一种鸡传染性法氏囊病病毒vp2蛋白及其制备方法与应用及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白及其制备方法与应用，具体地，编码该VP2蛋白的核苷酸序列含有如SEQ ID No.1所示序列。制备该VP2蛋白方法包括以下步骤：1)化学合成SEQ ID No.1序列，2)构建表达载体和3)转染sf9细胞。该VP2蛋白可用于制备鸡传染性法氏囊病的疫苗。该SEQ ID No.1是根据昆虫细胞偏爱密码子对鸡IBDV VP2基因进行密码子优化而得，比一般的从IBDV病毒扩增的VP2基因，更适应在昆虫细胞中表达，更能提高蛋白表达量。
【专利说明】
一种鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白及其制备方法与应用及 试剂盒
技术领域
[0001 ]本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白及其制 备方法与应用及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 鸡传染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease，IBD)是由传染性法氏囊病毒 (Infectious Bursal Disease Virus，IBDV)侵害引起的一种急性、高度接触性传染病，主 要侵害雏鸡和青年鸡的法氏囊。该病不仅造成鸡只死亡还导致免疫抑制，是目前危害世界 养禽业的主要传染病之一。传染性法氏囊病病毒属于双股双节段dsRNA病毒，其基因组是由 A、B两个双链RNA片段组成。A片段长度为3200bp，B片段长度约为2800bP<3A片段具有两个开 放阅读框，大阅读框0RF1编码VP2、VP4、VP3三个蛋白质，小开放阅读框0RF2编码VP5蛋白。B 片段只有一个0RF，编码VP1蛋白。VP2蛋白是病毒的主要结构蛋白，与病毒的抗原性、免疫原 性、毒力、细胞嗜性等有关，另外，VP2蛋白也是IBDV的保护性抗原成分，与病毒中和性抗体 的诱导和识别等生物学功能有关，其位于病毒粒子的外表面，占总结构蛋白量的51%，与另 一主要结构蛋白VP3-起构成核衣壳的骨架。研究已经证实VP2主要暴露在核衣壳的外面， 携带病毒主要的中和性抗原表位。
[0003] VP2基因在外源系统中表达的方法很多，比如原核表达系统，该系统表达量较高， 但产物往往为包涵体，不具备生物活性;酵母表达系统对表达产物的糖基化修饰不完全;而 哺乳动物细胞表达系统虽然能够对表达产物进行糖基化等修饰，产生活性蛋白，但其表达 水平较低、不易于放大，而且细胞生长条件要求较高。
【发明内容】
[0004] 为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种鸡传染性法氏囊病毒VP2 蛋白。
[0005] 为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
[0006] 一种鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白，编码该VP2蛋白的核苷酸序列含有如SEQ ID No. 1所示序列。
[0007] 作为优选，该VP2蛋白由含有SEQ ID No. 1所示序列的表达载体转染sf9细胞表达 而得。
[0008] 本发明的目的之二在于提供制上述的鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的方法，包 括以下步骤：
[0009] 1)合成:化学合成SEQ ID No. 1序列，与载体质粒连接，得到重组质粒；
[0010] 2)进行PCR扩增，构建包含SEQ ID No.l序列的表达载体；
[0011] 3)转染:将表达载体转染sf9细胞，得到含有鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的重 组病毒。
[0012]作为优选，步骤1)中，所述重组质粒是通过将SEQ IDNo.l序列连接到PUC57载体 上，得到PUC57-VP2重组质粒。
[0013]作为优选，步骤2)中，利用pTriEx-4质粒构建包含SEQ IDNo.l序列的表达载体。 [0014] 作为优选，步骤2)中，使用如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的引物对重组质粒 进行PCR扩增，
[0015] SEQ ID No·2:5 '-TTTGAGCTCATGACCAACCTCCAAGACCAG-3 '；
[0016] SEQ ID No.3:5'-CCCAAGCTTACGGAGGGCACGAATGATGTC-3。
[0017] 作为优选，步骤2)中，其PCR扩增体系如下:rTaq酶2yL，重组质粒lyL，SEQ ID Νο·2 0.5yL,SEQ ID No.3 0.5yL；
[0018] 其PCR扩增程序如下:95°C预变性5min，l个循环;95°C变性30s，56°C退火30s，72°C 延伸90s，35个循环;72°C延伸10min，1个循环。
[0019]作为优选，采用pTriEx-4质粒构建表达载体。
[0020] 本发明的目的之三在于提供上述鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白在制备鸡传染性 法氏囊病的疫苗中的应用。
[0021] 本发明的目的之四在于提供一种用于检测鸡传染性法氏囊病病毒的试剂盒，所述 试剂盒内包括上述鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白。
[0022] 相比现有技术，本发明的有益效果在于：
[0023] 本发明提供一种鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白，编码该蛋白的核苷酸序列含有 如SEQ ID No.l所示序列。该SEQ ID No.l是根据昆虫细胞偏爱密码子对鸡IBDV VP2基因进 行密码子优化而得，比一般从IBDV病毒扩增的VP2基因，更适应在昆虫细胞中表达，更能提 尚蛋白表达量。
[0024]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
【附图说明】
[0025] 图1为pUC57-VP2扩增产物;其中，Μ泳道为Mark，l泳道为目的基因 VP2;
[0026]图2为重组质粒pTriEx-4-VP2的双酶切鉴定结果图，其中Μ泳道为mark，l泳道为重 组质粒pTriEx-4用SacI和Hindlll双酶切鉴定结果;2泳道为重组质粒pTriEx-4-VP2用SacI 和Hindlll双酶切鉴定结果；
[0027] 图3为SDS-PAGE检测重组杆状病毒Bac-VP2感染Sf9细胞产物，其中Μ泳道为mark， 1-3泳道为重组杆状病毒Bac-VP2感染Sf9的细胞产物;4泳道为为未感染病毒Sf 9的细胞产 物;5泳道为重组杆状病毒Bac-VP2感染Sf9细胞裂解产物Ni-NTA纯化结果；
[0028] 图4为Western blot检测重组杆状病毒Bac_VP2感染Sf9细胞产物；其中，Μ泳道为 mark; 1-2泳道:重组杆状病毒Bac-VP2感染Sf9细胞产物的Western blot分析结果；3泳道： 未感染病毒Sf9细胞产物的Western blot分析结果；
[0029] 图5为IFA检测重组杆状病毒Bac_VP2感染Sf9细胞产物。左图：重组杆状病毒Bac-VP2感染Sf9细胞的IFA分析结果;右图：未感染病毒Sf9细胞的IFA分析结果。
【具体实施方式】
[0030]本发明提供一种鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白，其特征在于，该VP2蛋白的核苷 酸序列含有如SEQ ID No. 1所示序列。
[0031] 本发明提供一种鸡传染性法氏囊病毒蛋白VP2的制备方法，该方法包括以下步骤：
[0032] 1)优化:根据昆虫细胞偏爱密码子对鸡IBDV VP2基因进行密码子优化，得到优化 后的鸡IBDV VP2基因序列；
[0033] 2)合成：化学合成优化后的鸡IBDV VP2基因序列，与载体质粒连接，得到重组质 粒；
[0034] 3)构建包含SEQ ID No. 1序列的表达载体；
[0035] 4)转染:将表达载体转染sf9细胞，得到含有鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的重 组病毒。
[0036]本发明应用VP2基因序列在昆虫细胞中进行过优化，比一般从IBDV病毒扩增的VP2 基因，更适应在昆虫细胞中表达，更能提尚蛋白表达量；
[0037]本发明采用化学合成IBDV VP2基因的方法，与传统组织提取DNA或RNA获得目的基 因的方法相比，基因合成无需模板，因而不受基因来源限制，更经济、简便、省时省力；
[0038]本发明以昆虫细胞作为生物反应器制备IBDV VP2,与细菌、酵母、真核细胞表达系 统相比，因 sf9细胞生长条件简单，可无⑶2、无血清、27°C生长，因此具有节省成本、产量高、 可大规模制备的优点。
[0039] 本发明应用的昆虫表达系统使用多角体启动子，能够高效表达蛋白，还有完善的 翻译后修饰，而且昆虫细胞可以无血清培养，能够大规模用于蛋白的生产。
[0040] 以下【具体实施方式】中，如未特殊说明，所使用的试剂或仪器均可通过市售的途径 获得。
[0041 ] 实施例1:优化鸡IBDV VP2基因序列、合成并克隆
[0042] 参考GenBank上公布的鸡IBDV VP2基因序列（登录号AF508177)，根据昆虫细胞偏 爱密码子对鸡IBDV VP2基因进行密码子优化，得到优化后的鸡IBDV VP2基因序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0043]化学合成优化后的鸡IBDV VP2基因序列，并将其克隆到pUC57载体上，得到的载体 命名为 PUC57-VP2。
[0044] 实施例2:构建杆状病毒表达载体pTriEx-4-VP2
[0045] 实施例2A)对重组质粒进行PCR扩增
[0046]设计了一对扩增优化后的鸡IBDV VP2基因全长的引物，并在上游引物5 '端加入保 护性碱基及SacI酶切位点，在下游引物5'端加入保护性碱基及Hindm酶切位点，引物序列 为：
[0047] SEQ ID No.2:5 '-TTTGAGCTCATGACCAACCTCCAAGACCAG-3 '；
[0048] SEQ ID No.3:5 '-CCCAAGCTTACGGAGGGCACGAATGATGTC-3；
[0049] 下划线部分分别是Sac I和Hind ΙΠ 酶切位点。
[0050] 其PCR反应体系：rTaq酶8yL，pUC57-VP21yL，上游引物0.5yL，下游引物0.5yL; ddH20 补足至 20yL;
[0051 ] 其中，rTaq酶购自TAKARA公司，pUC57-VP2的浓度为lOOng/yL，上游引物为SEQ ID No.2，浓度为20nM;下游引物为SEQIDNo.3，浓度为20nM。
[0052] 其PCR反应程序为:95 °C预变性5min，1个循环;95 °C变性30s，56 °C退火30s，72 °C延 伸90s，35个循环;72°C延伸lOmin，1个循环。
[0053] PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，得到一个1400bp左右的片段，结果见图 1，其中，Μ泳道为Mark，1泳道为目的基因 VP2。切胶回收后进行纯化。
[0054]实施例2B)将目的基因 VP2与载体质粒pTriEx-4进行连接
[0055] 将实施例2A)获得的目的基因 VP2与载体质粒pTriEx-4分别用SacI和Hindlll在37 °C恒温箱中双酶切2h后进行连接。
[0056]其双酶切操作的具体参数如下：
[0057] 双酶切目的基因 VP2体系：目的基因 VP2 16yL、10XM buffer 2yL，SacI限制性内 切酶lyL，Hindm限制性内切酶lyL;
[0058] 双酶切载体质粒pTriEx-4体系:载体质粒pTriEx-4 lyg，10 XM buff er2yL，SacI 限制性内切酶lyL，Hindm限制性内切酶lyL，ddH20补足至20yL。
[0059] 上述双酶切目的基因 VP2的产物、双酶切载体质粒pTriEx-4的产物分别经1%琼脂 糖凝胶电泳检测，切胶后回收纯化用T4连接酶在16°C进行连接反应，过夜，得到重组质粒 pTriEx-4-VP2〇
[0060] 上述连接反应体系：双酶切载体质粒pTriEx-4的纯化产物（30ngAiL) 2yL，双酶切 目的基因 VP2的纯化产物（50ngAiL)6yL，10XDNA Ligase Buffer lyL，T4DNA Ligase lyL〇 [0061 ] 实施例2C)重组质粒pTriEx-4-VP2转化感受态细胞
[0062] 将实施例2B)得到的重组质粒pTriEx-4_VP2与大肠杆菌DH5a感受态细胞混匀后冰 浴30min，42°C水浴热击90s后立即转移至冰上放置lOmin，加入LB新鲜培养基，37°C恒温摇 床培养lh后，离心弃去部分上清，以剩余部分培养基重悬菌泥后均勾涂布于含Amp ici 11 in 的LB平板上，37 °C恒温培养箱倒置过夜培养。挑取单菌落，于含Ampi ci 11 in (100ng/mL)的LB 液体培养基中培养8h，得到菌液。
[0063] 实施例2D)PCR鉴定阳性菌
[0064]取实施例2C)得到的菌液，进行PCR鉴定，挑选出阳性菌。
[0065] PCR鉴定的反应体系:rTaq酶8yL，菌液lyL，上游引物0.5yL，下游引物0.5yL，ddH20 补足至20μL。上游引物为SEQIDNo.2，浓度为20nM ;下游引物为SEQIDNo.3，浓度为20nM。
[0066] PCR鉴定的反应程序:95°C预变性5min，l个循环;95°C变性30s，56°C退火30s，72°C 延伸90s，35个循环;72°C延伸10min，1个循环。
[0067] PCR鉴定后的产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增得到1400bp左右基因片段即为 阳性菌，试剂盒提取阳性菌的质粒。
[0068] 实施例2E)双酶切鉴定
[0069]将实施例2D)得到的阳性菌的质粒，经SacI和Hindm双酶切鉴定，其结果如图2所 示，得到大小分别约是5.2kb和1.4kb的基因片段，鉴定正确的重组质粒命名为pTriEx-4-VP2,并送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。实施例3:转染sf 9昆虫细胞
[0070] 将无血清培养基(BacVector Insect Cell Medium)培养的Sf9细胞铺入六孔板， 铺板浓度为1 X 106cells/孔。
[0071] 转染体系:无血清培养基lmL;昆虫转染试剂5yL，杆状病毒DNA 5yL;pTriEx-4-VP2 5yL;其中，昆虫转染试剂为品牌为GeneJuice?的转染试剂；杆状病毒的品牌及型号为 BacMagic?-3;pTriEx-4-VP2 重组质粒的浓度为 500ng/yL。
[0072]弃去六孔板中的无血清培养基，将转染体系全部加入到板孔中，28°C继续培养5d， 收集培养基，即为P1代重组杆状病毒。
[0073] 将P1代重组病毒按照Μ0Ι = 0.05-0.1接种贴壁培养的Sf 9细胞传代两次，获得P3代 重组杆状病毒，命名为Bac-VP2,该病毒中含有得到含有鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的 重组病毒。
[0074] 实施例4:重组杆状病毒Bac_VP2的鉴定
[0075]实施例4A)SDS-PAGE和Western blot联合检测
[0076] 将实施例3)得到的Bac-VP2按照Μ0Ι = 1-5接种悬浮培养的Sf9细胞，28°C继续培养 72h后，离心收集细胞，加入RIPA裂解液进行裂解，获得蛋白液。取少量上述蛋白加入5 X SDS LoadingBuffer，以10%分离胶和4%浓缩胶进行SDS-PAGE电泳。SDS-PAGE结果如3所示，细 胞感染Bac-VP2后，其细胞裂解蛋白在58kDa附近有一条带。
[0077]然后将上述SDS-PAGE电泳条带转印到NC膜上以5%脱脂奶粉封闭，先后以一抗稀 释液(鸡IBDV阳性血清)和二抗稀释液(HRP标记兔抗鸡IgG)孵育，DAB底物显色后观察特异 性条带以确定鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白的表达。Western blot结果如图4所示，该条带 与鸡IBD阳性血清发生特异性反应。
[0078]实施例4B)间接免疫荧光检测
[0079] 将实施例3)得到的Bac-VP2按照Μ0Ι = 1-5接种贴壁培养的Sf9细胞，28°C继续培养 72h后，弃掉培养基，以4 %多聚甲醛室温固定30min; TOST洗涤三次并拍干后以1000倍稀释 的鸡IBD阳性血清为一抗4°C孵育过夜；以PBST洗涤三次并拍干后以2000倍稀释的FITC标记 的兔抗鸡IgG孵育，37 °C反应2h;再次以PBST洗涤三次，置于荧光显微镜下观察，结果如图5 所示，可以看到重组杆状病毒Bac-VP2感染后的细胞呈现特异性的荧光，而对比例则无荧光 反应。
[0080] 实施例5:鸡传染性法氏囊病毒IBDV VP2蛋白的纯化
[0081] 使用 Amic()n?Pro Affinity Concerntration Kit Ni-NTA进行鸡传染性法氏 囊病毒IBDV VP2蛋白的纯化。其具体操作步骤为:取200yL Ni-NTA加入到平衡柱中，1000X g离心lmin;以2.5倍体积的Binding buffer清洗平衡住，1000 X g离心lmin;取5mL实施例 4A)的蛋白液加入到平衡柱中，室温低速摇床孵育60min，1000 X g离心lmin ;将Amicon Ultra-〇.5微型管介导平衡柱下方，再在平衡柱中加入500yL Elution buffer，4000Xg离 心15min;再将Ami con Ultra-0.5微型管倒置放入2mL收集管，1000 X g离心2min，获得纯化 蛋白HiS-VP2，以SDS-PAGE进行鉴定，结果如图3所示。
[0082] 实施例6:间接ELISA方法
[0083] 将实施例5获得的纯化蛋白His-VP2用包被液稀释至5mg/L，取lOOyL/孔包被酶标 板，4 °C过夜；将阳性血清和阴性血清分别稀释100倍，37 °C孵育2h; PBST洗涤三次后加入稀 释的兔抗鸡IgG孵育，37°C反应lh;再以TOST洗涤三次，TMB显色15min;加入2M H2S〇4终止反 应，于450nm处读取吸光值，结果如表1所示。
[0084] 表1间接ELISA鉴定结果
[0087] 临界值=0 · 168+0 · 0890 X 3 = 0 · 435，P/N>2 · 1;
[0088] 即以此种用于检测鸡传染性法氏囊病病毒的ELISA检测试剂盒成立。
[0089] 在进行ELISA检测时，100倍稀释的待检血清0D45Q>0.435，即可视为阳性。
[0090]上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围， 本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所 要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白，其特征在于，编码该VP2蛋白的核苷酸序列含 有如SEQ ID No.l所示序列。2. 如权利要求1所述的鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白，其特征在于，该VP2蛋白由含有 SEQ ID No.l所示序列的表达载体转染sf9细胞表达而得。3. 制备如权利要求1或2所述的鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的方法，其特征在于，包 括以下步骤： 1) 合成:化学合成SEQ ID No.l序列，与载体质粒连接，得到重组质粒； 2) 进行PCR扩增，构建包含SEQ ID No.l序列的表达载体； 3) 转染:将表达载体转染sf9细胞，得到含有鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的重组病 毒。4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述重组质粒是通过将SEQ IDNo. 1序列连接到pUC57载体上，得到pUC57-VP2重组质粒。5. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)中，利用pTriEx-4质粒构建包含SEQ IDNo. 1序列的表达载体。6. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)中，使用如SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所示的引物对重组质粒进行PCR扩增， SEQ ID No.2:5，-TTTGAGCTCATGACCAACCTCCAAGACCAG-3,； SEQ ID No.3:5'-CCCAAGCTTACGGAGGGCACGAATGATGTC-3。7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)中，其PCR扩增体系如下:rTaq酶2yL， 重组质粒lyL，SEQ ID Νο·2 0.5yL，SEQ ID Νο·3 0.5yL; 其PCR扩增程序如下:95 °C预变性5min，1个循环;95 °C变性30s，56 °C退火30s，72 °C延伸 90s，35个循环；72°C延伸lOmin，1个循环。8. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，采用pTriEx-4质粒构建表达载体。9. 如权利要求1或2所述的鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白在制备鸡传染性法氏囊病的 疫苗中的应用。10. -种用于检测鸡传染性法氏囊病病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内包括如 权利要求1或2所述的鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白。
【文档编号】A61K39/12GK106046123SQ201610375787
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月30日
【发明人】任广彩, 刘传高, 黄妙容, 陈瑞爱
【申请人】广东温氏大华农生物科技有限公司, 肇庆大华农生物药品有限公司