一种全人源抗CD45的全分子IgG抗体及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种全人源抗CD45的全分子IgG抗体，包含轻链可变区和重链可变区，所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体；且所述的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。本发明还公开了上述全分子IgG抗体的DNA分子、表达载体、宿主细胞和应用。
【专利说明】
一种全人源抗CD45的全分子I gG抗体及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物免疫技术领域，尤其涉及一种全人源抗⑶45的全分子IgG抗体，还 涉及该全分子IgG抗体的DNA分子、表达载体、宿主细胞和应用。
【背景技术】
[0002] 器官、细胞和组织移植排斥以及各种自身免疫性疾病目前认为是主要是由T细胞 介导的免疫反应引起的。T细胞介导的免疫反应最初是由辅助T细胞识别特定的抗原开始 的。这些辅助T细胞可能是以前遗留的记忆细胞免疫反应或幼稚细胞释放的胸腺和可以表 达任何一个极其广泛的抗原受体。当辅助T细胞识别抗原呈递细胞(APC)或巨噬细胞的表面 的抗原-MHC复合物后，辅助T细胞被刺激后释放IL-2促进辅助T细胞增殖。增殖导致大量的T 细胞识别一个特定的抗原。T细胞激活也可能刺激B细胞活化和非特异性巨噬细胞反应。
[0003] -些细胞增殖分化成细胞毒性T细胞，从而破坏了抗原识别能力。抗原消失后，成 熟的细胞可以保持记忆的辅助T细胞和记忆细胞毒性T细胞，在体内循环和识别再次出现的 抗原。如果抗原引起这种反应不是外源性抗原，而是内源性抗原，就会导致自身免疫性疾 病，如果发生在器官移植中，就表现为移植排斥。因此，研究调节T细胞介导的免疫反应是急 需的。
[0004] CD45抗原是一种稳定、高表达于所有白细胞和他们的前体细胞以及超过70%的骨 髓有核细胞表面上的单链细胞膜糖蛋白，CD45又被称为GP180，T200或白细胞共同抗原 (LCA)，是一种分子量约为200kDa的酪氨酸磷酸酶，CD45能广泛的表达于几乎所有的白细 胞，包括骨髓的髓系前体细胞和淋巴结中的成熟淋巴细胞以及90 %的AML细胞，这些细胞和 组织为病人治疗的缓解或复发提供了大量抗体结合位点。由于CD45作为白细胞的标记物能 出现在正常和恶性细胞，所以在病人体内应用抗CD45抗体可以通过代谢分布到骨髓、脾脏 和淋巴结中与靶抗原结合，用于治疗急性白血病或是器官移植排斥反应或是一些自身免疫 性疾病。
【发明内容】
[0005] 基于【背景技术】存在的技术问题，基于【背景技术】存在的技术问题，本发明的目的在 于提供一种全人源抗⑶45的全分子IgG抗体。
[0006] 本发明的目的又在于提供一种编码上述全人源抗⑶45的全分子IgG抗体的DNA分 子。
[0007] 本发明的目的又在于提供一种含有能编码上述全人源抗⑶45的全分子IgG抗体的 DNA分子表达载体。
[0008] 本发明的目的又在于提供一种被上述的表达载体所转化的宿主细胞。
[0009] 本发明的目的还在于提供上述全人源抗⑶45的全分子IgG抗体的应用。
[0010] 为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究，包括全人源Fab噬菌体抗体库 的筛选，抗CD45特异性抗体的纯化，抗CD45全分子抗体IgG的制备、表达及纯化，抗CD45全分 子抗体IgG的特性分析，最终获得了 一种全人源抗CD45的全分子IgG抗体，包含轻链可变区 和重链可变区，
[0011] (1)所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示，或者是该序列经一个或 多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体；
[0012] 且(2)所述的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示，或者是该序列经一个 或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。
[0013] 优选地，所述的轻链可变区的三个抗原互补区⑶R的氨基酸序列为SEQ ID N0.5， SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；所述的重链可变区的三个抗原互补区⑶R的氨基酸序列 SSEQIDN0.8，SEQIDN0.^PSEQIDN0.1(^；f*。
[0014] 本发明还提出的一种全人源抗⑶45的全分子IgG抗体，包含轻链恒定区和重链恒 定区，所述的轻链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID N0.11所示，所述的重链恒定区的氨基酸 序列为SEQ ID N0.12所示。
[0015] 本发明还提出的一种DNA分子，其编码上述全分子IgG抗体的重链或/和轻链。
[0016] 优选地，其编码轻链可变区的核酸序列为SEQID NO. 1所示，编码重链可变区的核 酸序列为SEQ ID N0.2所示。
[0017] 本发明还提出的一种表达载体，包含有上述的DNA分子以及与该DNA分子操作性相 连的表达调控序列。
[0018] 本发明还提出的一种宿主细胞，被上述的表达载体转化。
[00?9]优选地，该宿主细胞可以是被上述的表达载体转化的293Freesty le细胞。
[0020] 本发明还提出的上述全分子IgG抗体在制备与CD45相关的器官移植及自身免疫性 疾病的诊断试剂或治疗药物中的用途。
[0021] 目前国内尚未报道专门针对CD45的抗体，本发明制备的是全人源IgG抗体，而且实 验证明有很好的特异性及能够抑制CD8+及CD4+细胞的增殖。
[0022]本发明通过噬菌体抗体库技术筛选到了对CD45具有高度亲和力的人源Fab抗体， 并获取了赋予所述抗体优异特性的重链和轻链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列，并将所 述抗体的重链和轻链可变区与含有抗体恒定区的表达载体连接，最终获得了具有特异的抗 原结合性和在器官移植动物水平具有较好的抗排异反应。
[0023]本发明提供了一种具有高特异性、良好亲和力的抗CD45的全分子全人源单克隆抗 体。由于CD45作为白细胞的标记物能出现在正常和恶性细胞，所以在病人体内应用抗CD45 抗体可以通过代谢分布到骨髓、脾脏和淋巴结中与靶抗原结合，用于治疗急性白血病或是 器官移植排斥反应或是一些自身免疫性疾病。本发明以CD45为靶分子，在噬菌体抗体库技 术的基础上制备出全分子人源抗体。对制备的人源抗CD45抗体做功能鉴定，显示该抗体能 够与CD45特异性结合，而且实验证明有很好的特异性及能够抑制CD8+及CD4+细胞的增殖。
【附图说明】
[0024]图1为本发明实施例1所得纯化全人源抗⑶45的全分子I gG抗体的SDS-PAGE检测结 果;其中1为蛋白分子量标准品，2为抗CD45抗体，3为抗TLR4抗体，4为细胞培养上清，5为流 穿；可见使用Pro. A柱纯化抗⑶45抗体纯度高。
[0025]图2为本发明实施例1所得抗CD45抗体的酶联免疫吸附试验检测结果，可见抗CD45 抗体与CD45蛋白的结合能力较强。
[0026]图3为本发明实施例1所得抗CD45抗体与CD45的免疫印迹鉴定结果；其中1为抗 ⑶45抗体与⑶45蛋白表达菌;2为抗⑶45抗体与BL21空菌;可见抗体与⑶45蛋白有特异性结 合能力。
[0027]图4为本发明实施例1所得抗⑶45抗体的亲和力检测结果，KD值为2.699X10-1QM。
[0028] 图5为T细胞与抗⑶45抗体、抗⑶3抗体孵育后的结果对比图。实验结果显示抗⑶45 抗体对CD8+及CD4+细胞的增殖有抑制作用。
【具体实施方式】
[0029] 下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
[0030] 实施例1全人源抗⑶45的全分子IgG抗体的制备
[0031] 1)用⑶45抗原在人源Fab噬菌体库中经过六轮"吸附-洗脱-扩增"的富集筛选，获 得抗⑶45的Fab抗体，然后通过PCR扩增测序获得Fab抗体的可变区序列。
[0032] 2)根据已获得的抗体的重轻链可变区序列，设计引物。
[0033] 3)扩增抗⑶45抗体重链、轻链。
[0034] 以上述制备的人源Fab模板，分别以上述涉及的重链和轻链的上下游引物扩增全 分子人源抗体重链、轻链基因。
[0035] (l)PCR
[0036] 反应体系如下：
[0038] 反应条件如下：
[0040] (2)2%琼脂糖凝胶电泳，紫外下观察目的条带，切胶回收。
[0041 ] (3)胶回收试剂盒纯化目的DNA片段，去离子水洗脱。
[0042] 4)双酶切IgG表达质粒
[0043] IgG表达质粒pFUSE-CHIg-hGl、pFUSE-CLIg-hk(购自 Invivogen公司）包含IgGl型 人源的重链和轻链(Lambda)恒定区碱基编码序列。
[0044] (1 )pFUSE-CHIg-hGl、pFUSE-CLIg-hk 模板载体的双酶切
[0045] 反应体系如下：
[0047]反应条件为:37 °C酶切过夜。
[0048] (2) 1 %琼脂糖凝胶电泳，紫外下切胶回收。
[0049] (3)胶回收试剂盒纯化目的DNA片段，去离子水洗脱。
[0050] 5)Infusion PCR重组表达质粒 [0051 ] 反应体系如下：
[0053] 反应条件为：5(TC孵育15min。
[0054] 取5yL反应液转化感受态细菌，铺于相应抗性的平板上，次日挑克隆送测序。将测 序结果正确的克隆保存菌种并扩大培养，提取质粒。
[0055] 6)抗CD45抗体的表达
[0056] (1)取50yg重组后的重链质粒于lmL的Opti-MEM培养基中，取50yg的轻链质粒于 lmL的Opti-MEM培养基中，取200yL的293Fectin于2.8mL的Opti-MEM培养基中，将上述三种 混合液室温静置5min;
[0057] (2)然后将两个质粒混合液混合均匀后，补加500yL的Opti-MEM培养基混合均匀后 直接加入转染试剂293Fectin的混合液，混合均匀后静置20min。期间处理293F细胞，将293F 细胞离心后用293F Expression Medium重悬，然后计数以及用台盼蓝计算细胞活力比，吸 取1 X 108个细胞于培养瓶中，用293FExpression Medium定容为94mL;
[0058] (3)20min结束后将6mL的DNA、293Fectin的复合物加入准备好的293F细胞中；
[0059] (4)将细胞放在摇床培养箱中培养，培养条件8%⑶2，120^?，37°(：，6天后收集细 胞上清。
[0060] 7)抗CD45抗体的纯化
[0061 ]将收集的细胞上清用0.22μπι的滤膜过滤，同时将平衡液和洗脱液过滤膜。用AKATA 纯化仪按照Protein Α纯化的标准步骤纯化，以lmL/min的速度上样，以1.5mL/min的速度洗 脱。
[0062] 结果成功表达并纯化抗⑶45抗体。将纯化抗⑶45抗体进行SDS-PAGE检测，其结果 如图1所示，由图1可知纯化的抗体纯度很高，且用Pro. A柱纯化效果较好。
[0063]实施例2抗⑶45抗体的功能活性鉴定 [0064] 1)酶联免疫法
[0065]用包被液(0.1M碳酸盐缓冲液，pH9.6 )CD45蛋白至2yg/mL包被ELISA96孔板，每孔 加入100yL，4 °C过夜;PBST (PBS含0.5 % TWeen20) 5 %脱脂牛奶-洗涤缓冲液封闭，37 °C孵育 2h; PBST洗涤5次后，每个孔中加入100yLPA21抗体(2yg/mL起始浓度，14个浓度梯度稀释)37 °C 2h;以1:4000稀释的羊抗人二抗lOOyL/孔加入到孔内，37 °C孵育lh;过氧化物酶底物显色 液100μL7孔，室温下10分钟后用2M硫酸中止反应，上机检测比色采用双波长450nm/690nm。 [0066]结果如图2示所示，由图2可知:抗CD45抗体能与CD45蛋白起抗原抗体反应。
[0067] 2)ffestern blot
[0068] 以不表达⑶45分子的空菌作为阴性对照，以转染⑶45表达质粒的细菌作为阳性对 照进行10% SDS-PAGE电泳并电转到硝酸纤维膜上，将此膜与2yg/mL PA21抗体室温孵育lh， 1:4000稀释HRP-羊抗人IgG(北京中杉公司）和ECL发光试剂盒(美国Pierce公司）曝光于凝 胶成像系统(Bio-Rad公司）。
[0069]结果如图3所示:抗⑶45抗体与表达的⑶45蛋白的泳道有特异性结合。
[0070] 3)亲和力检测
[0071 ] 根据⑶45的等电点以及按照BiacoreXIOOcontrol soft的protocol优化偶联条 件，斜率优化选择醋酸钠作为偶联稀释缓冲液。用此缓冲液稀释CD45样品稀释至25yg/mL后 偶联到CM5芯片上。预设偶联水平1500RU。然后用pH7.4的Running buffer稀释CD45样品，稀 释一系列浓度至0nM、5nM、10nM 2〇11]\1、4〇11]\1、8〇11]\1。设置进样时间为18〇8，解离时间1〇1^11，再 生缓冲液用50mMpH2·2Gly_HCl。按照BiacoreXIOOcontrol soft的protocol进行上机测试。 [0072] 亲和力检测结果如图4所示，KD值为2.699X10- 1QM。
[0073] 4)⑶45抗体抑制⑶8+及⑶4+细胞的增殖
[0074] 通过流式筛选的⑶8+及⑶4+的T细胞并鉴定⑶25及⑶69分子，将T细胞与抗⑶45抗 体、抗⑶3抗体(0KT3)共孵育3h后检测T细胞的表型。
[0075]实验结果显示抗⑶45抗体对⑶8+及⑶4+细胞的增殖有抑制作用。
[0076] 上述文中Μ为mol/L的含义。
[0077]以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此， 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其 发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种全人源抗⑶45的全分子IgG抗体，包含轻链可变区和重链可变区，其特征在于， (1)所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，或者是该序列经一个或多个 氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体； 且（2)所述的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或者是该序列经一个或多 个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。2. 根据权利要求1所述全分子IgG抗体，其特征在于，所述的轻链可变区的三个抗原互 补区CDR的氨基酸序列为SEQIDN0.5，SEQIDN0.6和SEQIDN0.7所示 ；所述的重链可变 区的三个抗原互补区CDR的氨基酸序列为SEQIDN0.8，SEQIDN0.9和SEQIDN0.10所示。3. -种全人源抗⑶45的全分子IgG抗体，包含轻链恒定区和重链恒定区，其特征在于， 所述的轻链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NO.11所示，所述的重链恒定区的氨基酸序列为 SEQ ID NO. 12所示。4. 一种DNA分子，其编码权利要求1-3任一项所述全分子IgG抗体的重链或/和轻链。5. 根据权利要求4所述的DNA分子，其特征在于，其编码轻链可变区的核酸序列为SEQID NO. 1所示，编码重链可变区的核酸序列为SEQ ID NO.2所示。6. -种表达载体，包含有权利要求4所述的DNA分子以及与该DNA分子操作性相连的表 达调控序列。7. -种宿主细胞，被权利要求6所述的表达载体转化。8. 权利要求1-3任一项所述全分子IgG抗体在制备与CD45相关的器官移植及自身免疫 性疾病的诊断试剂或治疗药物中的用途。
【文档编号】A61P35/02GK106046163SQ201610483095
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】冯振卿, 徐亚如, 许国贞, 刘振云, 唐奇, 朱进
【申请人】安徽未名细胞治疗有限公司