:称取4-(2-吡啶基)苯甲醛(2.5mmol)与IrCl3 · 3H20(lmmol)混合 投入三颈瓶中,在双排管上抽真空-保氮气-抽真空,循环往复三次,最后采用氮气保护整个 反应体系。将体积比为3:1的乙二醇乙醚和水的混合物注射进反应体系中,升温至110°C,磁 力搅拌反应24小时。反应结束后,将体系冷却至室温,过滤沉淀,并用乙醇和水洗,得到的固 体产物即为吡啶基苯甲醛铱二氯桥化合物。称取吡啶基苯甲醛铱二氯桥化合物(lmm 〇 1 )、2a (2.3mmo 1)加入至三颈瓶中,在双排管上抽真空-保氮气-抽真空,循环往复三次,最后采用 氮气保护整个反应体系。将体积比为2:1的二氯甲烷和甲醇的混合物注入体系中,将温度升 至40°C,搅拌回流。反应5小时后,加入0.72mmol的六氟磷酸钾固体,继续搅拌反应过夜。反 应结束后浓缩提纯,最后用二氯甲烷和正己烷重结晶,得到固体产物即为铱配合物3a。产 率:64% </H NMR(400MHz,DMS0)S = 9.72((1, J = 7.8Hz,2H),8.64((1, J = 8.2Hz,2H),8.47((1, J = 8.1Hz,lH) ,8.37 (d,J = 8.8Hz,lH) ,8.33( td,J = 8.2,1.5Ηζ,1Η) ,8.20(d,J = 8.0Hz, lH),8.18(dd ,J=12.9,8.1Hz,2H),8.17(d ,J = 8.1Hz,lH),8.06(td ,J = 8.1,1.5Hz,lH), 8.02-7.90(m,3H),7.84(d,J = 6.0Hz,lH),7.78(dJ = 5.9Hz,lH),7.71-7.64(m,lH),7.63-7.52(m,2H),7.41(t ,J = 7.9Hz,lH),7.26(t ,J = 6.7Hz,2H),7.07-6.97(m,lH),6.73(d ,J = 1.2Hz,lH) ,6.65(d ,J=1.2Hz,lH) ,6.11 (d ,J = 8.4Hz , 1H), 5.03-4.79(m, 2H), 3.38(t ,J = 6·8Hz,2H),1·98-1·84(m,2H),1·75-1·63(m,2H),1·30-1·17(m,2H)·
[0033] 配合物4a的制备:称取铱配合物3a( lmmol)和盐酸轻胺(5mmol)加入双颈瓶中,在 双排管上抽真空-保氮气-抽真空,循环往复三次,最后采用氮气保护整个反应体系。注入 5mL蒸过的乙醇溶液,5mmo 1蒸过的三乙胺,60 °C混合搅拌4小时。反应结束后,浓缩提纯。得 到红色固体产物即为铱配合物4a。产率:81% ,Η MMR(400MHz,DMS0) :δ = 11.13(s,2H), 10.36(s,2H) ,8.64(d ,J = 8.2Hz,2H) ,8.47(d ,J = 8.1Hz , 1H), 8.37(d ,J = 8.8Hz , 1H), 8.33 (td ,J = 8.2,1.5Hz,lH),8.20(d ,J = 8.0Hz,lH) ,8.18(dd ,J= 12.9,8.1Hz , 2H) ,8.17(d ,J = 8.1Hz,lH),8.06(td ,J = 8.1,1.5Hz,lH),8.02-7.90(m,3H),7.84(d ,J = 6.0Hz,lH),7.78 (d ,J = 5.9Hz,lH),7.71-7.64(m,lH),7.63-7.52(m,2H) ,7.41 (t ,J = 7.9Hz , 1H), 7.26(t ,J = 6.7Hz,2H),7.07-6.97(m,lH) ,6.73(d ,J= 1.2Hz , 1H), 6.65(d ,J= 1.2Hz , 1H) ,6.11 (d ,J =8.4Hz, 1H), 5.03-4.79(m, 2H), 3.38(t ,J = 6.8Hz,2H), 1.98-1.84(m,2H), 1.75-1.63(m, 2H),1.30-1.17(m,2H)〇
[0034] 配合物Irl的制备:将4a(0.2mmol)和三苯基磷(2mmol)溶于DMF中,在氮气气氛中 l〇〇°C回流72小时,反应结束后减压旋蒸除去DMF,将得到的油状液体过柱子提纯,得到最终 产物Irl。产率60%</Η MMR(400MHz,DMS0) :S = 11.13(s,2H),10.36(s,2H),8.64(d,J = 8.2Hz,2H) ,8.47(d ,J = 8.1Hz,lH) ,8.37(d ,J = 8.8Hz , 1H), 8.33(td ,J = 8.2,1.5Hz , 1H), 8.20(d,J = 8.0Hz,lH),8.18(dd,J=12.9,8.1Hz,2H),8.17(d,J = 8.1Hz,lH) ,8.06(td,J = 8.1,1.5Hz,lH),8.02-7.90(m,3H),7.84(d,J = 6.0Hz,lH),7.78(dJ = 5.9Hz,lH),7.71-7.64(m,lH),7.63-7.52(m,2H),7.41(t,J = 7.9Hz, 1H),7.26(t,J = 6.7Hz,2H) ,7.07-6.97 (m,lH),6.73(d ,J=1.2Hz,lH),6.65(d ,J=1.2Hz,lH) ,6.11 (d ,J = 8.4Hz , 1H), 5.03-4.79 (m,2H),3.56(t,2H),1.99(s,3H),1.50(m,6H)〇
[0035] 探针Irl的发射光谱对C10_的响应性::
[0036] 将铱配合物&1溶解在0130!1/!120(¥八,2 :1,?!17.2)混合溶液中,逐次加入(:10一的 CH30H/H20混合溶液中,每次滴加 C1(T后,在37°C恒温水浴中加热搅拌5分钟,使C1(T与铱配 合物Irl充分反应,随后测试其荧光发射光谱,如图1所示。在583nm处,铱配合物Irl溶液本 身发光很弱,随着CKT的加入,铱配合物Irl溶液的荧光光谱立刻发生了变化,伴随着CKT滴 加浓度的升高,铱配合物Irl的荧光光谱蓝移并在575nm处的荧光强度逐渐升高。当CKT的 滴加浓度当量达到30eq.时,滴定达到终点,再继续滴加 CKT,光谱则不再发生变化。
[0037] 探针Irl在溶液中对C10_的选择性实验:
[0038] 配制1(^11的配合物&1溶液(〇130!1/!120(¥八,2 :1,?!17.2)),移取2.51^所配化合物 溶液于比色皿中,加入过量的(超过200倍当量)的AlCl3、CuCl2、LiC10 3、MgCl2、Na2⑶3、 他23〇4、似(^、211(:12、!12〇2、似(:10 3、似勵2、他(:10溶液,分别测其发射光谱。测试结果如图2所 示,其他离子均无明显影响。实验数据表明:材料对CKT有较好的选择性。
[0039] 配合物Irl的MTT细胞毒性实验:
[0040]将消化后的细胞接种在96孔板中,每孔的接种密度为104个/孔,在37°C,5%0)2的 条件下继续培养24小时。吸除不新鲜的培养液后用不同浓度&1(1、5、10、25、5(^1〇的细胞 培养液继续培养细胞24小时。每孔加入10yL MTT(5mg/mL)继续培养4小时候终止培养。吸除 培养液,每孔加入150yL DMS0,摇床震荡10分钟后使用酶标仪测试0D570。
[00411 MTT细胞毒性实验结果如图3所示,在配合物的浓度为1~50μΜ时,培养24小时候的 细胞存活率均大于80%,证明该配合物具有较低的细胞毒性,可用于细胞成像。
[0042] 配合物Irl与商业线粒体染料Mito-Track Green对活细胞线粒体的共染实验:
[0043] 本发明采用的细胞均为人宫颈癌HeLa细胞。将消化后的细胞接种在培养皿中,在 37°C,5%C02的条件下继续培养24小时使之贴壁。用PBS溶液洗去不新鲜的细胞培养液后用 Irl(5yM)的细胞培养液孵育细胞12小时。再用含有Mito-Tracker Green(200nM)的细胞培 养液继续培养30分钟,用PBS溶液清洗三次后成像。
[0044] 配合物Irl与商业线粒体染料Mito-Tracker Green的细胞共染成像图如图4所示。 Mito-Tracker Green由488nm蓝光激发,收集500_540nm绿光发射,Ir 1由405nm蓝紫光激发, 收集560-640nm红光发射。将线粒体染料Mito-Tracker Green的发射区域与配合物Ir 1的发 射区域向叠加,发现二者重合度高,由计算可得,共染系数为0.85,证明本发明的配合物Irl 能够靶向活细胞线粒体,可用于活细胞线粒体标记。
[0045] 实施例2:当n = l,
!l时,探针Ir2的制备:
[0046] 合成路线如下所示:
[0048]化合物2b的制备:在反应瓶中加入氢氧化钾51mmol和2-吡啶基苯并咪唑 10.2mmol,并加入离子液体20ml。混合物预先搅拌5分钟后,加入1,4-二溴丁烷8ml,在室温 下搅拌反应5h。反应完成后,用乙醚萃取三次,合并油相,采用旋转蒸发仪除去溶剂。得到的 粗产物用柱层析进行分离,淋洗液为石油醚:乙酸乙酯= 3:1,最后得到无色油状液体2.2g, 产率62%</H NMR(400MHz,CDCl3)j = 8.70(d,J = 4.80Hz,lH),8.41(d,J = 7.97Hz,lH), 7.88-7.33(m,2H),7.46-7.44(m,lH),7.37-7.30(m,3H),4.86(t,J=7.6Hz,2H),3.39(t,J =6.8Hz,2H),1.92-1.886(m,2H),1.84-1.78(m,2H)。
[0049] 配合物3b的制备:称取4-(2-吡啶基)苯甲醛(2.5mmol)与IrCl3 · 3H20(lmmol)混合 投入三颈瓶中,在双排管上抽真空-保氮气-抽真空,循环往复三次,最后采用氮气保护整个 反应体系。将体积比为3:1的乙二醇乙醚和水的混合物注射进反应体系中,升温至110°C,磁 力搅拌反应24小时。反应结束后,将体系冷却至室温,过滤沉淀,并用乙醇和水洗,得到的固 体产物即为吡啶基苯甲醛铱二氯桥化合物。称取吡啶基苯甲醛铱二氯桥化合物(lmm〇 1)、2b (2.3mmo 1)加入至三颈瓶中,在双排管上抽真空-保氮气-抽真空,循环往复三次,最后采用 氮气保护整个反应体系。将体积比为2:1的二氯甲烷和甲醇的混合物注入体系中,将温度升 至40°C,搅拌回流。反应5小时后,加入0.72mmol的六氟磷酸钾固体,继续搅拌反应过夜。反 应结束后浓缩提纯,最后用二氯甲烷和正己烷重结晶,得到固体产物即为铱配合物3b。产 率:71% ,Η ΜΚΗΟΟΜΗζ,ΟΜΒΟ)1!! NMR(400MHz,DMS0)S = 9.72((1, J = 7.8Hz,2H),8.64((1, J = 8.2Hz,2H),8.47(d ,J = 8.1Hz,lH),8.37(d ,J = 8.8Hz,lH),8.33(td ,J = 8.2,1.5Hz,lH), 8.20(d,J = 8.0Hz,lH),8.18(dd,J=12.9,8.1Hz,2H),8.17(d,J = 8.1Hz,lH) ,8.06(td,J = 8.1,1.5Hz,lH),8.02-7.90(m,3H),7.84(d,J = 6.0Hz,lH),7.78(dJ = 5.9Hz,lH),7.71-7.64(m,lH),7.63-7.52(m,2H),7.41(t,J = 7.9Hz, 1H),7.26(t,J = 6.7Hz,2H) ,7.07-6.97 (m,lH),6.73(d ,J=1.2Hz,lH),6.65(d ,J=1.2Hz,lH) ,6.11 (d ,J = 8.4Hz , 1H), 5.03-4.79 (m,2H),3.38(t ,J = 6.8Hz,2H), 1.98-1.84(m,2H), 1.75-1.63(m,2H).
[0050] 配合物4b的制备:称取铱配合物3b( lmmol)和盐酸轻胺(5mmol)加入双颈瓶中,在 双排管上抽真空-保氮气-抽真空,循环往复三次,最后采用氮气保护整个反应体系。注入 5mL蒸过的乙醇溶液,5mmo 1蒸过的三乙胺,60 °C混合搅拌4小时。反应结束后,浓缩提纯。得 到红色固体产物即为铱配合物4a。产率:81% ,Η MMR(400MHz,DMS0) :δ = 11.13(s,2H), 10.36(s,2H) ,8.64(d ,J = 8.2Hz,2H) ,8.47(d ,J = 8.1Hz , 1H), 8.37(d ,J = 8.8Hz , 1H), 8.33 (td ,J = 8.2,1.5Hz,lH),8.20(d ,J = 8.0Hz,lH) ,8.18(dd ,J= 12.9,8.1Hz , 2H) ,8.17(d ,J = 8.1Hz,lH),8.06(td ,J = 8.1,1.5Hz,lH),8.02-7.90(m,3H),7.84(d ,J = 6.0Hz,lH),7.78 (d ,J = 5.9Hz,lH),7.71-7.64(m,lH),7.63-7.52(m,2H) ,7.41 (t ,J = 7.9Hz , 1H), 7.26(t ,J = 6.7Hz,2H),7.07-6.97(m,lH) ,6.73(d ,J= 1.2Hz , 1H), 6.65(d ,J= 1.2Hz , 1H) ,6.11 (d ,J =8.4Hz, 1H), 5.03-4.79(m, 2H), 3.38(t ,J = 6.8Hz,2H), 1.98-1.84(m,2H), 1.75-1.63(m, 2H)〇
[0051 ] 配合物Ir2的制备:将4b(0 · 2mmol)和三苯基磷(2mmol)溶于DMF中,在氮气气氛中 l〇〇°C回流72小时,反应结束后减压旋蒸除去DMF,将得到的油状液体过柱子提纯,得到最终 产物Ir2。产率60%</Η MMR(400MHz,DMS0) :S = 11.13(s,2H),10.36(s,2H),8.64(d,J = 8.2Hz,2H) ,8.47(d ,J = 8.1Hz,lH) ,8.37(d ,J = 8.8Hz , 1H), 8.33(td ,J = 8.2,1.5Hz , 1H), 8.20(d,J = 8.0Hz,lH),8.18(dd,J=12.9,8.1Hz,2H),8.17(d,J = 8.1Hz,lH) ,8.06(td,J = 8.1,1.5Hz,lH),8.02-7.90(m,3H),7.84(d,J = 6.0Hz,lH),7.78(dJ = 5.9Hz,lH),7.71-7.64(m,lH),7.63-7.52(m,2H),7.41(t,J = 7.9Hz, 1H),7.26(t,J = 6.7Hz,2H) ,7.07-6.97 (m,lH),6.73(d ,J=1.2Hz,lH),6.65(d ,J=1.2Hz,lH) ,6.11 (d ,J = 8.4Hz , 1H), 5.03-4.79 (m,2H),3.56(t,2H),1.99(s,3H),1.50(m,6H)〇
[0052] 探针Ir2的发射光谱对C10_的响应性::
[0053] 将铱配合物&2溶解在0130!1/!120(¥八,2 :1,?!17.2)混合溶液中,逐次加入(:10一的 CH30H/H20混合溶液中,每次滴加 C1(T后,在37°C恒温水浴中加热搅拌5分钟,使C1(T与铱配 合物Ir2充分反应,随后测试其荧光发射光谱。在583nm处,铱配合物Ir2溶液本身发光很弱, 随着CKT的加入,铱配合物Ir2溶液的荧光光谱立刻发生了变化,伴随着CKT滴加浓度的升 高,铱配合物Ir2的荧光光谱蓝移并在575nm处的荧光强度逐渐升高。当CKT的滴加浓度当 量达到30eq.时,滴定达到终点,再继续滴加 CKT,光谱则不再发生变化。
[0054] 探针Ir2在溶液中对C10_的选择性实验:
[0055] 配制ΙΟμΜ的配合物Ir2溶液(CH30H/H20(v/v,2:1,pH 7 · 2)),移取2 · 5mL所配化合物 溶液于比色皿中,加入过量的(超过200倍当量)的AlCl3、CuCl2、LiC10 3、MgCl2、Na2⑶3、 他23〇4、似(^、211(:1 2、!12〇2、似(:103、似勵2、他(:10溶液,分别测其发射光谱。实验数据表明 :材 料对CKT有较好的选择性。
[0056] 配合物Ir2的MTT细胞毒性实验:
[0057]将消化后的细胞接种在96孔板中,每孔的接种密度为104个/孔,在37°C,5%0)2的 条件下继续培养24小时。吸除不新鲜的培养液后用不同浓度&2(1、5、10、25、5(^1〇的细胞 培养液继续培养细胞24小时。每孔加入10yL MTT(5mg/mL)继续培养4小时候终止培养。吸除 培养液,每孔加入150yL DMS0,摇床震荡10分钟后使用酶标仪测试0D570 JTT细胞毒性实验 结果表明在配合物的浓度为1~50μΜ时,培养24小时候的细胞存活率均大于80 %,证明该配 合物具有较低的细胞毒性,可用于细胞成像。
[0058] 配合物Ir2与商业线粒体染料Mito-Track Green对活细胞线粒体的共染实验: [0059]本发明采用的细胞均为人宫颈癌HeLa细胞。将消化后的细胞接种在培养皿中,在 37°C,5%C02的条件下继续培养24小时使之贴壁。用PBS溶液洗去不新鲜的细胞培养液后用 Ir2(5yM)的细胞培养液孵育细胞12小时。再用含有Mito-Tracker Green(200nM)的细胞培 养液继续培养30分钟,用PBS溶液清洗三次后成像。
[0000] 配合物Ir2与商业线粒体染料Mito-Tracker Green的细胞共染成像结果表明本发 明的配合物Ir3能够靶向活细胞线粒体,可用于活细胞线粒体标记。
[0061 ] 实施例3:当n = 2,
I时,探针Ir3的制备:
[0062]合成路线如下所示:
[0064] 对醛基苯喹啉(lc)的合成:在250mL两口瓶中加入2-氯喹啉(818mg,5.Ommol),对 醛基苯硼酸(750mg,5.0mmol)和四(三苯基膦)钯催化剂(200mg)。体系密封,除氧充氮气保 护。然后用注射器加入鼓氮除氧半小时之后的溶剂甲苯(30mL),乙醇(10mL),饱和碳酸钠水 溶液(10mL)。反应时体系避光,80°C下回流反应15小时。待反应结束后,体系冷却到室温。用 二氯甲烷/水萃取反应液3次,收集有机相,有机相浓缩,TLC点板,确认产物点。粗产物过柱 提纯(石油醚/二氯甲烷=1:4)得到产物。产率85 %。4 NMR(CDC13,400MHz): δ (ppm) = 1 〇 · 12 (s,lH),8.35(d,2H),8.28(d,lH),8.19(d,lH),7.93(d,lH),7.86(d,lH),7.77(t,lH).
[0065] 配合物3c的制备:称取对醛基苯喹啉(2.5mmol)与IrCl3 · 3H20(lmmol)混合投入三 颈瓶中,在双排管上抽真空-保氮气-抽真空,循环往复三次,最后采用氮气保护整个反应体 系。将体积比为3:1的乙二醇乙醚和水的混合物注射进反应体系中,升温至110°C,磁力搅拌 反应24小时。反应结束后,将体系冷却至室温,过滤沉淀,并用乙醇和水洗,得到的固体产物 即为对醛基苯喹啉铱二氯桥化合物。称取对醛基苯喹啉铱二氯桥化合物(lmmol)、2a (2.3mmo 1)加入至三颈瓶中,在双排管上抽真空-保氮气-抽真空,循环往复三次,最后采用 氮气保护整个反应体系。将体积比为2:1的二氯甲烷和甲醇的混合物注入体系中,将温度升 至40°C,搅拌回流。反应5小时后,加入0.72mmol的六氟磷酸钾固体,继续搅拌反应过夜。反 应结束后浓缩提纯,最后用二氯甲烷和正己烷重结晶,得到固体产物即为铱配合物3c。 [00 66] 配合物4c的制备:称取铱配合物3c( lmmol)和盐酸轻胺(5mmol)加入双颈瓶中,在 双排管上抽真空-保氮气-抽真空,循环往复三次,最后采用氮气保护整个反应体系。注入 5mL蒸过的乙醇溶液,5mmo 1蒸过的三乙胺,60 °C混合搅拌4小时。反应结束后,浓缩提纯。得 到红色固体产物即为铱配合物4c。
[0067] 配合物Ir3的制备:将4c(0.2mmol)和三苯基磷(2mmol)溶于DMF中,在氮气气氛中 l〇〇°C回流72小时,反应结束后减压旋蒸除去DMF,将得到的油状液体过柱子提纯,得到最终 产物Ir3。
[0068] 探针Ir3的发射光谱对C10_的响应性::
[0069] 将铱配合物&3溶解在0130!1/!120(¥八,2 :1,?!17.2)混合溶液中,逐次加入(:10_的 CH30H/H20混合溶液中,每次滴加 CKT后,在37°C恒温水浴中加热搅拌5分钟,使CKT与铱配 合物Ir3充分反应,随后测试其荧光发射光谱。在610nm处,铱配合物Ir3溶液本身发光很弱, 随着CKT的加入,铱配合物Ir3溶液的荧光光谱立刻发生了变化,伴随着CKT滴加浓度的升 高,铱配合物Ir3的荧光光谱蓝移并在603nm处的荧光强度逐渐升高。当CKT的滴加浓度当 量达到30eq.时,滴定达到终点,再继续滴加 CKT,光谱则不再发生变化。
[0070] 探针Ir3在溶液中对C10_的选择性实验:
[0071] 配制1(^的配合物&3溶液(〇130!1/!120(¥八,2 :1,?!17.2)),移取2.51^所配化合物 溶液于比色皿中,加入过量的(超过200倍当量)的AlCl3、CuCl2、LiC10 3、MgCl2、Na2⑶3、 他23〇4、似(^、211(:12、!12〇2、似(:10 3、似勵2、他(:10溶液,分别测其发射光谱。实验数据表明:材 料对CKT有较好的选择性。
[0072] 配合物Ir3的MTT细胞毒性实验:
[0073] 将消化后的细胞接种在96孔板中,每孔的接种密度为104个/孔,在37°C,5%0)2的 条件下继续培养24小时。吸除不新鲜的培养液后用不同浓度&3(1、5、10、25、5(^1〇的细胞 培养液继续培养细胞24小时。每孔加入10yL MTT(5mg/mL)继续培养4小时候终止培养。吸除 培养液,每孔加入150yL DMS0,摇床震荡10分钟后使用酶标仪测试0D570 JTT细胞毒性实验 结果表明在配合物的浓度为1~50μΜ时,培养24小时候的细胞存活率均大于80 %,证明该配 合物具有较低的细胞毒性,可用于细胞成像。
[0074] 配合物Ir3与商业线粒体染料Mito-Track Green对活细胞线粒体的共染实验:
[0075] 本发明采用的细胞均为人宫颈癌HeLa细胞。将消化后的细胞接种在培养皿中,在 37°C,5%C02的条件下继续培养24小时使之贴壁。用PBS溶液洗去不新鲜的细胞培养液后用 Ir3(5yM)的细胞培养液孵育细胞12小时。再用含有Mito-Tracker Green(200nM)的细胞培 养液继续培养30分钟,用PBS溶液清洗三次后成像。
[0076] 配合物Ir3与商业线粒体染料Mito-Tracker Green的细胞共染成像图结果表明本 发明的配合物Ir3能够靶向活细胞线粒体,可用于活细胞线粒体标记。
[0077] 实施例4:当n = 2,
I时,探针Ir4的制备:
[0078]合成路线如下所示:
[0080] 对醛基苯异喹啉(Id)的合成:在250mL两口瓶中加入2-氯异喹啉(818mg, 5.0mmol),对醛基苯硼酸(750mg,5.0mmol)和四(三苯基膦)钯催化剂(200mg)。体系密封,除 氧充氮气保护。然后用注射器加入鼓氮除氧半小时之后的溶剂甲苯(30mL),乙醇(10mL),饱 和碳酸钠水溶液(10mL)。反应时体系避光,80°C下回流反应15小时。待反应结束后,体系冷 却到室温。用二氯甲烷/水萃取反应液3次,收集有机相,有机相浓缩,TLC点板,确认产物点。 粗产物过柱提纯(石油醚/二氯甲烷=1:4)得到产物。产率85 %。
[0081 ] 配合物3d的制备:称取对醛基苯异喹啉(2.5mmol)与IrCh · 3H2〇(lmmol)混合投入 三颈瓶中,在双排管上抽真空-保氮气-抽真空,循环往复三次,最后采用氮气保护整个反应 体系。将体积比为3:1的乙二醇乙醚和水的混合物注射进反应体系中,升温至110°C,磁力搅 拌反应24小时。反应结束后,将体系冷却至室温,过滤沉淀,并用乙醇和水洗,得到的固体产 物即为对醛基苯异喹啉铱二氯桥化合物。称取对醛基苯异喹啉铱二氯桥化合物(lmmol)、2a (2.3mmo 1)加入至三颈瓶中,在双排管上抽真空-保氮气-抽真空,循环往复三次,最后采用 氮气保护整个反应体系。将体积比为2:1的二氯甲烷和甲醇的混合物注入体系中,将温度升 至40°C,搅拌回流。反应5小时后,加入0.72mmol的六氟磷酸钾固体,继续搅拌反应过夜。反 应结束后浓缩提纯,最后用二氯甲烷和正己烷重结晶,得到固体产物即为铱配合物3d。 [00 82] 配合物4d的制备:称取铱配合物3d( lmmol)和盐酸轻胺(5mmol)加入双颈瓶中,在 双排管上抽真空-保氮气-抽真空,循环往复三次,最后采用氮气保护整个反应体系。注入 5mL蒸过的乙醇溶液,5mmo 1蒸过的三乙胺,60 °C混合搅拌4小时。反应结束后,浓缩提纯。得 到红色固体产物即为铱配合物4d。
[0083] 配合物Ir4的制备:将4d(0.2mmol)和三苯基磷(2mmol)溶于DMF中,在氮气气氛中 l〇〇°C回流72小时,反应结束后减压旋蒸除去DMF,将得到的油状液体过柱子提纯,得到最终 产物Ir4。
[0084] 本发明的不局限于上述实施例所述的具体技术方案,凡采用等同替换形成的技术 方案均为本发明要求的保护范围。
【主权项】
1. 一种具有线粒体靶向功能的磷光离子型铱配合物探针,其特征在于其环金属配体上 含有次氯酸根(C1CT)识别基团肟基(C = N-〇H),辅助N~N配体上含有线粒体靶向基团三苯基 膦;该铱配合物具有如下结构通式:2. -种如权利要求1所述的具有线粒体靶向功能的磷光离子型铱配合物探针的制备方 法,其特征在于该制备方法的合成路线如下:具体是在氮气保护下,^与三水合三氯化铱在2-乙氧基乙醇/水3:1,v: 0昆合液中ll〇°C密闭反应24小时得到相应的铱二氯桥化合物;再将得到的铱二氯桥化合物 与化合物2在二氯甲烷/甲醇2:1,v: v混合液中氮气保护下40 °C密闭反应4小时,冷却至室温 后加入六氟磷酸钾继续反应1小时,分离提纯得到含有醛基(CHO)的铱配合物3;再将含有醛 基的铱配合物再与盐酸羟胺在乙醇/三乙胺混合液中氮气保护下60°C密闭反应3小时,分离 提纯得到含有肟基团(C = N-〇H)的配合物4;最后将配合物4和三苯基磷溶于DMF中,在氮气 气氛中100°C回流72小时,反应结束后减压旋蒸除去DMF,再经过柱层析提纯得到最终的配 合物探针5。3. -种如权利要求1所述的具有线粒体靶向功能的磷光离子型铱配合物探针的应用, 其特征在于该磷光离子型铱配合物应用于次氯酸根检测。4. 一种如权利要求1所述的具有线粒体靶向功能的磷光离子型铱配合物探针的应用, 其特征在于该磷光离子型铱配合物应用于细胞成像和生物标记。5. -种如权利要求1所述的具有线粒体靶向功能的磷光离子型铱配合物探针的应用, 其特征在于该磷光离子型铱配合物该材料应用于活细胞线粒体的标记。
【文档编号】G01N21/64GK106046059SQ201610398197
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月6日
【发明人】许文娟, 赵强, 杨继光, 黄维, 刘淑娟, 杨靖, 陈键, 狄隆康
【申请人】南京邮电大学
再多了解一些
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