1?甲基?β?咔啉?3?RGDS作为VEGF?siRNA递送载体的制备
【专利摘要】本发明涉及一种抗肿瘤活性两亲性载体膜材：1?甲基?β?咔啉?3?精氨酸?甘氨酸?天冬氨酸?丝氨酸(CRS)，以及该两亲性载体膜材的制备方法。
【专利说明】
1-甲基-β-咔啉-3-RGDS作为VEGF-S i RNA递送载体的制备
技术领域
[0001] 本发明涉及新合成的1-甲基-β-咔啉-3-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸两亲性 膜材制备的CRS和载VEGF-siRNA的CRS，尤其CRS和VEGF-siRNA的CRS及其构建方法，本发明 还涉及药物载体在制备VEGF-siRNA的CRS中的应用，属于生物医药学领域。
【背景技术】
[0002] 近年来，基因层次的肿瘤治疗受到广泛关注。在基因干预肿瘤的各种手段中，小干 扰RNA(siRNA)可以特异性抑制基因表达，通过抑制肿瘤细胞中影响其生长的高表达基因而 达到抗肿瘤作用。据报道，大多数实体瘤中血管内皮生长因子(VEGF)大量存在，它与血管内 皮生长因子受体2结合(VEGFR-2)，促进肿瘤细胞周围血管生成，从而加速肿瘤生长及侵袭。 然而由于水溶性及负电性，裸露的siRNA在体内无法起到有效作用，它在循环中很快就会被 降解并且很难穿透细胞膜。因此，研究者们一直致力于siRNA有效载体的研究。
[0003] 脂质体，作为较为成熟并被广泛研究的载体，不仅可用于化学药物的包载，其阳离 子化形式也被用于siRNA的携带。阳离子脂质体，可以通过电性吸附作用，吸附负电性的 siRNA并结合于负电性的细胞外膜，从而包载、转染siRNA。然而，近年来很多相关研究表明， 阳离子脂质体缺乏靶向性，并且具有一定的毒性。因此，研究者们都在追寻一种具有正电 性、细胞亲和性、低毒性及靶向性的载体。
[0004] RGD(Arg-Gly-Asp)靶向肽作为一种跨膜的糖蛋白，通过与细胞表面的整合素受体 结合，从而介导细胞粘附作用。在各种靶向肽中，RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser)靶向肽与肿瘤细 胞表面的整合素受体具有高亲性并且能够抑制细胞粘附现象，从而起到抗炎、抗血管生成。 抗肿瘤侵袭的作用。如今，由于RGDS的肿瘤靶向性、长循环性及亲水性，许多研究者将其作 为抗肿瘤药物的修饰与优化药效团来使用。
[0005] 传统肿瘤化疗药物中，DNA嵌插化合物被研发用于抗肿瘤治疗。20世纪80年代的研 究中，研究者们确认骆驼蓬种子中抗肿瘤作用的吲哚生物碱主要是咔啉和去氢-β_咔啉。 具有亲脂性的咔啉通过嵌插入DNA从而发挥潜在抗肿瘤活性。研究表明在其1位引入-CH 3,在3位引入氨基酸类物质可以提高咔啉类物质抗肿瘤活性并降低毒性。
[0006] 基于如上所述，在本文研究中，我们将RGDS靶向和1-甲基-β-咔啉-3-羧酸化合物 相连接，形成全新的化合物。此种化合物与脂质体材料中的磷脂性质相似，具有一定的亲水 性和亲脂性，可以形成纳米级的正电性结构。我们将此种材料作为载体，对其性质进行研 究。通过基因压缩和正交试验等方法使其包载可以沉默VEGF基因的VEGF-siRNA，并且对其 细胞水平、蛋白水平、核苷酸水平的抗肿瘤及基因沉默作用进行研究，并通过S180荷肉瘤小 鼠验证其活体内的靶向性、载体低毒性及肿瘤抑制作用。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的之一在于提供一种抗肿瘤活性两亲性载体膜材：1_甲基-β-咔啉-3-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸(或简称为CRS)。
[0008] 本发明的目的之二在于提供两亲性载体膜材CRS(1_甲基-β-咔啉-3-精氨酸-甘氨 酸-天冬氨酸-丝氨酸)的制备方法，包括以下步骤：
[0009] 1)1-甲基-β-咔啉-3-羧酸的合成
[0011] 其中，① :CH3CH0/H+，②:SOCI2/CH3OH，③:KMn〇4/CH3COCH3，④:NaOH ·
[0012] 2)1-甲基-β-咔啉-3-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸的合成路线：
[0014] ⑤：DCC/HOBt/NMM，⑥：TFA/TfOH(TFA:trifluoroacetic acid;TfOH: Trifluoromethanesulfonic acid)，⑦:HCl-EtOAc
[0015] 本发明的目的之三在于提供一种药物组合物，含有以下成分:抗肿瘤基因治疗药 物VEGF-siRNA，和1-甲基-β-咔啉-3-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸。
[0016] 优选的，本发明所述药物组合物，由以下成分组成：抗肿瘤基因治疗药物VEGF-siRNA，胆固醇，小牛胸腺DNA，鱼精蛋白和1-甲基-β-咔啉-3-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝 氨酸。另外，根据需要可以加入卵磷脂。
[0017] 进一步优选的，本发明所述药物组合物，由以下单位为质量百分比的成分组成： 抗肿瘤基因治疗药物VEGF-siRNA 0.14%-0.96% 卵磷脂 0-67.34%:， 胆固醇 8.98%
[0018] 1-甲基-β-咔啉-3-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸 22.45%-89,78%。 小牛胸腺DNA 0,01% 鱼精蛋白 0,27%-1.08%
[0019] 更优选的，本发明所述药物组合物，由以下单位为质量百分比的成分组成： 抗肿瘤基因治疗药物VEGF-siRNA 0.96% 卵磷脂 0%
[0020] 胆固醇 8.98% 1_甲基?咔啉_3_精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸 8:9、謂％。 小牛胸腺DMA 0.01%
[0021] 鱼精蛋白 0.27%
[0022] 本发明的目的之四在于提供药物组合物的制备方法，包括以下步骤：
[0023] 将1-甲基-β-咔啉-3-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸用氯仿、甲醇溶解，旋转蒸 发去除溶剂，加入lmL DEPC水水化，探头超声15分钟，得CRS纳米溶液。按VEGF-siRNA/CRS(y L): VEGF-siRNA(pmol) =0.83-1.33，以移液枪吸取相应体积的上述脂质体纳米溶液，加入 RNase-free EP管，以RNase-free water稀释混勾后，基因压缩法加入VEGF-siRNA水溶液 中，轻柔吹打10次，室温静置20min，即得。
[0024] 优选的，本发明药物组合物的制备方法，包括以下步骤：
[0025]将10mg 1-甲基-β-咔啉-3-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸(CRS)、lmg胆固醇用 氯仿、甲醇溶解，旋转蒸发去除溶剂，加入lmL DEPC水水化，探头超声15分钟，得CRS纳米溶 液。以移液器吸取60yL CRS纳米溶液，加入RNase-free EP管，以RNase-free water稀释混 匀后，加入15yL鱼精蛋白（120yg)，混合孵育lOmin，将1.2yL小牛胸腺DNA(1.60yg)加入9yL VEGF-siRNA(15.96yg)水溶液中，混合孵育lOmin，将CRS复合液与VEGF-siRNA复合液混合， 轻柔吹打10次，室温静置20min，即得。
[0026]本发明的目的之四在于提供一种载体CRS，主要由卵磷脂，胆固醇，和1-甲基-β-咔 啉-3-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸组成。
[0027]本发明的目的之五在于提供一种载基因 CRS的基因压缩方法，将CRS和VEGF-siRNA 经鱼精蛋白和小牛胸腺同时压缩，提高基因包载率。
[0028]本发明的目的之六在于提供本发明的药物在制备治疗肿瘤中的应用。
[0029] 本发明涉及以宫颈癌HeLa细胞株为模型，用MTT法评价所述的VEGF-siRNA/CRS、 CRS的抗肿瘤活性，结果显示VEGF-s iRNA/CRS具有更优异的抗肿瘤活性。
[0030] 本发明涉及以宫颈癌HeLa细胞株为模型，通过ELISA测定蛋白水平的基因沉默效 率，通过RT-PCR测定mRNA水平的基因沉默效率，结果表明，VEGF-s iRNA/CRS与市售转染试剂 及裸露VEGF-siRNA相比，基因沉默效率更高，说明其更优异的抗肿瘤活性。
[0031] 本发明涉及以S180荷肉瘤小鼠和健康小鼠为模型，通过小动物荧光测定CRS的靶 向性，通过急性毒性实验测定CRS的安全性，通过肿瘤抑制实验测定VEGF-siRNA/CRS的肿瘤 抑制作用。结果表明，VEGF-s iRNA/CRS、CRS与阳性药及裸露VEGF-s iRNA相比，具有明显的肿 瘤抑制作用，VEGF-s i RNA/CRS作用更强。
[0032] 本发明相对于现有产品而言，有益效果主要表现在：
[0033] 将1-甲基-β-咔啉-3-羧酸与RGDS通过液相接肽方法合成得到1-甲基-β-咔啉-3-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸，制备成CRS载体，相比普通脂质体及阳离子脂质体具有 显著的抗肿瘤效果。本课题设计的CRS设计用于siRNA递送载体的研究工作，未见国内外文 献报道，结构设计上具有创新性。
[0034] 将全新的CRS加载VEGF-siRNA肿瘤新血管生成的siRNA，提高了 siRNA的肿瘤靶向 性和转染效率，表现出促进siRNA细胞摄取能力和基因沉默效应。此方面的研究未见文献报 道。
[0035]对本发明中所记载的相关术语作进一步的解释：
[0036] CRS: 1-甲基-β-咔啉-3-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸
[0037] 载基因 CRS:含有VEGF-siRNA和CRS的药物
[0038] VEGF:血管内皮生长因子
[0039] VEGF-siRNA:血管内皮生长因子小干扰核糖核酸，属于现有产品，可以在市场购买 到
[0040] RGDS(Arg-Gly-ASp-Ser):精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸四肽 [0041 ] DEPC water:经焦碳酸二乙酯处理过并经高温高压灭菌的纯水 [0042] HeLa:人宫颈癌细胞株
[0043] RNase-free EP管:无 RNA降解酶的EP管
[0044] RNase-free water:无 RNA降解酶的纯水
[0045] THF:四氢呋喃
[0046] DCC:二环己基碳二亚胺
[0047] D⑶:二环己基脲
[0048] HOBt: 1-羟基苯并三唑
[0049] NMM:氮甲基吗啉
[0050] TFA:三氟乙酸 [0051 ] TfOH:三氟甲磺酸
[0052] HCl-EtOAc:饱和溶解盐酸气体的乙酸乙酯溶液 [0053] Boc-Arg(Tos):羧基裸露的精氨酸 [0054] HC1 · Gly-OBzl:氨基裸露的甘氨酸
[0055] B〇C-Arg(T〇S)-Gly-0Bzl:精氨酸-甘氨酸二肽 [0056] B〇C-Arg(T〇S)-Gly:羧基裸露的精氨酸-甘氨酸二肽 [00 57] Boc-Asp(OBzl):羧基裸露的天冬氨酸
[0058] HC1 · Ser-OBzl:氨基裸露的丝氨酸
[0059] Boc-Asp(0Bzl)-Ser_0Bzl:天冬氛酸-丝氛酸二妝
[0000] HC1 · Asp(0Bzl)-Ser_0Bzl:氨基裸露的天冬氨酸-丝氨酸二肽
[0061 ] Boc-Arg(Tos)_Gly-Asp(0Bzl)-Ser-0Bzl:各基团全保护的精氨酸-甘氨酸-天冬 氨酸-丝氨酸四肽
[0062] HC1 · Arg(Tos)-Gly-Asp(0Bzl)-Ser-0Bzl:氨基裸露的精氨酸-甘氨酸-天冬氨 酸-丝氨酸四肽
[0063] PC:磷脂
[0064] CH:胆固醇
[0065] DMEM:含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，用于细胞培养
[0066] lipo?2000:市售转染试剂
[0067] CCK-8:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑 单钠盐，用于细胞活力测定
[0068] BCA: 2，2-联喹啉-4，4-二甲酸二钠，用于总蛋白浓度测定
[0069] calibrator Diluent RD5K:校准品稀释液，用于VEGF蛋白浓度测定 [0070] wash buffer:洗液，用于VEGF蛋白浓度测定
[0071] VEGF con jugate: VEGF共辄剂，用于VEGF蛋白浓度测定 [0072] substrate solution:显色剂，用于VEGF蛋白浓度测定 [0073] stop solution:反应终止液，用于VEGF蛋白浓度测定
[0074] VEGF standard:VEGF标准液，用于VEGF蛋白浓度测定 [0075] Trizol:细胞裂解液，用于RNA抽提
[0076] VEGF-mRNA:血管内皮生长因子信使核糖核酸 [0077] RT EnzymeMix:用于VEGF信使核糖核酸的测定
[0078] Optical adhesive film:封板膜
[0079] laqMan?Gene ExpressionMaster Mix:用于VEGF信使核糖核酸的测定
[0080] l_aqMan￡:Gene Expression Assays:用于VEGF信使核糖核酸的测定
[0081] To-pro:含有Cy3的荧光染料
【附图说明】
[0082] 图 1、CRS 与 VEGF-s iRNA/CRS 粒径、电位比较(η = 3)
[0083] 图2、倒置显微镜下Hela细胞
[0084] 图 3、CRS与载VEGF-s iRNA/CRS对He la细胞存活率比较(η = 3)
[0085] 图4、CRS与载VEGF-s i RNA/CRS对He 1 a细胞蛋白沉默水平比较(η = 3)
[0086] 图 5、CRS与载VEGF-s iRNA/CRS对He la细胞mRNA沉默水平比较(η = 3)
[0087] 图6、CRS、Cy3荧光素与Cy3_CRS不同浓度下荧光比较 [0088]图7、CRS的S180荷肉瘤小鼠体内荧光分析
[0089] 图 8、CRS与载VEGF-s iRNA/CRS的瘤重比较(η = 10)
[0090] 图 9、CRS 与载 VEGF-s i RNA/CRS 的瘤体积比较(η = 10)
[0091] 图10、急性毒性实验中CRS的鼠体重变化(η = 8)
[0092] 图11、急性毒性实验中CRS的鼠脏体比比较(η = 8)
[0093] 图12、急性毒性实验中CRS的鼠脏器比较(η = 8)
【具体实施方式】
[0094]为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它 们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
[0095]实施例1异喹啉衍生物的制备 [0096] CRS的制备方法：
[0097] 1)1-甲基-β_咔啉-3-羧酸的合成
[0098] 将400mL水置于500mL茄瓶中，缓慢滴入98%浓硫酸（0.211^)后往混合液中加入1 (5.Og，24.5mmol)，超声使其全部溶解，再滴加40%乙醛(4.5mL，49. Ommol)，反应过夜。待溶 液变为奶白色，浓氨水调PH至6-7,静置lh，抽滤，水洗除盐，滤饼晾干得到1(4.0g，收率 80 %，ESI/MS(m/z)231 [M+H] + )。冰盐浴下，向剧烈搅拌的37.5mL甲醇中缓慢滴加3. OmL二氯 亚砜，冰浴下搅拌40min，加入II (4.0g，17.4mmol)室温反应过夜，薄层色谱显示原料点消 失，溶液呈淡黄色混悬状，水栗抽干甲醇，乙酸乙酯溶解，用大量10 %Na2C03中和至PH = 6-7，分液漏斗分层，留乙酸乙酯层，无水Na2S04干燥2h，抽滤，旋干乙酸乙酯层，得产物III (2.88，11.5111111〇1)。冰浴下，2(2.88，11.5111111〇1，产率70%451/]\^(111/2)245[]\1+!1] + )溶于 200mL丙酮中，缓慢加入KMn04(2.5g，15.9mmol)，冰浴搅拌lh，室温反应过夜，薄层色谱显示 原料点消失，溶液呈深棕色混悬状，旋干丙酮，甲醇溶解，抽滤，滤液旋干，柱层析（二氯甲 烷：甲醇）梯度分离，得产物 1￥(1.78,6.9111111〇1，产率60%431/^3(111/2)241[1+!1] + )。将1￥ (1.7g，6.9mmol)溶于2N NaOH(41.4mL，8.3mmol)中，60°C油浴反应3h,薄层色谱显示原料点 消失，溶液呈黄棕色溶液，放置至室温，浓盐酸中和至PH = 7,大量黄绿色固体析出，冷却静 置111，抽滤，得￥(1.368,5.9111111〇1，产率80%451/]^(111/2)227[]\1+!1] + )。
[0100] 1-甲基-β-咔啉-3-羧酸的合成路线，①：CH3CH0/H+，②：SOCl2/CH 3OH，③：KMn〇4/ CH3COCH3，?:NaOH·
[0101] 2)全保护RGDS合成
[0102] 将Boc-Arg(Tos) (5 · 0g，11 · 7mmol)置于250mL茄瓶中，THF搅拌溶解，加入HOBt (1 · 6g，11 · 7mmol)，冰浴条件下加入THF溶解的DCC(2 · 9g，14 · Ommol)，活化30min，再缓慢加 入HC1 · Gly-〇Bz 1 (2 · 4g，11 · 7mmol)，NMM调PH = 8-9，反应过夜，薄层色谱显示原料点消失， 滤除DCU，旋干THF，残留物用150mL乙酸乙酯溶解。所得溶液依次用饱和NaHC0 3水溶液洗三 次、饱和NaCl水溶液洗三次、5 % KHS04水溶液洗三次、饱和NaCl水溶液洗三次、饱和NaHC03水 溶液洗三次和饱和NaCl水溶液洗三次。分液漏斗分层留乙酸乙酯层，用无水Na 2S〇4干燥、过 滤、滤液减压浓缩至干，得到淡黄色固体粉末Boc-Arg (Tos) -G1 y-〇Bz 1 (6.1 g，10.6mmo 1，产 率90%，ESI/MS(m/z)576[M+H] + );同样方法，以Boc-Asp(0Bzl)(5.0g, 15.5mmol)，DCC (3· 8g, 18.6mmol)，H0Bt(2· lg，15· 5mmol)与HC1 · Ser-〇Bzl(3 ·6g，15 · 5mmol)连接合成淡黄 色膏状物8〇(3-厶8口（0821)-561-0821(6.98，13.8111111〇1，产率89%451/]\^(111/2)538[]\1+!1] + )〇 将13〇(：-厶找(1'〇8)-617-01321(6.18，10.61]11]1〇1)置于2501111^前瓶中，溶于2001111^甲醇，加入0.6区 Pd/C(10%)，通H2(0.02Mba)，室温搅拌至薄层色谱显示原料点消失。滤除Pd/C、滤液减压旋 蒸至干，得到纯白色固体粉末13〇(3-厶找(1'〇8)-617(4.68,9.51]1111〇1，产率90%431/]\^(111/2) 486[M+H] + );将Boc_Asp(0Bzl)-Ser-〇Bzl(6 · 9g，13 · 8mmol)溶解在35mL 4mol/L氣化氛-乙 酸乙酯溶液中，室温搅拌4小时，薄层色谱显示原料点消失，水栗抽干乙酸乙酯，残留物反复 加少量乙醚进行水栗抽干以除去氯化氢气。最后加少量乙醚将残留物研磨成白色粉末状 !0.八8?(0821)-56广0821(4.18，10.3臟〇1，产率75%451/]\^(111/2)435[]\1-!1]-)。将8〇。-Arg(Tos)_Gly(5 .Og, 10 ·3mmol)和HC1 · Asp(OBzl)-Ser-〇Bzl(4. lg，10· 3mmol)按照之前的 连接方法进行液相缩合，DCC(2.5g, 12.36mmol)，H0Bt(l .4g, 10.3mmol)，形成Boc-Arg (1'〇8)-617-厶8?(0821)-56广0821(6.38,7.2_〇1，产率70%451/]\^(111/2)902[]\1-!1]-)，柱层 析(二氯：甲醇)梯度分纯。
[0103] 3)1-甲基-β-咔啉-3-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸终产物的合成
[0104] 将纯化后的 Boc_Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl )-Ser-〇Bzl (1 · Og，1 · 2mmol)溶解在 5mL 4mol/l氯化氢-乙酸乙酯溶液中，室温搅拌4小时，薄层色谱显示原料点消失，水栗抽干乙酸 乙酯，残留物反复加少量乙醚进行水栗抽干以除去氯化氢气。最后加少量乙醚将残留物研 磨成白色粉末状HC1 · Arg(Tos )-Gly_Asp(0Bzl )-Ser_0Bzl (0 · 62g，0 · 8mmol，产率70 %， ESI/MS(m/z)241[M+H] + )。将VI(0·2g，0·8mmol)溶解于DMF中，搅拌下加入H0Bt(0·lg， 0 · 8mmol)，冰浴条件下加入DMF溶解的DCC(0 · 2g，0 · 96mmol)，活化30min，再缓慢加入HC1 · Arg(Tos)-Gly-Asp(0Bzl)-Ser-0Bzl(0.62g，0.8mmol)，NMM调PH=8_9,反应过夜，薄层色谱 显示原料点消失，滤除DCU，吹干DMF，残留物用150mL甲醇溶解，减压旋干得到蛋黄色产物 VII(0.3g，0.8mmol，产率40%，ESI/MS(m/z)241[M+H] + )，柱层析(二氯：甲醇)梯度纯化后， 冰浴下溶于6mL三氟乙酸，加入1.5mL三氟甲磺酸，反应30min，加入乙醚磨洗，反复多次，最 后水栗抽干，得到终产物VIII(0.2g，0. lmmol，产率87% )，呈荧光黄色粉末状。
[0106] 1-甲基-β-咔啉-3-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸终产物的合成路线，
[0107] ⑤：DCC/HOBt/NMM，⑥：TFA/TfOH，⑦：HCl-EtOAc(TFA:trifluoroacetic acid; TfOH:Trifluoromethanesulfonic acid).
[0108] 1HMMR(300MHz，DMS0-d6)S/ppm=12.02(s，lH)，8.35(d，7.8Hz，2H)，8.28(d，= 8.1Hz，lH)，7.95(d，7.8Hz，lH)，7.62(m，lH)，7.95(dd，=4.5Hz，lH)，7.29(m，2H)，4.69(m， 2H)，4.25(m，lH)，4.04(m，lH)，3.89(m，lH)，3.81(m，lH)，3.63(m，2H)，3.15(m，2H)，2.86(s， 3H)，1.84(m，lH)，1.57(m，2H).
[0109] 13C NMR( 125MHz, DMS0-d6)5/ppm= 174.07,173.95,172.08,170.18,168.19, 164.61,157.75,141.58,141.33,138.47,136.47,128.80,127.88,122.60,121.88,120.44, 112.71.63.04,55.93,55.36,52.22,51.79,49.06,42.96,31.24,24.68,20.97.
[0110] ESI-MS(m/z)640[M-H] -·
[0111] IR(KBr)3343.42,3216.03,1722.30,1651.68,1627.85,1547.34,1515.79, 1364.64,1240.57,1223.98,1166.57,1026.54,909.35,813.73,759.97,635.74.
[0112] UV光谱中最大吸收峰波长为271.0nm.271.0nm检测波长下，HPLC测定纯度为 95.06%〇
[0113] 实施例2.载体CRS的制备 [0114]膜材及药物溶液的配制：
[0115] 采用薄膜分散法制备CRS，膜材及药物溶液的配制方法如下：
[0116] 10mg/mL磷脂(PC)的氯仿溶液：10mg PC以适量氯仿溶解，转入lmL棕色容量瓶，以 氯仿定容；
[0117] 10mg/mL胆固醇(CH)的氯仿溶液：10mg CH以适量氯仿溶解，转入lmL棕色容量瓶， 以氯仿定容；
[0118] l〇〇mg/mLl-甲基-β-咔啉-3-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸的氯仿、甲醇混合 溶液：100mg 1-甲基-β-咔啉-3-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸以适量甲醇溶解，转入 25mL棕色容量瓶，以氯仿定容；
[0119] 10mg/mL Tween 80的DEPC水溶液：100mg Tween 80以适量氯仿溶解，转入10mL棕 色容量瓶，以DEPC水定容；
[0120]按相应的比例量取适量膜材溶液，加入茄瓶，据预实验摸索，以脂质材料比、膜材 比、吐温80含量、超声时间为筛选因素按L9(34)正交表设计进行三因素四水平正交试验。按 (A)脂质材料比（PC:CRS m/m)40:60、30:70、0:100量取PC的氯仿溶液及1-甲基-β-咔啉-3-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸的氯仿、甲醇混合溶液，按(Β)膜材比(PC+CRS:CH m/m)5: 1、10 :1、15 :1量取CH的氯仿溶液加入茄瓶中，37°C水浴、120rpm、真空度250mbar梯度降至 lmbar，旋转蒸发除去有机溶剂，形成均一薄膜。按(C)吐温80含量(Tween 80m/v)0%，1%、 2%乳化液DEPC水水化，按(D)超声时间（timemin)5min、10min、15min探头超声，得到载体 CRS,
[0121 ]粒径 100-200nm 左右，Zeta-Potential-25 至 40mV 左右（1-甲基-β-味啉-3-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸越多，Zeta-Potential越正）。
[0122] 表1.CRS三因素四水平L9(34)正交试验
[0125] 通过上述正交实验，得到优选的比例关系为：
[0126] 磷脂:1_甲基-β-咔啉-3-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸= 0:100(mg/mg);
[0127] (磷脂+1-甲基-β-咔啉-3-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸）：胆固醇= 10: l(mg/ mg)
[0128] 乳化剂含量:l%(g/100mL)
[0129] 探头超声时间：15min
[0130] 实施例3.含有CRS的药物制备 [0131 ]载体CRS参照实施例2方法制备。
[0132] 以移液器吸取60mL载体CRS(含量为25%，50%，75%，100% )，加入RNase-free EP 管，加入不同体积鱼精蛋白（2mg · mL-1)，DEPC水补至120yL，快速吹打均匀，室温静置20min。
[0133] 以移液器吸取9yL VEGF-siRNA溶液（10uM)，加入RNase-free EP管，加入不同体积 小牛胸腺DNA(lmg · mL-iDEPC水补至120yL，快速吹打均匀，室温静置lOmin。
[0134] 粒径80_150nm左右，Zeta-Potential 0至 15mV左右。
[0135] 实施例4.含有CRS和VEGF-siRNA的药物组合物
[0136] 将10mg 1-甲基-β-咔啉-3-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸(CRS)、lmg胆固醇用 氯仿、甲醇溶解，旋转蒸发去除溶剂，加入lmL DEPC水水化，探头超声15分钟，得CRS纳米溶 液。以移液器吸取60yL CRS纳米溶液，加入RNase-freeEP管，以RNase-free water稀释混勾 后，加入15yL鱼精蛋白（120yg)，混合孵育lOmin，将1.2yL小牛胸腺DNA( 1.60yg)加入9yL VEGF-siRNA(15.96yg)水溶液中，混合孵育lOmin，将CRS复合液与VEGF-siRNA复合液混合， 轻柔吹打10次，室温静置20min，即得。
[0137] 实施例5. VEGF-siRNA/CRS的体外抗肿瘤活性评价
[0138] 细胞培养：
[0139] 培养环境:37°C、体积分数为5%的C02饱和湿度的恒温培养箱；
[0140] 培养液:转染用空白DMEM培养基，10 %完全DMEM培养基(含10 %灭活的胎牛血清， 青霉素浓度最终为l〇〇U/mL，硫酸链霉素的浓度最终为100yg/mL);
[0141] 传代方法:每2-3天，观察细胞长势，融合度达80-90 %胰酶消化，1:3传代
[0142] 倒置显微镜下观察，HeLa细胞呈贴壁生长，梭形，边缘及细胞核清晰，分布均匀，形 状类似铺路石。
[0143] 药物配制：
[0144] l)VEGF-siRNA/CRS:准备VEGF-siRNA的DEPC水溶液适量，按电泳实验配比加入四 种CRS，基因压缩法制备复合物，空白DMEM梯度稀释，备用。
[0145] 2)CRS:参考1)，VEGF-siRNA的DEPC溶液用同体积DEPC水代替，用空白DMEM按梯度 稀释，备用。
[0146] 3)VEGF-siRNA/lipo?2000:准备VEGF-siRNA的DEPC水溶液适量，参考说明书，制备 复合物，空白DMB1按梯度稀释，备用。
[0147] 4) VEGF-s iRNA: VEGF-s iRNA的DEPC水溶液适量。用空白DMEM梯度稀释，备用。
[0148] 5)空白组:孔中正常培养HeLa细胞，给药时不给药，等量含DEPC水的DMEM代替。
[0149] 6)调零组:孔中无细胞，其他处理痛实验组。
[0150] 实验方法：
[0151] 将HeLa细胞接种于75cm2培养瓶中，10 %完全DMEM培养，37°C，5%C02饱和湿度中培 养。待细胞长至对数期，胰酶消化，孔板接种。
[0152] 给药前，小心取弃培养基，加入1.2.4配制溶液，100μL7孔，每组6个复孔，培养4h。
[0153] 转染完成后，小心取弃上清液，加入10 %完全培养基，lOOyL/孔，每组6个复孔，继 续培养48h。
[0154] 48h后，加入CCK-8，lOOyL/孔，每组6个复孔，微型振荡器震荡lOmin，600r，混匀后 继续培养4h。在酶标仪测定检测波长490nm的吸光度（0D)值，计算细胞存活率。存活率= {(AS-AB)/(AC-AB)} X100%AS:给药组;AB:调零组;AC:空白组
[0155] 结果：
[0156] 由表 1、表2及表3可见，VEGF-siRNA/CRS(25% ,40% ,75%，100%CRS)相比较游离 的VEGF-siRNA显示明显的肿瘤细胞抑制作用，浓度越高，抑制作用越明显，并且CRS含量越 大，在高浓度下会产生强抑制作用，但l〇〇%CRS和75%CRS在ΙΟΟηΜ和125nM下差别不大，分 析可能是ΙΟΟηΜ已经足够完成VEGF的抑制作用，浓度的增加不会再引发变化。CRS(25%， 40%，75%，100%CRS)相比较游离的VEGF-siRNA显示明显的肿瘤细胞抑制作用，浓度越高， 抑制作用越明显。但与VEGF-siRNA/CRS组相比，抑制作用较弱。
[0157] 表2.转染4h继续培养48h对照组HeLa细胞存活率(n = 3)
[0159] 表3.转染4h继续培养48h VEGF-siRNA/CRS组HeLa细胞存活率(n = 3)
[0162] 表4.转染4h继续培养48h CRS组HeLa细胞存活率(n = 3)
[0164] 由图3可以看出，在实验浓度范围内：
[0165] 1)由阴性对照的高存活率，和阳性对照组的抑制率，证明了细胞模型的成功。
[0166] 2)空白CRS-1 ipsome和VEGF-siRNA/CRS在低浓度时差异不明显，高浓度时均有明 显差异。证明了细胞抑制不仅来自于载体本身，更有VEGF-s iRNA的沉默作用。
[0167] 3)空白100%CRS组相比其他组细胞抑制作用较弱，分析原因，可能其他组均源于 脂质材料和CRS联合作用，而100 %组仅体现CRS的抑制作用。
[0168] 4)各组中，100%CRS组载基因和不载基因组差异较大，表现了明显的基因抑制作 用，较其他三种具有明显优势，继续进行后续研究。
[0169] 实验例6. VEGF-siRNA/CRS蛋白水平沉默效率的评价
[0170] 药物配制：
[0171] l)VEGF-siRNA/CRS:准备VEGF-siRNA的DEPC水溶液适量，按第二章中电泳配比加 入100 % CRS，基因压缩法制备复合物，空白DMEM梯度稀释，备用。
[0172] 2) CRS:参考1)，VEGF-s iRNA的DEPC溶液用同体积DEPC水代替，用空白DMEM按梯度 稀释，备用。
[0173] 3)VEGF-siRNA/lipo?2000:准备VEGF-siRNA的DEPC水溶液适量，参考说明书，制备 复合物，空白DiffiM按梯度稀释，备用。
[0174] 4) VEGF-s iRNA: VEGF-s iRNA的DEPC水溶液适量。用空白DMEM梯度稀释，备用。
[0175] 5)空白组:孔中正常培养HeLa细胞，给药时不给药，等量含DEPC水的DMEM代替。
[0176] 实验方法：
[0177] 1)将HeLa细胞接种于75cm2培养瓶中，10%完全DMEM培养，37°C，5%C0 2饱和湿度中 培养。待细胞长至对数期，胰酶消化，孔板接种；
[0178] 2)给药前，小心取弃培养基，加入配制溶液，500yL/孔，每组3个复孔，培养4h。
[0179] 3)转染完成后，小心取弃上清液，加入10 %完全培养基，500μ!7孔，每组3个复孔， 继续培养48h;
[0180] 4)48h后，分别将每孔的上清液取出，转移至2mL EP管，4°C，1000rpm离心5min，离 心结束后，小心取出离心后的上清液，转移至新的2mLEP管内，标记，全程冰上操作。
[0181] 总蛋白测定：
[0182] 1)将solutionA摇晃混勾，根据样品数量，按50:1混合solution A和solutionB，配 制成新鲜的BCA工作液，充分混匀。24小时内有效；
[0183] 2)稀释标准品：完全溶解蛋白质标准品（5mg/MlBSA，-20 °C保存)取10yL用三蒸水 稀释至1 〇〇yL，达到终浓度0.5mg/mL;
[0184] 3)将稀释后的标准品（0 · 5mg/mL)作为母液，逐级稀释到0 · 25mg/mL，0 · lmg/mL, 0 · 05mg/mL，0 · 25mg/mL，0 · 125mg/mL，0 · 025mg/mL，，溶液体积定20yL。在酶标仪上测定562nm 下吸光值，制作标准曲线；
[0185] 4)加20yL稀释好样品到96孔板的样品孔中，各孔中加入200yLBCA工作液，这时使 用加样枪轻柔吹打，涡旋混匀，避免气泡产生，如果产生，l〇〇〇rpm离心5min，可减少气泡37 °C放置60min。将液体冷却至室温，在酶标仪上测定562nm下吸光值，根据标准曲线，计算各 组总蛋白浓度。
[0186] VEGF蛋白测定：
[0187] 1)将各种试剂及样品移至室温平衡至少30分钟；
[0188] 2)配制倍比稀释的标准品VEGF standard
[0189] 3)取lmL calibrator Diluent RD5K加入VEGF standard试剂瓶中，轻柔振荡 15min。取2mL EP管8支，每管加入500yL calibrator Diluent RD5K，命名管 1 至管8。取500μ L VEGF standard溶液加入管1，然后依次取500yL混匀后的溶液加入后面的管子，倍比稀 释；
[0190] 4)加样：分别设空白孔、标准品孔、待测样品孔。空白孔加 calibrator Diluent RD5K。其余每孔分别加标准品或待测样品200yL，轻轻晃动混匀，覆上板贴，室温孵育2h;
[0191 ] 5)配制1 Xwash buffer:以三蒸水将25 Xwash buffer稀释25倍，按400yL每孔及 洗涤次数计算需要的量；
[0192] 6)弃去孔内液体，甩干，400yL wash buffer洗3次，最后一次倒扣在干净的滤纸上 轻拍至无液体。每孔加 VEGF con jugate 200yL，覆上板贴，室温孵育2h。弃去孔内液体，甩 干，洗板三次。每次浸泡2分钟，400yL/孔，甩干；
[0193] 7)避光，每孔加 substrate solution 200yL，覆上板贴，室温孵育显色20min。
[0194] 8)每孔加入50yL stop solution,终止反应。若颜色变化不一致，则轻拍板子以混 匀。在反应终止30分钟内用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度。
[0195] 实验结果：
[0196] 由图4可以看出：
[0197] l)Blank、VEGF-siRNA、100%CRS组VEGF蛋白分泌含量无统计学差异，说明此三种 给药均无法起到下调蛋白表达的效果。
[0198] 2)VEGF-siRNA/lipo?2000组蛋白表达明显降低，VEGF-siRNA组无变化，证明了细 胞模型的成功。
[0199] 3)VEGF-siRNA/100%CRS组与VEGF-siRNA具有明显显著学差异，并且随着升高，蛋 白表达越低，符合基因沉默的规律。
[0200] 4)当VEGF-siRNA/100%CRS在ΙΟΟηΜ和125nM时差异不明显，与细胞存活率实验结 果相同，进一步说明1〇〇ηΜ时siRNA的沉默作用已大致表达完成，浓度的增加不会引起太多 变化。
[0201] 5 ) VEGF-siRNA/100 % CRS在siRNA浓度为lOOnMSP 可达到与VEGF-siRNA/ lip〇TM2000组相似的蛋白下调效果，表现了研发的新复合物VEGF-siRNA/100%CRS的高基 因沉默作用。
[0202] 6) 100 % CRS组与Blank组无统计学差异，说明不载VEGF-siRNA的情况下，载体无法 产生下调蛋白表达的作用，结合细胞生存率实验分析，证明了载体的毒性作用来自于膜材 部分的化学抗肿瘤作用。
[0203] 实验例7. VEGF-siRNA/CRSmRNA水平沉默效率的评价
[0204] 药物配制：
[0205] l)VEGF-siRNA/CRS:准备VEGF-siRNA的DEPC水溶液适量，按第二章中电泳配比加 入100 % CRS，基因压缩法制备复合物，空白DMEM梯度稀释，备用。
[0206] 2)VEGF-siRNA/lipo?2000:准备VEGF-siRNA的DEPC水溶液适量，参考说明书，制备 复合物，空白DMB1按梯度稀释，备用。
[0207] 3) VEGF-s iRNA: VEGF-s iRNA的DEPC水溶液适量。用空白DMEM梯度稀释，备用。
[0208] 4)空白组:孔中正常培养HeLa细胞，给药时不给药，等量含DEPC水的DMEM代替。
[0209]实验方法：
[0210] 细胞全RNA提取：
[0211] 1)取培养48h的细胞培养板，小心并充分的取弃上清液，加入Trizol裂解液（lmL/ 孔），取样器反复轻柔全面吹打，至细胞充分裂解，孔板底部透明，吸取裂解液，转移至EP管， 静置5min，冰上保存。
[0212] 2)按体积比氯仿：Trizol =0.2 :1加入氯仿，涡旋混合两相，冰上放置5min，4°C， 12000 Xg，离心15min，离心后管内液体分为三层，上面的无色是水相，下面的红色为苯酸-氯仿相，中间有浑浊漂浮物。所需求的全RNA存在于水相中，小心的吸出水相，转移至新EP管 中。
[0213] 3)按体积比异丙醇:Trizol = 0.5:1加入异丙醇，祸旋混合两相，冰上放置10min，4 °C，12000 X g，离心10min，离心后管壁及底部有白色絮状沉淀，此为RNA。
[0214] 4)吸净上清液，按体积比75%乙醇:Trizol = 1:1，洗涤RNA沉淀，祸旋混合均匀，4 °C，7500Xg，离心5min。
[0215] 5)吸净上清液，空气中晾置lOmin使RNA充分沉淀，DEPC重悬，轻柔吹打，混合均匀， 静置lOmin，，55-60°C水浴lOmin使其充分溶解。
[0216] 6)样品放至室温，吸取2yL Nanodrop-ΙΟΟΟ测定RNA含量。
[0217] 逆转录：
[0218] 1)上样量需要2ug，根据测定的RNA浓度，计算上样体积。
[0219] 2)每个反应孔：MicroAmp? Optical 96-Well Reaction Plate每孔 10yL 2 XRT Buffer+lyL 20XRT EnzymeMix+RNA溶液，总体积20yL，不足用DEPC水不足。加入，Optical adhesive film封住板口。4°C，1000rmp离心lmin，除去气泡，并使液体聚集孔底。
[0220] 3)PCR System 9700中开始cDNA，条件：94Γ5π?η，94Γ3〇8,75Γ3〇8,72Γ258,72 °C7min，4°Cm。循环 30 次。
[0221] 4)样品放至室温，吸取2yL Nanodrop-1000测定cDNA含量。
[0222] RT-PCR：
[0223] 1)上样量需要50ng，根据测定的cDNA浓度，计算上样体积。
[0224] 2)TaqMan?Gene ExpressionMaster Mix、TaqMan?Gene Expression Assays中 的VEGF引物和GAPDH引物冰上融化。
[0225] 3)每个反应孔：MicroAmp? Optical 96-Well Reaction Plate每孔25μ丨TaqlVlan? Gene ExpressionMaster Mix、2 · 5yL引物（VEGF或GAH)H)和cDNA，总体积50yL，不足用DEPC 水不足。Optical adhesive film封住板口。4°C，1000rmp离心lmin，除去气泡，并使液体聚 集孔底。
[0226] 4)Applied Biosystems7500Real_Time PCR System中开始RT-PCR，条件：Hold:50 °C 2min，95 °C lOmin.Cycle(40cycles):95 °C 15sec，60 °C lmin。
[0227] 5)实验过程全程冰上操作。
[0228] 实验结果：
[0229] 由图5可以看出：
[0230] l)VEGF-siRNA/lipo?2000组VEGF mRNA相对含量明显降低，裸VEGF-siRNA组无变 化，证明了细胞模型的成功。
[0231] 2)Blank、VEGF-siRNA组VEGF-mRNA相对含量无统计学差异，说明此三种给药均无 法起到下调mRNA表达的效果。
[0232] 3)VEGF-siRNA/100%CRS组与裸VEGF-siRNA具有明显显著学差异，并且随着升高， mRNA相对含量越低，符合基因沉默的规律。
[0233] 4)当VEGF-siRNA/100%CRS在100nM和125nM时差异不明显，与细胞存活率实验、蛋 白水平结果相同，进一步说明1〇〇ηΜ时siRNA的沉默作用已大致表达完成，浓度的增加不会 引起太多变化。
[0234] 5)VEGF-siRNA/100%CRS 在 siRNA 浓度为 100nM 即可达到与 VEGF-siRNA/lipo?2000 组相似的VEGF-mRNA相对含量下调效果，表现了研发的新复合物VEGF-s iRNA/100 % CRS的高 基因沉默作用。
[0235] 实验例8. CRS的小鼠体内靶向性验证
[0236] 药物配制：
[0237] l)T〇-pro/100%CRS:准备100%CRS溶液适量，按适量配比加入To-pro水溶液(Cy3 荧光标记染料），涡旋均匀，室温孵育lOmin，待用。
[0238] 2)T〇-pr〇/DEPC:将To-pro水溶液(Cy3荧光标记染料)DEPC水稀释到（1)相同浓度， 涡旋均匀，待用。
[0239] 实验方法：
[0240] 1)小鼠尾静脉装置固定小鼠，暴露尾巴，酒精消毒，选取鼠左右支尾静脉其中一 支，注射配制好的样品，200μ!7只。
[0241 ] 2)注射完成后，在第15min，30min，60min，120min，240min对小鼠进行气体麻醉，放 入In-vivo Image System FX pRo小动物荧光检测器(WL16405-10782 ffff 32725-21479(D) T 1.0mm L 0.4-19.4mm)，固定，照相。
[0242] 实验结果：
[0243] 由图6可看出：
[0244] 空白剂型组和纯Cy3荧光素组荧光强度较弱，但当两种物质孵育包载后，荧光强度 大大增强，对应表尺，FL达25000及以上，这也反映了荧光素和载体的有效连接，为后续小鼠 体内观察提供条件。
[0245] 由图7可看出：
[0246] 1)第Omin即未注射样品时，给药组(A)和对照组(B)鼠体内均无荧光分布。注射后 第15min，给药组(A)鼠右腋下及出现荧光富集，对照组(B)鼠未观察到，持续至第30min，第 60min，给药组(A)药物代谢入肝，肝内出现荧光富集，对照组(B)鼠未出现此现象。第120min 至240min，药物持续代谢，右腋下肿瘤部位荧光光度减弱，但仍然存在。
[0247] 2)整体过程显示了载体进入小鼠体内的代谢途径，右腋下肿瘤部位的富集显示了 材料一定的革G向性。
[0248] 实验例9. VEGF-siRNA/CRS的抗肿瘤活性评价
[0249] 药物配制：
[0250] 1) VEGF-s i RNA/100 % CRS，基因压缩法制备，复合物中VEGF-s i RNA终浓度为0 · 3mg/ kg：
[0251] 2)100%CRS，同（1)，其中 VEGF-siRNA 用 DEPC 水替换；
[0252] 3)VEGF-siRNA，DEPC水稀释至浓度同（1);
[0253] 4) D0X，2μπιο 1 /kg，水溶液配制；
[0254] 实验方法：
[0255] 1)将右侧腋下接种有腹水瘤的小鼠随机分组，每组10只，共5组，称重。各组小鼠正 常饲养，游标卡尺测量肿瘤体积，待肿瘤体积长至80-90_ 3，开始给药。
[0256] 2)给药方式尾静脉注射，每天一次，持续5天。每次尾静脉注射配制好样品0.2mL。 第6天将各组荷瘤小鼠处死，解剖，取瘤。并称体重和瘤重，按抑瘤率(TGI)=[(阴性对照组 平均瘤重一治疗组平均瘤重)/阴性对照组平均瘤重]X 100%计算抑瘤率。获得的数据以 (l±SDg)表示，并做t检验。
[0257] 实验结果：
[0258] 由图8、9可看出：
[0259] 1)NS组和siRNA组无显著性差异(Ρ>0·01)，与D0X组具有显著性差异(Ρ<0·01)， 证明了造模的成功。
[0260] 2)D0X组、CRS组、VEGF-siRNA/CRS组瘤重明显小于NS组和Naked siRNA组，抑瘤率 分别达到52.62%，35.81 %，51.21 %，显示了良好的抗肿瘤活性。
[0261] 3)CRS组与VEGF-siRNA/CRS组相比，后者抑瘤率更高，在证明载体本身具有抗肿瘤 活性的同时，进一步证明了 VEGF-siRNA对肿瘤的抑制作用。
[0262] 4)VEGF-siRNA/CRS组与D0X组相比，抑瘤率差异不大，说明VEGF-siRNA/CRS组在小 鼠体内可达到与D0X组近乎同等的抗肿瘤作用。
[0263] 实验例10. CRS的安全性评价
[0264] 药物配制：
[0265] 100%0?:准备100%0?溶液适量
[0266] 实验方法：
[0267] 1)将健康小鼠随机分组，每组8只，共2组，称重。
[0268] 2)给药方式尾静脉注射，仅第一天1次，剂量为有效剂量100倍。各组小鼠正常饲养 6天，每天称重，观察鼠行为、外观变化。第7天称重、处死，解剖，取心、肝、脾、肾、脑，称重，拍 照，观察形态变化。
[0269] 实验结果：
[0270]行为、外观观察：
[0271] 第1天大剂量给药后，与NS组比，给药组小鼠无明显异常行为，行动良好，无嗜睡现 象，对外界具有良好反应能力。第2天观察，给药组小鼠较NS组皮毛呈微黄色，推测与剂型呈 黄色有关。此后3至7天，行为无异常，毛色中黄色越来越淡，第7天与NS组已无明显差异。
[0272] 由图10，11，12可看出：
[0273] 1)大剂量给药第2天，100 % CRS组小鼠体重有所下降，此后第3至7天，体重逐渐增 加，终体重达到与NS组相当。分析原因，100倍剂量的CRS仍具有一定的毒性，但未致鼠死亡 或产生明显的行为影响，第3至7天，小鼠体重逐渐增加，第7天与生理盐水组体重近乎相等。
[0274] 2)在脏器体重比重的比较中，CRS和NS组各脏体比均无显著性差异，从Fi g. 15.3肉 眼观察也可看出，CRS组保持跟NS-样的良好外观，无变色，无斑点，无损伤产生。
【主权项】
1. 一种抗肿瘤活性两亲性载体膜材：1-甲基-0-咔啉-3-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝 氨酸(CRS)。2. 权利要求1所述的两亲性载体膜材，1-甲基咔啉-3-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝 氨酸的制备方法，包括以下步骤： 1) 1-甲基-0-咔啉-3-羧酸的合成：其中，①:CH3CHO/H+，②:SOCI2/CH3OH，③:KMn〇4/CH3COCH 3，④:NaOH. 2) 1-甲基-0-咔啉-3-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸的合成：其中，⑤：DCC/HOBt/NMM,⑥：TFA/TfOH(TFA: trifluoroacetic acid;TfOH: Trifluoromethanesulfonic acid)，⑦:HCl_EtOAc〇3. -种药物组合物，含有以下成分:抗肿瘤基因治疗药物VEGF-s iRNA，和1-甲基-0-咔 啉-3-精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸-丝氨酸。4. 根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，由以下成分组成:抗肿瘤基因治疗 药物VEGF-siRNA，胆固醇，小牛胸腺DNA，鱼精蛋白和1-甲基-0-咔啉-3-精氨酸-甘氨酸-天 冬氨酸-丝氨酸，根据需要可以加入卵磷脂。5. 根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，由以下单位为质量百分比的成分组 成： 抗肿瘤基因治疗药物VBGF-siRNA 0.14%-0.96% 卵磷脂 0-67.34%， 胆固醇 838% 1-甲基?咔啉-3-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸 22.45%-8:9.78%q ° 小牛胸腺DNA 0.01% 鱼精蛋白 0.27%-1,08%6. 根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，由以下单位为质量百分比的成分组 成： 抗肿瘤基因治疗药物VEGF-siRNA 0.96% 胆固醇 8.98% 1-甲基-P-咔啉-3-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸 89.78%。 小牛胸腺DNA 0.01% 鱼精蛋白 0.27%。7. 权利要求3所述的药物组合物的制备方法，包括以下步骤： 将1-甲基-0-咔啉-3-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸用氯仿、甲醇溶解，旋转蒸发去 除溶剂，加入11^0￡?(：水水化，探头超声15分钟，得0?纳米溶液，按￥￡6?-811?嫩/0?(此）： VEGF-siRNA(pmol) = 0.83-1.33，以移液枪吸取相应体积的上述脂质体纳米溶液，加入 RNase-free EP管，以RNase-free water稀释混勾后，基因压缩法加入VEGF-siRNA水溶液 中，轻柔吹打10次，室温静置20min，即得。8. 权利要求3所述的药物组合物的制备方法，包括以下步骤： 将10mg 1-甲基-0-咔啉-3-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸（CRS)、lmg胆固醇用氯 仿、甲醇溶解，旋转蒸发去除溶剂，加入lmL DEPC水水化，探头超声15分钟，得CRS纳米溶液， 以移液器吸取60tiL CRS纳米溶液，加入RNase-free EP管，以RNase-free water稀释混勾 后，加入15此鱼精蛋白（120yg)，混合孵育lOmin，将1.2此小牛胸腺DNA( 1.60yg)加入9此 VEGF-siRNA(15.96yg)水溶液中，混合孵育lOmin，将CRS复合液与VEGF-siRNA复合液混合， 轻柔吹打10次，室温静置20min，即得。9. 一种载体CRS，主要由卵磷脂，胆固醇，和1-甲基-0-咔啉-3-精氨酸-甘氨酸-天冬氨 酸-丝氨酸组成。10. 权利要求3所述的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
【文档编号】A61K48/00GK106046119SQ201610362687
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月26日
【发明人】崔纯莹, 王玉记, 赵雯
【申请人】首都医科大学