一种关节润滑材料及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种关节润滑材料及其制备方法，该材料为共价交联型O?羧甲基壳聚糖水凝胶，其凝胶化时间为0.5?10min，含水量高于70％，保水率高于65％，由脱乙酰度＞25％的O?羧甲基壳聚糖与戊二醛进行凝胶化反应制得。本发明制备的共价交联型O?羧甲基壳聚糖水凝胶具有良好的生物相容性，可作为关节润滑剂，适用于关节局部注射，且能在一定时间内使关节保持一定的容量及弹性特征，促进软骨组织修复。
【专利说明】
一种关节润滑材料及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及医用生物材料技术领域，特别是涉及到一种用于关节润滑的〇-羧甲基 壳聚糖(0-CMCTS)水凝胶。
【背景技术】
[0002] 随着生活水平的提高，人类的平均寿命逐渐延长，人口老龄化成为当今很重要的 社会问题，预计到2050年左右，全国的老年人口将达到全国总人口的1/3，骨关节退行性病 变是中老年人常见的疾病，且65岁以上老年人的患病率达50%。另外，中青年人长期过度运 动导致关节软骨磨损也是临床常见疾病，且有持续上升趋势，严重影响生活质量。因此，开 发有效的人工关节润滑材料直接注射进软骨磨损的关节腔内以治疗此类关节疾病十分必 要。
[0003] 此外，目前治疗骨关节病所采用的人工全关节置换材料多为金属、陶瓷和超高分 子聚乙烯等硬质材料。这些假体材料的机械性能与天然关节相差甚远，且难以在人工关节 的表面形成润滑膜。为实现人工关节优异的摩擦学性能，用人工关节润滑材料对人工关节 进行润滑是降低摩擦磨损、提高使用寿命的重要措施。
[0004] 国内专利《一种可注射骨关节润滑材料及其制备方法》公开了一种可注射骨关节 润滑材料及其制备方法，该可注射骨关节润滑材料包括纳米晶体纤维素与透明质酸类物 质，所述透明质酸类物质为透明质酸或透明质酸的水溶性盐。由于透明质酸(钠）易被体内 透明质酸酶降解，因此需多次注射，既延长了疗程，又增加了治疗成本;另外，透明质酸体外 形成凝胶后的注射难度加大。
[0005] 国内专利《一种温度敏感的壳聚糖水凝胶及其制备方法》公开了一种温敏型可注 射壳聚糖(CTS)水凝胶，采用交联剂β-甘油磷酸钠离子交联CTS制备得到一种温敏型可注射 水凝胶，制备的水凝胶可作为药物载体及组织工程支架使用。但CTS仅溶于稀酸水溶液中， 而且这种水凝胶需要使用大量的离子交联剂，使得其生物相容性，特别是体内组织相容性 受到影响。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种共价交联型0-CMCTS水凝胶，该水凝胶具有较CTS水凝胶 更好的生物相容性、生物可降解性、生物吸附性等优异性，可作为关节润滑剂，适用于关节 局部注射，且能在一定时间内使关节保持一定的容量及弹性特征，促进软骨组织修复。
[0007] 本发明提供一种关节润滑材料，该材料包含共价交联型0-CMCTS水凝胶，其凝胶化 时间为0.5-1 Omin，含水量>70%，保水率>65 %。
[0008] 优选地，该共价交联型0-CMCTS水凝胶由戊二醛(GA)与0-CMCTS进行凝胶化反应制 得，GA中的醛基与0-CMCTS中氨基的摩尔比为1 :4-16,0_010^的脱乙酰度(00)>25%。
[0009] 本发明还提供一种如上所述关节润滑材料的制备方法，包括如下步骤：
[0010] A1.以甲壳素为原料，与氯乙酸反应制备0-羧甲基甲壳素(0-CMCH);
[0011] A2 · 0-CMCH 与碱反应制备 0-CMCTS;
[0012] A3.0-CMCTS与GA进行凝胶化反应制备共价交联型0-CMCTS水凝胶。
[0013] 目前报道的羧甲基壳聚糖(CMCTS)的制备大都以CTS为原料，将碱化的CTS分散在 异丙醇中，在加热的条件或微波照射条件下，用氯乙酸羧化CTS，从而得到CMCTS。该方法制 备原理简单，操作易行，但因 CTS分子结构中有2个羟基(C6-〇H和C3-〇H)和1个氨基(C2-NH 2)， 羧甲基化在这3个位置均可发生反应，因此产物有N，0-CMCTS、N-CMCTS和0-CMCTS三种，故此 方法选择性差，制备的产物结构不单一。
[0014] 为降低生产成本，现有反应中用甲壳素为原料，加入浓碱和氯乙酸，将脱乙酰化和 羧甲基化结合在一起，一步到位。这种方法步骤少，但同样选择性差，制备的产物结构不单 一;另外，此方法无法控制产物的脱乙酰度(DD)及羧甲基取代度(DS)。
[0015] 本发明为制备产物结构单一的0-CMCTS，控制产物DD和DS，以甲壳素为原料，采用 如上所述的A1和A2步骤，分别进行羧甲基取代反应和脱乙酰基反应来制备0-CMCTS。
[0016] 优选地，步骤A1包括如下步骤：
[0017] All.将甲壳素加入质量百分比浓度为20%_35%的碱液中，待碱渗透完全后进行 冷冻，冷冻完全后解冻得碱化甲壳素；
[0018] A12.将碱化甲壳素加入分散剂，并加入氯乙酸进行反应；
[0019] A13.反应结束后，进行后处理得到0-CMCH。
[0020] 进一步地优选，步骤Al 1中甲壳素为来源于虾壳或蟹壳或鱿鱼软骨中的甲壳素，其 脱乙酰度彡10% ;甲壳素重复单元与碱的摩尔比为1:6-11;碱为NaOH或Κ0Η中的一种。
[0021] 进一步地优选，步骤A12中分散剂为正丙醇、异丙醇和乙醇中的一种，其体积按甲 壳素的质量与分散剂的体积比为lg:10-30mL加入；甲壳素与氯乙酸的摩尔比为1:0.8-2.5; 反应温度为10-30°(：;反应时间为2-611。
[0022]进一步地优选，步骤A13中，所述的后处理为：将反应液过滤，滤渣溶于水，加酸调 节pH至8;过滤，留取滤液;将滤液进行超滤，超滤后的滤渣进行干燥，得分子量大于10000的 0-CMCH，其DD为 10%-20%，DS为50%-100%。
[0023] 优选地，步骤A2包括如下步骤:将0-CMCH与碱液混合进行反应，反应结束后加酸调 节pH至8，充分搅拌后过滤，滤液用乙醇进行沉淀;再次溶解、沉淀并过滤，留取滤渣，干燥得 0-CMCTS〇
[0024] 进一步地优选，步骤A2中碱液的质量百分比浓度为30%-60%，碱为Κ0Η或NaOH中 的一种;0-CMCH与碱的质量比为1:5-15;反应温度为60-100°(：，反应时间为2-611，所制得的 0-CMCTS的DD为25%-90%，DS为50%-100%。
[0025] 通过上述优化的步骤A1，甲壳素在较低温条件下与低浓度的碱液进行碱化得到碱 化甲壳素，再在低温下与氯乙酸进行羧甲基化反应制备0-CMCH，该优化的步骤使其羧甲基 取代只发生在C6-OH而不发生在C 2-NH2,且能更好地控制0-CMCH的DS值。通过上述优化的步 骤A2,0-CMCH与高浓度的碱液在高温下进行脱乙酰基反应制备0-CMCTS，能更好地控制0-CMCTS 的 DD 和 DS。
[0026]另通过如上所述A13的后处理步骤，能更好地将分子量大于10000的0-CMCH与分子 量小于10000的0-CMCH相分离，分离得到大分子量的0-CMCH，进而通过后续的步骤A2得到大 分子量的0-CMCTS。
[0027] 步骤A3中GA与0-CMCTS反应生成0-CMCTS水凝胶的反应式如下所示：
[0029] 本发明采用GA与0-CMCTS反应制备水凝胶，因0-CMCTS上C6位的羧酸根阴离子与C2 位氨基准阳离子的静电相吸作用，降低GA与氨基的反应速度，有利于GA与0-CMCTS混合均 匀，形成的凝胶均匀，不易破碎。
[0030] 优选地，步骤A3包括如下步骤:0-CMCTS溶于水，配制成0-CMCTS溶液，溶液过滤并 灭菌，加入GA溶液，在恒温水浴中进行凝胶化得共价交联型0-CMCTS水凝胶。
[0031] 进一步地优选，步骤A3中0-CMCTS溶液的质量百分比浓度为1%-3%，GA的质量百 分比浓度为2%，GA与0-CMCTS按GA中的醛基与0-CMCTS中氨基的摩尔比为1:4-16进行反应， 反应温度为37°C，凝胶化时间为0.5-10min，所制得的0-CMCTS水凝胶含水量>70%，保水率 >65%〇
[0032]本发明提供的共价交联型0-CMCTS水凝胶，具有的优势在于：该共价交联型0-CMCTS水凝胶凝胶化时间可控，含水量高且保水率高，具有良好的生物相容性且能在一定时 间内使关节保持一定的容量及弹性。本发明提供的0-CMCTS制备原理简单，操作易行，成本 低廉，产物结构单一，DD及DS均可控，进而与GA反应得到凝胶化时间可控，含水量高并保水 率高的共价交联型0-CMCTS水凝胶。
[0033]本发明优选地实施例还包括如下的有益效果：按照该方法制备的0-CMCTS，其0-CMCTS的DD和DS能分别控制在25%-90%和50 %-100 %，该0-CMCTS与GA完全反应，无6八残 留，制备得到的0-CMCTS水凝胶结构均匀，溶胀率高，生物相容性好。
【附图说明】 图1为本发明实施例样品G1、G2和G3的粘度随时间变化过程示意图。 图2为本发明实施例样品Gl、G2和G3在溶菌酶/PBS溶液中的降解率。 图3为本发明实施例样品G1、G2、G3和空白组培养24h的细胞图；图3a为样品G1，图3b为 样品G2，图3c为样品G3，图3d为空白组。
【具体实施方式】 [0034] 实施例1
[0035] A1、0-CMCH的制备：称取5.0g甲壳素，按甲壳素重复单元与NaOH摩尔比为1:6的比 例，称取5.9g NaOH配成质量百分比浓度为20%的NaOH溶液，将甲壳素粉末分散于NaOH溶液 中，搅拌均匀，于真空干燥箱中抽真空30min，待碱渗透完全后放入-20°C冰箱冷冻过夜。次 日解冻，将碱化甲壳素转入反应釜内，加入分散剂正丙醇50mL，室温下搅拌均匀，分四次加 入1.86g氯乙酸（lh内加完），于10°C恒温反应6h。反应结束后抽滤，将滤渣溶于水后加盐酸 调节pH至8左右，再用400目滤布过滤，滤液超滤5次，每次体积压缩比为1/5,超滤膜截留分 子量大于1 〇，〇〇〇，超滤后的浓溶液置于60 °C烘箱内鼓风干燥，得到0-CMCH，其DD = 10.22 %， DS = 50.21%。
[0036] A2、0-CMCTS的制备:称取2.0g步骤A1中制得的0-CMCH，按0-CMCH与NaOH质量比为 1:5的比例，称取10g NaOH配成质量百分比浓度为30%的NaOH溶液，将0-CMCH分散于NaOH溶 液中，搅拌均匀，于60°C恒温条件下脱乙酰反应4h。反应结束后冷却，向粘状物中加入适量 盐酸调节pH至8左右，充分搅拌至溶解。用400目滤布过滤，蒸去滤液中大部分水分后用无水 乙醇沉淀出产物并过滤，滤渣溶于水后再用无水乙醇沉淀，经3次沉淀加过滤后的滤渣置于 60 °C 烘箱内鼓风干燥，得到0-CMCTS，其DD = 25 · 42 %，DS = 50 · 06 %。
[0037] A3、共价交联型0-CMCTS水凝胶的制备:秤取0.5g步骤A2中制得的0-CMCTS，溶于去 离子水中配制成质量百分比浓度为1%的0-CMCTS溶液，用砂芯漏斗过滤，滤液置于高压灭 菌锅中湿热灭菌30min。在通风橱中配制质量百分比浓度为2%的GA溶液，滤膜过滤除菌。在 超净工作台上量取5mL配制好的无菌0-CMCTS溶液加入无菌西林瓶中，按照GA中醛基与0-CMCTS中氨基摩尔比为1:4的比例，加入适量的GA溶液，摇晃10秒使两者混合均匀，然后置于 37°C恒温水浴中观察其凝胶化过程，其凝胶化时间为9.8min。测定其含水量为71.5%，保水 率为68.20%。
[0038] 实施例2
[0039] A1、〇-CMCH的制备:称取5.0g甲壳素，按甲壳素重复单元与Κ0Η摩尔比为1:8.0的比 例，称取11.03g Κ0Η配成质量百分比浓度为25%的Κ0Η溶液，将甲壳素粉末分散于Κ0Η溶液 中，搅拌均匀，于真空干燥箱中抽真空30min，待碱渗透完全后放入-20°C冰箱冷冻过夜。次 日解冻，将碱化甲壳素转入反应釜内，加入分散剂异丙醇75mL，室温下搅拌均匀，分四次加 入2.33g氯乙酸（lh内加完），于15°C恒温反应5h。反应结束后抽滤，将滤渣溶于水后加盐酸 调节pH至8左右，再用400目滤布过滤，滤液超滤5次，每次体积压缩比为1/5,超滤膜截留分 子量大于1 〇，〇〇〇，超滤后的浓溶液置于60°C烘箱内鼓风干燥，得到0-CMCH，其DD = 14.79 %， DS = 81.35%〇
[0040] A2、0-CMCTS的制备:称取2.0g步骤A1中制得的0-CMCH，按0-CMCH与Κ0Η质量比为1: 8.0比例，称取16.0g Κ0Η配成质量百分比浓度为45%的Κ0Η溶液，将0-CMCH分散于Κ0Η溶液 中，搅拌均匀，于75°C恒温条件下脱乙酰反应5h。反应结束后冷却，向粘状物中加入适量盐 酸调节pH至8左右，充分搅拌至溶解。用400目滤布过滤，蒸去滤液中大部分水分后用无水乙 醇沉淀出产物并过滤，滤渣溶于水后再用无水乙醇沉淀，经3次沉淀加过滤后的滤渣置于60 °C 烘箱内鼓风干燥，得到0-CMCTS，其DD = 50 · 55 %，DS = 81 · 20 %。
[00411 A3、共价交联型0-CMCTS水凝胶的制备:秤取0.5g步骤A2中制得的0-CMCTS，溶于去 离子水中配制成质量百分比浓度为2%的0-CMCTS溶液，用砂芯漏斗过滤，滤液置于高压灭 菌锅中湿热灭菌30min。在通风橱中配制质量百分比浓度为2%的GA溶液，滤膜过滤除菌。在 超净工作台上量取5mL配制好的无菌0-CMCTS溶液加入无菌西林瓶中，按照GA中醛基与0-CMCTS中氨基摩尔比为1:6的比例，加入适量的GA溶液，摇晃10秒使两者混合均匀，然后置于 37°C恒温水浴中观察其凝胶化过程，其凝胶化时间为0.5min。测定其含水量为89.5%，保水 率为88.5%。
[0042] 实施例3
[0043] A1、〇-CMCH的制备：称取5. Og甲壳素，按甲壳素重复单元与NaOH摩尔比为1:9.0的 比例，称取8.87g NaOH配成质量百分比浓度为35%的NaOH溶液，将甲壳素粉末分散于NaOH 溶液中，搅拌均匀，于真空干燥箱中抽真空30min，待碱渗透完全后放入-20°C冰箱冷冻过 夜。次日解冻，将碱化甲壳素转入反应釜内，加入分散剂异丙醇90mL，室温下搅拌均匀，分四 次加入3.49g氯乙酸（lh内加完），于20°C恒温反应3.5h。反应结束后抽滤，将滤渣溶于水后 加盐酸调节pH至8左右，再用400目滤布过滤，滤液超滤5次，每次体积压缩比为1/5,超滤膜 截留分子量大于1〇,〇〇〇,超滤后的浓溶液置于60°C烘箱内鼓风干燥，得到0-CMCH，其DD = 15.29%，DS = 72.62%。
[0044] A2、0-CMCTS的制备:称取2.0g步骤A1中制得的0-CMCH，按0-CMCH与NaOH质量比为 1:10的比例，称取20g NaOH配成质量百分比浓度为50 %的NaOH溶液，将0-CMCH分散于NaOH 溶液中，搅拌均匀，于80°C恒温条件下脱乙酰反应6h。反应结束后冷却，向粘状物中加入适 量盐酸调节pH至8左右，充分搅拌至溶解。用400目滤布过滤，蒸去滤液中大部分水分后用无 水乙醇沉淀出产物并过滤，滤渣溶于水后再用无水乙醇沉淀，经3次沉淀加过滤后的滤渣 置于60 °C烘箱内鼓风干燥，得到0-CMCTS，其DD = 75 · 89 %，DS = 72 · 70 %。
[0045] A3、共价交联型0-CMCTS水凝胶的制备:秤取0.5g步骤A2中制得的0-CMCTS，溶于去 离子水中配制成质量百分比浓度为3%的0-CMCTS溶液，用砂芯漏斗过滤，滤液置于高压灭 菌锅中湿热灭菌30min。在通风橱中配制质量百分比浓度为2%的GA溶液，滤膜过滤除菌。在 超净工作台上量取5mL配制好的无菌0-CMCTS溶液加入无菌西林瓶中，按照GA中醛基与0-CMCTS中氨基摩尔比为1:8的比例，加入适量的GA溶液，摇晃10秒使两者混合均匀，然后置于 37°C恒温水浴中观察其凝胶化过程，其凝胶化时间为3.Omin。测定其含水量为84.3%，保水 率为85.6%。
[0046] 实施例4
[0047] A1、〇-CMCH的制备:称取5.0g甲壳素，按甲壳素重复单元与NaOH摩尔比为1:10.0的 比例，称取9.85g NaOH配成质量百分比浓度为30%的NaOH溶液，将甲壳素粉末分散于NaOH 溶液中，搅拌均匀，于真空干燥箱中抽真空30min，待碱渗透完全后放入-20°C冰箱冷冻过 夜。次日解冻，将碱化甲壳素转入反应釜内，加入分散剂乙醇l〇〇mL，室温下搅拌均匀，分四 次加入4.66g氯乙酸（lh内加完），于25°C恒温反应3h。反应结束后抽滤，将滤渣溶于水后加 盐酸调节pH至8左右，再用400目滤布过滤，滤液超滤5次，每次体积压缩比为1/5，超滤膜截 留分子量大于10,000，超滤后的浓溶液置于60°(：烘箱内鼓风干燥，得到0-01〇1，其00 = 16.61%，DS = 98.74%。
[0048] A2、0-CMCTS的制备:称取2.0g步骤A1中制得的0-CMCH，按0-CMCH与NaOH质量比为 1:12的比例，称取24.0g NaOH配成质量百分比浓度为55 %的NaOH溶液，将0-CMCH分散于 NaOH溶液中，搅拌均匀，于85°C恒温条件下脱乙酰反应3h。反应结束后冷却，向粘状物中加 入适量盐酸调节pH至8左右，充分搅拌至溶解。用400目滤布过滤，蒸去滤液中大部分水分后 用无水乙醇沉淀出产物并过滤，滤渣溶于水后再用无水乙醇沉淀，经3次沉淀加过滤后的滤 渣置于60 °C烘箱内鼓风干燥，得到0-CMCTS，其DD = 80.24 %，DS = 98.70 %。
[0049] A3、共价交联型0-CMCTS水凝胶的制备:秤取0.5g步骤A2中制得的0-CMCTS，溶于 去离子水中配制成质量百分比浓度为2%的0-CMCTS溶液，用砂芯漏斗过滤，滤液置于高压 灭菌锅中湿热灭菌30min。在通风橱中配制质量百分比浓度为2%的GA溶液，滤膜过滤除菌。 在超净工作台上量取5mL配制好的无菌Ο-CMCTS溶液加入无菌西林瓶中，按照GA中醛基与0-CMCTS中氨基摩尔比为1:12的比例，加入适量的GA溶液，摇晃10秒使两者混合均匀，然后置 于37°C恒温水浴中观察其凝胶化过程，其凝胶化时间为4.5min。测定其含水量为83.7%，保 水率为82.4%。
[0050] 实施例5
[00511 A1、0-CMCH的制备：称取5.0g甲壳素，按甲壳素重复单元与Κ0Η摩尔比为1:11.0的 比例，称取15.17g Κ0Η配成质量百分比浓度为35%的Κ0Η溶液，将甲壳素粉末分散于Κ0Η溶 液中，搅拌均匀，于真空干燥箱中抽真空30min，待碱渗透完全后放入-20°C冰箱冷冻过夜。 次日解冻，将碱化甲壳素转入反应釜内，加入分散剂异丙醇150mL，室温下搅拌均匀，分四次 加入5.82g氯乙酸（lh内加完），于30°C恒温反应2h。反应结束后抽滤，将滤渣溶于水后加盐 酸调节pH至8左右，再用400目滤布过滤，滤液超滤5次，每次体积压缩比为1/5,超滤膜截留 分子量大于10，000，超滤后的浓溶液置于60 °C烘箱内鼓风干燥，得到0-CMCH，其DD = 19.37%，DS = 89.68%。
[0052] A2、0-CMCTS的制备:称取2.0g步骤A1中制得的0-CMCH，按0-CMCH与Κ0Η质量比为1: 15的比例，称取30.0g Κ0Η配成质量百分比浓度为60 %的Κ0Η溶液，将0-CMCH分散于Κ0Η溶液 中，搅拌均匀，于l〇〇°C恒温条件下脱乙酰反应2h。反应结束后冷却，向粘状物中加入适量盐 酸调节pH至8左右，充分搅拌至溶解。用400目滤布过滤，蒸去滤液中大部分水分后用无水乙 醇沉淀出产物并过滤，滤渣溶于水后再用无水乙醇沉淀，经3次沉淀加过滤后的滤渣置于60 °C 烘箱内鼓风干燥，得到Ο-CMCTS，其DD = 90.00 %，DS = 89.62 %。
[0053] A3、共价交联型Ο-CMCTS水凝胶的制备:秤取0.5g步骤A2中制得的Ο-CMCTS，溶于去 离子水中配制成质量百分比浓度为3%的Ο-CMCTS溶液，用砂芯漏斗过滤，滤液置于高压灭 菌锅中湿热灭菌30min。在通风橱中配制质量百分比浓度为2%的GA溶液，滤膜过滤除菌。在 超净工作台上量取5mL配制好的无菌Ο-CMCTS溶液加入无菌西林瓶中，按照GA中醛基与0-CMCTS中氨基摩尔比为1:16的比例，加入适量的GA溶液，摇晃10秒使两者混合均匀，然后置 于37°C恒温水浴中观察其凝胶化过程，其凝胶化时间为8.2min。测定其含水量为82.0%，保 水率为80.6%。
[0054]相关测试
[0055] 选取实施例3、4、5中的步骤A3中制备的Ο-CMCTS水凝胶，分别标记为样品Gl、G2和 G3,对其进行粘度测试、降解率测试以及细胞毒性测试。
[0056] 粘度测试
[0057]通过流变仪测定各个Ο-CMCTS水凝胶形成过程中粘度随时间的变化过程，并目测 凝胶化时间。
[0058]通过流变仪测定样品粘度的变化过程如图1所示，横坐标为时间，纵坐标为粘度。 [0059]从图1中可以看出G1、G2和G3的粘度随时间的变化趋势基本一致，一开始粘度都是 随着时间的增加而增大，在某个时刻达到最大值，然后再减小。当水凝胶形成后，样品发生 了相变，由液态变为固态。
[0060] 因只有流动的流体才具有粘度，当水凝胶形成后，样品内的流体逐渐变少，则粘度 会变小。因此，我们可以判定图中出现的最大粘度对应的时刻即为凝胶化时间。
[0061] 根据图1所得凝胶化时间和目测的凝胶化时间如下表所示：
[0063]目测的凝胶化时间和流变仪测定的凝胶化时间虽有差异，但差异不大，且趋势一 致。
[0064]降解率测试
[0065]图2为样品G1、G2和G3在溶菌酶/PBS溶液中降解率测试结果，由于交联程度对水 凝胶降解速率的影响，样品G3水凝胶在最初呈现出较大的溶胀，而后逐渐降解，降解60天后 剩余质量最低，约为降解前质量的65%。因此，可以通过调节GA与0-CMCTS的比例来控制交 联程度，调节水凝胶降解速度，以满足细胞生长和组织修复的需求。
[0066] 细胞毒性测试
[0067]室温下将三种水凝胶供试品于75%酒精中浸泡2h消毒，再用无菌蒸馏水浸泡，滤 纸吸干，按照GB/T 16886.12的要求，每6cm2表面积的供试品采用lmL生理盐水浸提。将材料 置入浸提容器，供试品全部浸没于液体内，浸提温度为37± TC，浸提时间为48h。将材料浸 提液用筛目为〇.22μπι的过滤器过滤除菌后，进行MTT法测试细胞毒性。试验组、空白对照的 数据见如下表：
[0069]相对空白的存活率均大于70%，表明三种水凝胶均不具有潜在的细胞毒性。试验 样品50 %与100 %浸提液存活率均较高，不需重复试验。
[0070] 水凝胶浸提液培养的成纤维细胞见图3a-3d，图中3a、3b、3c和3d分别是加样G1、 G2、G3和空白组培养24h的细胞图。从图中可以看出细胞形态正常，贴壁生长良好，基本无圆 缩、悬浮和死亡，细胞密度无明显减少，细胞生长也无受到抑制，各组细胞均表现出良好的 生长状态。说明三种水凝胶均无细胞毒性，符合国标对医用材料的细胞毒性要求。
[0071] 根据GB/T 16886.11-2011/IS0 10993-11:2006《医疗器械生物学评价第11部分： 全身毒性试验》标准中推荐的急性全身毒性试验要求开展水凝胶生物相容性评价。将20只 小鼠，随机分成样品组和阴性对照组，每组5只。样品组和阴性对照组按50mL/kg的注射剂 量自腹腔分别注入被测样品浸提液和阴性对照液，之后将动物返回各自的笼子里饲养。注 射完毕后，观察小鼠即刻以及4h、24h、48h和72h观察试验组和对照组中动物的一般状态、毒 性表现和死亡动物数，并在72h观察后记录动物体重。
[0072] 每只动物的观察结果如下表，在72h观察期内，试验组动物反应不大于阴性对照 组，没有出现动物死亡和毒性反应，体重均有增长，与阴性对照相比无任何差异，说明三种 水凝胶无全身急性毒性反应。
[0074]由此可见，0-CMCTS水凝胶在体外无明显的细胞毒性、无刺激性、组织相容性良好， 体外酶解两个月后，其残留率较高，保持在65%以上。因此，本发明制备的0-CMCTS水凝胶具 有良好的生物相容性且能在一定时间内使关节保持一定的容量及弹性特征，可作为关节润 滑剂，适用于关节局部注射，促进软骨组织修复。
[0075]以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定 本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的技术人员来说，在不脱 离本发明构思的前提下，还可以做出若干等同替代或明显变型，而且性能或用途相同，都应 当视为属于本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种关节润滑材料，其特征在于，该材料包含共价交联型0-羧甲基壳聚糖水凝胶，其 凝胶化时间为0.5-10min，含水量> 70 %，保水率> 65 %。2. 如权利要求1所述的关节润滑材料，其特征在于，所述共价交联型0-羧甲基壳聚糖水 凝胶由戊二醛与〇-羧甲基壳聚糖按戊二醛中醛基与〇-羧甲基壳聚糖中氨基的摩尔比为1: 4-16进行凝胶化反应制得，0-羧甲基壳聚糖的脱乙酰度>25%。3. 如权利要求1所述的关节润滑材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： A1.以甲壳素为原料，与氯乙酸反应制备0-羧甲基甲壳素； A2.0-羧甲基甲壳素与碱反应制备0-羧甲基壳聚糖； A3.0-羧甲基壳聚糖与戊二醛进行凝胶化反应制备共价交联型0-羧甲基壳聚糖水凝 胶。4. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤A1包括如下步骤： All.将甲壳素加入质量百分比浓度为20%-35%的碱液中，待碱渗透完全后进行冷冻， 冷冻完全后解冻得碱化甲壳素； A12.将碱化甲壳素加入分散剂，并加入氯乙酸进行反应； A13.反应结束后，进行后处理得到0-羧甲基甲壳素。5. 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤Al 1中甲壳素为来源于虾壳或蟹壳 或鱿鱼软骨中的甲壳素，其脱乙酰度<10%;甲壳素重复单元与碱的摩尔比为1:6-11;碱为 NaOH或KOH中的一种； 步骤A12中分散剂为正丙醇、异丙醇和乙醇中的一种，其体积按甲壳素的质量与分散剂 的体积比为lg:10-30mL加入；甲壳素与氯乙酸的摩尔比为1:0.8-2.5;反应温度为10-30°C; 反应时间为2-6h; 步骤A13中，所述的后处理为:将反应液过滤，滤渣溶于水，加酸调节pH至8;过滤，留取 滤液;将滤液进行超滤，超滤后的滤渣进行干燥，得分子量大于10000的〇-羧甲基甲壳素，其 脱乙酰度为10%-20%，羧甲基取代度为50%-100%。6. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤A2包括如下步骤:将0-羧甲基甲壳 素与碱液混合进行反应，反应结束后加酸调节pH至8,充分搅拌后过滤，滤液用乙醇进行沉 淀并过滤;再次溶解、沉淀和过滤，留取滤渣，干燥得0-羧甲基壳聚糖。7. 如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤A2中碱液的质量百分比浓度为 30%-60%，碱为KOH或NaOH中的一种;0-羧甲基甲壳素与碱的质量比为1:5-15;反应温度为 60-100°C，反应时间为2-6h，所制得的0-羧甲基壳聚糖脱乙酰度为25%-90%，羧甲基取代 度为 50%-100%。8. 如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤A3包括如下步骤:0-羧甲基壳聚糖 溶于水，配制成0-羧甲基壳聚糖溶液，过滤并灭菌，加入戊二醛溶液，在恒温水浴中进行凝 胶化得共价交联型0-羧甲基壳聚糖水凝胶。9. 如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤A3中0-羧甲基壳聚糖溶液的百分比 浓度为1 %-3%，戊二醛的质量百分比浓度为2%，戊二醛与0-羧甲基壳聚糖按戊二醛中的 醛基与0-羧甲基壳聚糖中氨基的摩尔比为1:4-16进行反应，反应温度为37°C，凝胶化时间 为0.5- lOmin，所制得的0-羧甲基壳聚糖水凝胶含水量>70%，保水率>65%。10. 如权利要求1-9任一所述的共价交联型0-羧甲基壳聚糖水凝胶，在制备可注射骨关 节润滑材料中的应用。
【文档编号】C08B37/08GK106046397SQ201610492982
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月28日
【发明人】吴奕光, 杨帆, 江长兵, 吴灿光, 薛清辉
【申请人】深圳市阳光之路生物材料科技有限公司