一种特异检测水杨酸(sa)的融合蛋白的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种特异检测水杨酸(SA)的融合蛋白，其中，该融合蛋白包括NPR1基因中的泛素?26s蛋白酶体降解元件区域DNA序列所编码的蛋白和荧光蛋白，其中，该融合蛋白能够特异地被SA诱导降解。所述的融合蛋白，其中，该融合蛋白为NPR1的泛素?26s蛋白酶体降解元件的基因和荧光蛋白基因所编码或所表达。利用该融合蛋白，可以检测植物体内的SA。
【专利说明】
一种特异检测水杨酸(SA)的融合蛋白
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域中一种用于反映活体植物内的水杨酸水平及其变化的 融合蛋白和表达该融合蛋白的载体。
【背景技术】
[0002] 水杨酸(salicylic acid,SA)是植物体内普遍存在的一种简单的小分子酸类化合 物，化学名称为"邻羟基苯甲酸"，是肉桂酸的衍生物。SA最早发现于柳树的叶和树皮中， 1838年Raffaele Piria将这种有效组分命名为水杨酸。鉴于SA由植物自身合成，含量较低， 于韧皮部运输，且在植物生热、开花、侧芽萌发、性别分化等生长发育过程中起着重要的调 节作用，被确认为一种植物激素。
[0003] SA在植物体内的存在形式主要有游离态和结合态两种形式，结合态SA是游离SA与 葡萄糖结合形成无活性的水杨酸-2-0-β-葡萄苷(SAG)，存在于细胞内部，能防止大量游离 SA对植物细胞可能产生的毒害作用。特定情况下，SAG能释放到细胞间隙，转化为游离SA，游 离SA进入细胞，诱导防卫反应的发生。
[0004]陆续的研究表明，SA不仅可以调节植物的某些生长发育过程，还是激活植物过敏 反应（hypersensitive response，HR)和系统获得性抗性（systemic acquired reSistanCe，SAR)的重要内源信号分子，与植物抗盐性、抗旱性、抗热性和重金属胁迫等有 相关。此外，SA在农业上常用于保鲜花卉、延缓果实成熟而提高好果率。SA与植物抗胁迫的 关系一直是研究的热点，目前已经明确SA可作为植物抗病反应所需的信号分子来激活植物 防御保护机制，在植物信号传导和抗逆反应中起着关键作用。
[0005] 目前，国内报道测定SA的方法有紫外分光光度法、离子色谱法、色谱-质谱连用法， 主要对于废水、食品、医药中SA的含量进行测定，鲜有对植物样品的提取测定。国外文献主 要采用高效液相色谱法(HPLC)对植物样品中的SA水平进行分析，测定受HPLC流动相、检测 器等诸多因素的影响，更重要的是无法对活体植物内的SA进行实时监测。
[0006] 实时监测活体植物中水杨酸的水平是深入研究其作用和抗病机理的必要前提。
【发明内容】
[0007] 为了解决上述的技术问题，本发明的目的是提供一种实时反映植物体内水杨酸水 平的方法及其专用检测植物体内SA的融合蛋白以及表达载体。
[0008] 一方面，本发明提供一种融合蛋白，该蛋白包括NPR1的泛素-26s蛋白酶体降解元 件的基因所编码的蛋白和荧光蛋白基因所编码的蛋白。或者该融合蛋白为NPR1的泛素-26s 蛋白酶体降解元件的基因和荧光蛋白基因所编码，所表达。该融合蛋白可以专一，特异地被 SA降解，相反，SA不会单独降解荧光蛋白基因所编码的蛋白或者NPR1的泛素-26s蛋白酶体 降解元件所编码的蛋白，即NPR1的泛素基因所编码的蛋白或者荧光蛋白基因所编码的蛋白 均不会受SA诱导降解。
[0009] 在一些优选的方式中，该融合蛋白是通过质粒载体转入到表达载体来表达的。优 选的，所述的质粒载体的结构从左到右顺次包括:T-DNA右边界元件序列-35S启动子元件序 列-第一酶切位点-目的基因序列-第二酶切位点-第一接头序列-荧光序列-第二接头序列-细胞核定位蛋白（NLS)序列-终止子序列-35S启动子序列-T-DNA左边界序列。
[0010] 另一方面，本发明一种质粒载体，其中，通过把该质粒载体接种到植物体中，实时 检测植物体中SA水平，其中，所述的质粒载体从右到左包括如下结构:T-DNA右边界元件序 列-35S启动子元件序列-第一酶切位点-目的基因序列-第二酶切位点-第一接头序列-荧光 序列-第二接头序列-细胞核定位蛋白（NLS)序列-终止子序列-35S启动子序列-T-DNA左边 界序列。
[0011] 再一方面，本发明提供的检测植物体内水杨酸水平的方法，将含有来源于番茄的 SA响应蛋白NPR1的泛素-26s蛋白酶体降解元件的基因片段构建到入的植物表达载体中，形 成可以表达SA诱导降解的Venus YFP融合蛋白的载体，重组载体转入表达载体中（例如农杆 菌）；将该农杆菌浸润植物;48小时候采用荧光共聚焦显微镜观察融合蛋白对SA的反应介导 融合蛋白表达，通过荧光共聚焦显微镜可以检测植物水杨酸的水平。所述的植物表达载体 从右到左包括如下结构:T-DNA右边界元件序列-35S启动子元件序列-第一酶切位点-目的 基因序列-第二酶切位点-第一接头序列-荧光序列-第二接头序列-细胞核定位蛋白（NLS) 序列-终止子序列-35S启动子序列-T-DNA左边界序列。
[0012] 在上述所有实施方式中的一些优选的方式中，所述的T-DNA左边界元件序列为Seq ID No:7所示。
[0013] 在上述所有实施方式中的一些优选的方式中，所述的T-DNA右边界元件序列为Seq ID No:8所示。
[0014] 在上述所有实施方式中的一些优选的方式中，所述的35S启动子元件序列为Seq ID No:9所示。
[0015] 在上述所有实施方式中的一些优选的方式中，所述的第一接头序列为Seq ID No: 10所示·
[0016] 在上述所有实施方式中的一些优选的方式中，荧光蛋白序列为Seq ID No: 11所 不。
[0017] 在上述所有实施方式中的一些优选的方式中，第二接头序列为Seq ID No :12所 不。
[0018] 在上述所有实施方式中的一些优选的方式中，细胞核定位蛋白（NLS)序列为Seq ID No: 13所示。
[0019] 在上述所有实施方式中的一些优选的方式中，Bar序列为Seq ID No: 14所示。
[0020] 在上述所有实施方式中的一些优选的方式中，终止子序列为Seq ID No: 15所示。
[0021] 在上述所有实施方式中的一些优选的方式中，所述的第一酶切位点为Age頂每切位 点;第二酶切位点为Spe頂每切位点。
[0022]在上述所有实施方式中的一些优选的方式中，NPR1的泛素-26s蛋白酶体降解元件 的基因为Seq ID No:5所示。所述NPR1的泛素-26s蛋白酶体降解元件的氨基酸序列Seq ID No: 6所示。
[0023]本发明提供制备检测植物体内水杨酸水平的表达载体的构建方法，该方法包括如 下步骤：
[0024] 1)、从番茄中获得NPR1降解元件的编码基因序列，以番茄cDNA为模板，以引物对IK 8冲1/1〇-1?1所述的引物对进行？0財广增，11^冲1/11^-1?1为569 10如：1，569 10如：2所 示;扩增的PCR产物纯化后经测序获得全序列，长度120bp(Seq ID N〇:5)。
[0025] 2)、步骤1中获得的NPR1泛素-26s蛋白酶体降解元件的编码基因为模板，以引物对 IKB-F2/IKB-R2扩增；引物对IKB-F2(带有Agel酶切位点NPR1泛素-26s蛋白酶体降解元件 5 ' -端扩增正向引物/IKB-F1 (带有Spel酶切位点NPR1泛素-26s蛋白酶体降解元件3 ' -端扩 增反向引物)为Seq ID No:3，Seq ID No:3所示；
[0026] 3)、采用Spel和Agel将步骤2中纯化的扩增目的片段进行酶切，并与经Spel和Agel 双酶切的pjp743载体进行连接，连接的系统和步骤如下:采用10yL体系反应，其中lOXLiga se Buffer lyL，SpeI和Agel双酶切线性化克隆载体pjp743 120ng，NPRl泛素-26s蛋白酶体 降解元件片段120ng，Ligase 0.4μ1，最后用ddH2〇调整体系至10yL，轻轻混勾各组分;置于 16°C反应30min;反应完成后立即将反应管置于冰水浴中，冷却5min;然后将连接产物转入 大肠杆菌，挑选具有全长插入的克隆，测序筛选出1个具有NPR1泛素-26s蛋白酶体降解元件 基因序列的克隆；提取包含NPR1泛素-26s蛋白酶体降解元件质粒的克隆；通过电击法将其 导入到农杆菌菌株GV3101，成可以表达SA诱导降解的Venus YFP融合蛋白的(GV3101)菌株。 [0027]有益效果
[0028]将含有NPR1降解元件的表达载体导入植物，可以通过在共聚焦显微镜下观察GFP 的表达量，从而检测植物体内水杨酸的水平。当植物体内无 SA积累，在细胞核可见强烈的绿 色荧光；当植物体内有SA积累，细胞核内的黄色荧光猝灭。与传统的紫外分光光度法、离子 色谱法、液相色谱法等方法相比，所述表达载体检测植物体内水杨酸水平的方法操作简单 便捷，重复性好，可有效用于水杨酸在植物抗病防御反应的研究分析，可以实时在活体植物 上进行检测，而不用传统的提取处理过程，可以更真实的反应植物本身体内的SA的实时动 ??τ 〇
【附图说明】
[0029] 图1含NPR1泛素-26s蛋白酶体降解元件的表达载体的构建示意图；其中pjp748为 含有正确的NPR1的泛素-26s蛋白酶体降解元件的载体结构，pjp749为含有突变的NPR1的泛 素-26s蛋白酶体降解元件的载体结构示意图。
[0030] 图2含NPR1泛素-26s蛋白酶体降解元件的融合蛋白的表达后，本氏烟叶片内荧光 随着SA浓度不同的变化结果图（上方标注为共聚焦显微镜通道，右侧为SA浓度）。
[0031] 图3含有突变的NPR1泛素-26s蛋白酶体降解元件的融合蛋白表后，本氏烟叶片内 荧光不随SA变化的部分结果图（上方标注为共聚焦显微镜通道，右侧为SA浓度）。
【具体实施方式】
[0032] 本发明所提供的实施例均按照常规实验条件，其中所采用的引物序列如表1。
[0033]表1NPR1降解元件的编码基因序列扩增及载体构建引物
[0035]对于4中引物序列的说明：
[0036] Seq ID NO. 1信息:NPR1泛素-26s蛋白酶体降解元件5'-端扩增正向引物；
[0037] Seq ID N0.2信息:NPR1泛素-26s蛋白酶体降解元件3'-端扩增反向引物；
[0038] Seq ID N0.3信息：带有Agel酶切位点NPR1泛素-26s蛋白酶体降解元件5'-端扩增 正向引物；
[0039] Seq ID N0.4信息：带有Spel酶切位点NPR1泛素 -26s蛋白酶体降解元件3'-端扩增 反向引物；
[0040] Seq ID N0.16信息：带有Agel酶切位点突变的NPR1泛素-26s蛋白酶体降解元件 5'_端扩增正向引物。
[0041 ] 实施例1:NPR1泛素-26s蛋白酶体降解元件的克隆和测定
[0042] 以引物对IKB_Fl(Seq ID No:l)/IKB_Rl(Seq ID No:2)和扩增番茄NPR1 基因泛 素-26s降解元件序列，PCR扩增体系为：9yL DEPC水、25yL 2XPCR Buffer for K0D FX Neo、10yL2mM dNTPs、上下游引物（（10μΜ each)各 1.5yL、2yL cDNA模板、lyL K0D FX Neo聚 合酶。总反应体系为50yL。各片段的反应条件为:94°C2min;94°C15s，60°C30s，68°C45s，35 个循环;68°C10min。扩增的PCR产物纯化后经测序获得全序列，长度120bp(Seq ID No:5)。
[0043] 实施例2:NPR1泛素 -26s蛋白酶体降解元件YFP融合蛋白及其突变载体的构建和测 M.
[0044] 根据实施例1获得的全序列，设计引物对IKB-F2/IKB-R2。以实施例1中DNA为模板， 以引物对IKB-F2/IKB-R2扩增。采用Spel和Agel将纯化的扩增目的片段酶切，并与经Spel和 Agel双酶切的pjp743载体进行连接，采用10yL体系反应，其中lOXLigase Buffer lyL， Spel和Agel双酶切线性化克隆载体pjp743 120ng，NPRl泛素-26s蛋白酶体降解元件片段 120ng，Ligase 0.4μ1，最后用ddH2〇调整体系至10yL，轻轻混勾各组分。置于16°C反应 30min。反应完成后立即将反应管置于冰水浴中，冷却5min，最终获得转化质粒载体，结构如 图1所示的载体主要结构(组成载体的主要结构单元的序列见附图和基因序列表）。然后将 连接产物转入大肠杆菌Machl (购自全式金公司），挑选具有全长插入的克隆，测序筛选出1 个具有正确NPR1泛素-26s蛋白酶体降解元件基因序列的克隆。提取包含NPR1泛素-26s蛋白 酶体降解元件质粒，将该策略构建的载体命名为pjp748(图1)。通过电击法将其导入到农杆 菌菌株GV3101，形成可以表达SA诱导降解的Venus YFP融合蛋白的(GV3101)菌株。该NPR1泛 素-26s蛋白酶体降解元件的氨基酸序列为SEQ，NO: 6所示。
[0045] 采取以上同样方法，设计NPR1泛素-26s蛋白酶体降解元件突变引物mIKB-F2。以实 SEQ，NO: 17所示的DNA为模板(突变体DNA)，以引物对mIKB-F2/IKB-R2扩增(表1)。采用SpeI 和Agel将纯化的扩增目的片段酶切，并与经Spel和Agel双酶切的pjp743载体进行连接，采 用l〇yL体系反应，其中lOXLigase Buffer lyL，SpeI和Agel双酶切线性化克隆载体 pjp743120ng，NPRl泛素-26s蛋白酶体降解元件突变片段120ng(SEQ，N0:17所示），Ligase 〇.4μ1，最后用ddH2〇调整体系至10yL，轻轻混勾各组分。置于16°C反应30min。反应完成后立 即将反应管置于冰水浴中，冷却5min，最终获得转化质粒载体，结构如图1所示的载体主要 结构(组成载体的主要结构单元的序列见附图和基因序列表）。然后将连接产物转入大肠杆 菌Machl (购自全式金公司），挑选具有全长插入的克隆，测序筛选出1个突变NPR1泛素-26s 蛋白酶体降解元件基因序列的克隆，提取该克隆质粒，将该策略构建的载体命名为pjp749 (图1)。通过电击法将其导入到农杆菌菌株GV3101，形成可以表达突变的SA响应元件的 Venus YFP融合蛋白的（GV3101)菌株。该突变NPR1泛素-26s蛋白酶体降解元件的氨基酸序 列为SEQ，N0:18所示。
[0046] 实施例4:响应SA诱导降解的Venus YFP融合蛋白的瞬时表达
[0047]将实施例子3中构建的两种质粒载体pjp748及pjp749(其中pjp749载体的结构与 pjp748结构相同，其插入的NPR1基因泛素-26s降解元件序列为突变体，对SA的作用不响应， 图1)分别电击转化导入农杆菌菌株GV3101(商业购买获得），经菌落PCR验证后，挑取单斑接 种于含有Kan(50mg/L)和Rif(50mg/L)抗性的LB培养基(基本成分是：1%蛋白胨、0.5%酵母 提取物、1 %氯化钠）中28 °C过夜振荡培养;然后1:100转接到相同抗性的LB培养基中，生长 至对数生长期(A6Q()值约为0.6-0.8)，经6000r/min离心5min收集菌体；用含终浓度为10mM MgCl2,10mM MES(pH 5.6)，200uM乙酰丁香酮(Ace)的无菌水重悬浮，调整菌液浓度至A600 为1.0;在室温下放置3小时以上。
[0048] 用lml注射器(无针头)吸取农杆菌菌液待用。选取4~6片真叶的本氏烟草，在叶片 背面缓慢将菌液(含有pjp748及pjp749质粒的农杆菌菌株GV3101)分别渗透注射到组织间 隙中。每个处理注射6~8株，将浸润好的植株在暗处放置3~6小时后移到25 °C温室中培养 (16小时光照/8小时黑暗交替）。
[0049] 实施例5:融合蛋白对SA的反应
[0050] 每隔12小时对注射的实施例子4中的烟草叶片喷洒(2mL/g叶片)(ΗΗ20、10μΜ、100μ M、lmM的SA溶液，48小时候采用荧光共聚焦显微镜观察融合蛋白对SA的反应。观察表明， NPR1泛素-26s蛋白酶体降解元件YFP融合蛋白对10μΜ、100μΜ、ImM SA表现出敏感性，荧光强 度明显降低，并随SA浓度增加呈减弱趋势；而NPR1泛素-26s蛋白酶体降解元件突变体YFP融 合蛋白对(1(1!1 20、1(^1、10(^1、111^34均无明显反应（图2和图3)。这些结果表明构建的即1?1 泛素-26s蛋白酶体降解元件YFP融合蛋白具有响应SA生物学活性，并能实时反应植物内SA 水平，可以用来检测植物体内的SA实时变化水平。
[0051 ] 实施例6:响应SA诱导降解的Venus YFP融合蛋白的表达以及运用 [0052]质粒载体：
[0053]将pjp748:实施例子4中的载体；
[0054] pjp749:其中pjp749载体的结构与pjp748结构一样，除了插入的NPR1泛素-26s蛋 白酶体降解元件基因片段为突变体，对SA的作用不响应，图1;
[0055] pjp750:其中pjp750载体的结构与pjp748结构一样，但是只含有Seq ID N〇:5所示 的序列的基因，而焚光蛋白基因为突变体基因或者不含焚光蛋白基因；
[0056] pjp751:其中pjp750载体的结构与pjp748结构一样，但是只含有Seq ID N〇:ll(荧 光蛋白）所不的序列的基因，但是不含有Seq ID No:5所不的序列的基因。
[0057]分别将上述4中质粒载体电击转化导入农杆菌菌株GV3101(商业购买获得），经菌 落PCR验证后，挑取单斑接种于含有Kan (50mg/L)和Rif (50mg/L)抗性的LB培养基(基本成分 是：1 %蛋白胨、〇. 5 %酵母提取物、1 %氯化钠）中28 °C过夜振荡培养;然后1:100转接到相同 抗性的LB培养基中，生长至对数生长期(A6Q()值约为0.6-0.8)，经6000以1^11离心51^11收集菌 体；用含终浓度为10mM MgCl2，10mM MES(pH 5.6)，200uM乙酰丁香酮(AS)的无菌水重悬浮， 调整菌液浓度至A?为1.0;在室温下放置3小时以上。
[0058]用lml注射器(无针头）分别吸取以上含有4种自立载体的农杆菌菌液待用。选取4 ~6片真叶的本氏烟草，在叶片背面缓慢将菌液(含有？」？748、？」？749、？」？750、？」？751质粒 的农杆菌菌株GV3101)分别渗透注射到组织间隙中。每个处理注射6~8株，将浸润好的植株 在暗处放置3~6小时后移到25°C温室中培养（16小时光照/8小时黑暗交替）。每隔12小时对 注射的实施例子4中的烟草叶片喷洒100μΜ的SA溶液，48小时候采用荧光共聚焦显微镜观察 融合蛋白对SA的反应。具体结果如下表1:
[0059]表1，不同融合蛋白体外与SA接触的结果(48小时）
[0061]从以上实验结果可以看出，只有NPR1泛素-26s蛋白酶体降解元件-荧光蛋白形成 的融合蛋白，才特异的表现出响应SA的特异降解。同时，当只有NPR1泛素-26s蛋白酶体降解 元件时，不产生荧光，而只有荧光蛋白单独存在的情况下，荧光蛋白也并不降解。随着接触 反应的时间延长(3天以上），以上结果仍然不变。这似乎可以说明，只有当NPR1泛素-26s蛋 白酶体降解元件和荧光蛋白基因的融合蛋白，可以特异被SA所降解，其他则不能。进一步说 明，可以用本发明的融合蛋白来特异指示SA是否存在。
[0062]同时，我们用SA的类似物做同样的实验，或者类似的结果（【具体实施方式】和数据
【主权项】
1. 一种特异检测水杨酸（SA)的融合蛋白，其中，该融合蛋白包括NPR1基因的泛素-26s 蛋白酶体降解元件区域DNA序列所编码的蛋白和荧光蛋白基因所编码的蛋白，其中，该融合 蛋白能够特异被SA诱导降解，导致荧光强度减弱。2. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，该融合蛋白为NPR1的泛素-26s蛋白酶体降解 元件的基因和荧光蛋白基因所编码或所表达。3. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，该融合蛋白可以专一，特异地被SA诱导降解， 相反，当单独的NPR1的泛素-26s蛋白酶体降解元件的基因所编码的蛋白或者单独的荧光蛋 白基因所编码的蛋白均不会受到SA诱导降解而导致荧光强度减弱。4. 根据权利要求1所述的融合蛋白，其中，该融合蛋白是通过质粒载体转入到表达载体 来表达的，所述的质粒载体的结构从左到右顺次包括:T-DNA右边界元件序列-35S启动子元 件序列-第一酶切位点-NPR1泛素-26s蛋白酶体降解元件-第二酶切位点-第一接头序列-荧 光蛋白序列-第二接头序列-细胞核定位蛋白（NLS)序列-终止子序列-35S启动子序列-Τ'-DNA 左边界序列 ，其中所述的表达载体为农杆菌，该农杆菌是被接种到烟草中进行表达的。5. 根据权利要求1-4之一所述的融合蛋白，其中，所述的NPR1的泛素-26s蛋白酶体降解 兀件的基因为Seq ID No:5所不；焚光蛋白所编码的基因序列为Seq ID No:ll所不。
【文档编号】C07K19/00GK106046175SQ201610442983
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月16日
【发明人】赵晋平, 李赛赛, 燕飞, 程晔, 陈剑平
【申请人】浙江省农业科学院