一株耐高温解淀粉芽孢杆菌ytk1及其在烟叶烘烤中的应用
【专利摘要】本发明涉及微生物技术领域，具体公开了一株耐高温解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）YTK1及其在烟叶烘烤中的应用。所述菌株于2016年5月6日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），菌种保藏号为GDMCC No：60033。本发明发现菌株YTK1环境适应性强、能够耐受高温生长且长势好、同时能够高效降解烟叶淀粉含量及改善烟叶色香味，经所述菌株处理过的烘烤烟叶能够充分降解淀粉，可用于制备烟叶改良喷施菌剂。GDMCC No：6003320160506
【专利说明】
一株耐高温解淀粉芽孢杆菌YTK1及其在烟叶烘烤中的应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及微生物技术领域，具体地，涉及一株耐高温解淀粉芽孢杆菌YTKl及其在烟叶烘烤中的应用。
【背景技术】
[0002]烟草是叶用经济作物，其生产效益高低主要取决于烟叶质量的优劣。近年来随着新品种选育、集约化培育、平衡施肥等生产新技术的推广应用，我国烤烟烟叶量水平有所提高，但与国外优质烟叶还是有一定的差距。淀粉是烟叶中重要的基础有机化合物，在鲜烟叶中一般含有25?40%左右，烘烤过程中发生显著的变化，碳水化合物的降解、转化、消耗和积累状况决定着烟叶内在品质和外观商品等级的优劣。烟叶分解产物中，来自淀粉降解产物糖与氣基酸反应的占80%左右，而在烟气中占85%左右。初烤后烟叶残留的淀粉是对烟叶色、香、味不利的化合物，严重影响烟叶的外观和内在质量。在C/N平衡的条件下，烟叶中淀粉含量越低越好，可溶性糖和还原糖在抽吸时裂解物产生的酸性产物对平衡由烟碱和含氮化合物抽吸过程中产生的碱性烟气有积极作用。因此对淀粉代谢的研究已引起了广泛的关注，同时由于目前国内初烤烟叶淀粉含量较高，所以近几年对淀粉降解研究也正成为一个执占
I j wο
[0003]芽孢杆菌是土壤和自然界的优势微生物种群，广泛存在于自然界中，大多为非致病性细菌，对人畜无害，并且很多种类都具有抑制植物病害生长的能力。芽胞杆菌大多为内生芽胞，繁殖速度快，抗逆能力强，易定殖在植物根际表面。密集烤房实行机械设备通风，由于叶间隙风速大、强制排湿进而影响烟层温湿度、风速的分布，造成烟叶失水方式变化，烤后烟叶普遍存在颜色偏淡、成熟度下降、香气减弱，究其原因烟叶淀粉降解不充分，糖转化不完全所致。微生物的自养异养需要碳源和氮源，烟叶中就含有微生物生长繁殖的碳源和氮源，十分适于进行微生物发酵培养，而其自养异养所产生的生理生化作用对烟叶品质造成一定影响。芽孢杆菌能够在逆境中存活和生长，在较低水分高温条件下的烘烤烟叶中能够充分的利用淀粉以及高效产淀粉酶，从而降低烟草淀粉含量，所以筛选耐高温高效降解淀粉功能微生物在烟草应用上具有重要意义。
【发明内容】
[0004]本发明针对上述现有技术的不足，提供了一株耐高温解淀粉芽孢杆菌(feciHtASamyl ol iquefa ciaos)YTKl，所述菌株YTKI能够附着于烟叶表面，进入烟叶组织，与烟叶叶肉组织共生，在较低湿度条件下利用烟叶淀粉作为自身代谢的能源，以及高效产淀粉酶，充分降解了烟叶淀粉含量，从而改善烟叶品质。
[0005]本发明的另一目的在于提供上述解淀粉芽孢杆菌YTKl在烟叶烘烤中的应用。
[0006]本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。
[0007]一株解淀粉芽抱杆菌amyloliquefaciens)YVL\，所述菌株YTKl于2016年5月6日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，菌种保藏号为GDMCC No:60033，所述菌株分类命名为解淀粉芽孢杆菌YTKl;保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5层。
[0008]所述菌株YTKl的分离与筛选步骤如下:(I)分离:将采集的新鲜烟叶剪碎，置于灭菌培养皿中，经双氧水浸泡、升汞浸泡、无菌水漂洗后，置于LB液体培养基中37 0C ,120 r/min扩大培养2 d，经80 °C水浴30 min杀死非芽孢杆菌，取上述菌液置于LB固体培养基上37°C培养2 d，挑取长势较好的菌落进行传代培养，再通过简单染色(石碳酸复红染色)和显微镜镜检(油镜)观察，将纯化菌株接种于LB液体培养基培养2?3 d，80 °C水浴30 min后于LB固体培养基上涂平板获得芽孢杆菌；(2)筛选:将步骤(I)得到的芽孢杆菌接种于LB固体培养基上，在50?70 °C范围内每隔2 °(:作为一个处理，10个处理，重复3次，恒温培养;刮取菌体，用无菌水稀释成10—3菌体浓度，取2 yL菌液接种于淀粉琼脂平板上37 °C培养I?2 d，经即配碘液染色，观察透明圈，获得降解淀粉功能的芽孢杆菌。
[0009]优选地，所述菌株YTKl呈杆状，产芽孢，菌株YTKl菌落在LB培养基平板上生长速度较快，在液体培养基中形成菌膜，在固体培养基上菌落呈淡黄色，不透明，表面粗糙，边缘不规则。
[0010]优选地，所述菌株YTKl对浓度为1.5%NaCl、300 yg/mL氨苄青霉素、100 yg/mL链霉素和四环素、5 yg/mL氯霉素和红霉素均具有耐受性;对卡拉霉素、庆大霉素和新霉素耐受性小于5 yg/mLo
[0011]优选地，所述菌株YTKl能利用以淀粉、吐温40、吐温80、L-阿拉伯半糖、D-阿拉伯半糖、鹿糖、D-葡萄糖、麦芽糖、D-甘露糖、α-D-乳糖、D-半乳糖、山梨糖、L-果糖、D-果糖、蜜二糖、龙胆二糖、D-纤维二糖、棉子糖、木糖、菊糖、松三糖、D-核糖、海藻糖、甘露醇、L-阿糖醇、D-阿糖醇、山梨醇、木糖醇、己六醇、肌醇、半乳糖醇、山梨糖醇、侧金盏花醇、甲酸钠、丙酸钙、a-酮戊二酸、丙酮酸钠、羟基苯乙酸、苯甲酸钠、葡萄糖酸钠、柠檬酸钠、琥珀酸钠、水杨酸钠、乌头酸、苹果酸、γ-氨基丁酸、苦杏仁苷、肌苷、水杨苷、甘油、羟甲基纤维素、N-乙酰葡萄糖胺、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-白氨酸、甘氨酸、苏氨酸、赖氨酸、脯氨酸、色氨酸、缬氨酸、丝氨酸、精氨酸、胱氨酸、L-羟脯氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸为碳源的培养基上生长
优选地，所述菌株YTKl的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
[0012]本发明还提供上述的耐高温解淀粉芽孢杆菌YTKl在烟叶烘烤中的应用。
[0013]优选地，所述应用的具体方法为将OD6qq=I的YTKl菌株的菌悬液喷施于烘烤前的烟叶表面。
[0014]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
(I)本发明筛选获得的解淀粉芽孢杆菌YTKl生长速度快、对环境适应性强、抗逆性强。
[0015](2)本发明筛选获得的解淀粉芽孢杆菌YTKl，具有在烟叶高温烘烤过程中高效降解淀粉的能力，经所述菌株处理过的烘烤烟叶能够充分降解烘烤烟叶淀粉含量，一定程度上降低烟丝燃吸时产生的焦糊气味、刺激性和杂气，增加烟草光亮色泽，有效改善烟草品质，可用于制备烟叶改良喷施菌剂。
【附图说明】
[0016]图1为菌株YTKl在点接于淀粉培养基培养48小时后经即配碘液染色所显示的淀粉透明圈。
[0017]图2为菌株YTKl制成的菌悬液喷施于烘烤前的烟叶表面上，再经烤房烘烤过后所呈现的烟叶外观形态，左侧为CK，右图为经YTKl处理后烟叶。
【具体实施方式】
[0018]下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0019]实施例1耐高温解淀粉芽孢杆菌YTKl的分离和筛选
分离纯化:将南雄烟草研究所试验基地采摘的新鲜烟叶带回实验室，称取5 g新鲜烟叶样本，用蒸馏水洗净，然后剪碎叶片置于已灭菌的培养皿中，用3%的双氧水(H2O2)浸泡4 min(以除去根表面的腐烂物质)，无菌水洗涤一次，再用0.1%的升汞(HgCl2)浸泡5 min，无菌水中振动洗涤5?7次，每次5?10 min，并将最后一次洗涤液涂布于LB固体培养基上，以检测消毒是否彻底。将表面消毒彻底的烟叶样本接种于80 ml LB液体培养基的250 mL三角瓶中37 0C ,120 r/min扩大培养2天后，于恒温循环水浴槽中设置温度80 °C水浴30 min，杀死非芽孢菌，用灭菌枪头吸取50 yLUOO yL和200 yL菌液分别在LB固体培养基上涂平板，于37°C恒温培养箱中培养2?3天，观察菌体的生长情况，用接种环挑取长势较好并不同形态特征的菌苔，用平板划线法进行反复传代培养，直至菌落的颜色、形状、大小、质地和透明度一样。最后通过简单染色(石碳酸复红染色)和显微镜镜检(油镜)，进一步观察其形态，以长度均一、宽度一致、染色情况统一为菌株纯化标准。将纯化后的菌株再次接种于LB液体培养基培养2?3天，800C水浴30 min后于LB固体培养基上涂平板，若能形成菌落，确认为芽孢菌，于LB固体培养基富集培养，暂存于4 °C冰箱。
[0020]筛选:(I)从冰箱中取出保存的菌株，在超净工作台中用经酒精灯烧红冷却后的接种环沾取少量菌体，接种于LB固体培养基中，分别放置于不同温度条件下的电热恒温培养箱中进行培养，温度设置在50?70 °C范围内，每隔2 °C作为一个处理，共10个温度处理下进行筛选(每个处理平行重复3次)。
[0021](2)从平板上用烧红冷却后的接种环刮取菌体1/3环，转接于装有I mL无菌蒸馏水的离心管中，再从中吸取100 yL混勾菌悬液转移至另一装有900 yL无菌水的离心管中，重复此操作，分别稀释为10—\ 10—2、10—3菌体浓度，充分振荡摇匀，于超净工作台中取2 yL 10—3菌体溶液点接于淀粉琼脂平板上(每种处理平行重复3次)，待菌液自然干燥后倒扣固定放置于37 °C恒温培养箱内培养I?2天。当菌体长到一定圆形大小时，吸取一定量即配碘液滴在菌落边缘上，观察菌落周围透明圈，如图1所示。
[0022]试验结果表明，该菌株在温度设置范围内60°C以下都能生长且长势较好，经碘液检测的菌落出现明显透明圈，说明该菌能够较好的降解淀粉。因此，采用上述方法成功筛选获得一株能够耐受高温生长且具降解淀粉功能的菌株，命名为YTK1。
[0023]保存:将分离纯化后的菌株YTKl在LB平板上培养I?2d后，收集平板上的菌体。保存于15%灭菌甘油管中(-20 0O0
[0024]实施例2解淀粉芽孢杆菌YTKl的鉴定
所述菌株呈杆状，产芽孢。菌落在LB培养基平板上生长速度较快，液体培养基中形成菌膜，在固体培养基上菌落呈淡黄色，不透明，表面粗糙，边缘不规则。37 °C，生长48小时，菌落直径8?12 mnupH生长范围较广，可耐pH 3?10，最适生长温度是37°C及最佳生长pH值6?7。对浓度为1.5%NaCl、300 yg/mL氨苄青霉素、100 yg/mL链霉素和四环素、5 yg/mL氯霉素和红霉素均具有耐受性;而对卡拉霉素、庆大霉素和新霉素耐受性差，低浓度(5 yg/mL)的这几种抗生素就能抑制其生长。兼性厌氧，能利用以淀粉、吐温40、吐温80、L-阿拉伯半糖、D-阿拉伯半糖、鹿糖、D-葡萄糖、麦芽糖、D-甘露糖、α-D-乳糖、D-半乳糖、山梨糖、L-果糖、D-果糖、蜜二糖、龙胆二糖、D-纤维二糖、棉子糖、木糖、菊糖、松三糖、D-核糖、海藻糖、甘露醇、L-阿糖醇、D-阿糖醇、山梨醇、木糖醇、己六醇、肌醇、半乳糖醇、山梨糖醇、侧金盏花醇、甲酸钠、丙酸钙、a-酮戊二酸、丙酮酸钠、羟基苯乙酸、苯甲酸钠、葡萄糖酸钠、柠檬酸钠、琥珀酸钠、水杨酸钠、乌头酸、苹果酸、γ-氨基丁酸、苦杏仁苷、肌苷、水杨苷、甘油、羟甲基纤维素、N-乙酰葡萄糖胺、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-白氨酸、甘氨酸、苏氨酸、赖氨酸、脯氨酸、色氨酸、缬氨酸、丝氨酸、精氨酸、胱氨酸、L-羟脯氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸为碳源的培养基上生长。
[0025]所述菌株通过16S rDNA扩增和测序，测序结果如SEQ ID NO:1所示，将获得的DNA序列输入GenBank进行比对，初步确定所述菌株在分类学中的菌株种属的位置。结果发现所述菌株属于芽孢杆菌属，与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus a?7_/o_/i<7we/acie/3s)模式菌株DSM7相似性为99.50%。
[0026]因此，通过形态学特征、生理生化特性及16SrDNA系统发育分析，菌株RF2鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus a?j^oJi<7t/e/acie/3s)。将所述菌株保藏已于2016年5月6日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，菌种保藏号为GDMCC No:60033，所述菌株分类命名为解淀粉芽孢杆菌(feciHus amyloliquefaciens)\VL\ ;保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5层。
[0027]实施例3解淀粉芽孢杆菌YTKl在烟叶烘烤过程中降解淀粉的效果
将供试菌株YTKl在芽孢优化液体培养基中扩培48 h，取100 mL培养液中的上清菌悬液测定0D6QQ，然后将菌悬液稀释至OD6qq=I，转入无菌喷壶中，均匀的喷施于烘烤前的烟叶(同一批次同一品种同一部位)表面上，此处理设为试验组。对照组在烘烤前烟叶上喷施等量的清水。然后放入烤房进行烘烤，烘烤结束后从烤房取出，观察烟叶色泽并拍照(如图2所示)。将烘烤完毕的烟叶采用碘显色法进行测定烟叶淀粉含量。结果表明:对照组烟叶色泽暗淡无光泽，淀粉含量为61.96±0.7 mg/g;试验组烟叶色泽光亮，烟叶气味比对照组更醇香，淀粉含量为42.18±0.5 mg/g，同比对照组烟叶淀粉含量降低了31.92%。
[0028]通过试验结果可得，解淀粉芽孢杆菌YTKl能够有效的降解烟叶淀粉含量，主要因为该菌能够附着于烟叶表面，进入烟叶组织，与烟叶叶肉组织共生，在较低湿度高温烘烤条件下利用烟叶淀粉作为自身代谢的能源，且高效产淀粉酶，充分降解烟叶淀粉含量，改善烟叶品质。
【主权项】
1.一株耐高温解淀粉芽孢杆菌(feciHus a?72o2i(7ye/acie/3s)YTKl，其特征在于，所述菌株于2016年5月6日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，菌种保藏号为GDMCCNo:60033ο2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株YTKl呈杆状，产芽孢，菌落在LB培养基平板上生长速度较快，在液体培养基中形成菌膜，在固体培养基上菌落呈淡黄色，不透明，表面粗糙，边缘不规则。3.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株YTKI对浓度为1.5%NaCl、300yg/mL氨苄青霉素、100 yg/mL链霉素和四环素、5 yg/mL氯霉素和红霉素均具有耐受性;对卡拉霉素、庆大霉素和新霉素耐受性小于5 yg/mLo4.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株YTKl能利用以淀粉、吐温40、吐温80、L-阿拉伯半糖、D-阿拉伯半糖、鹿糖、D-葡萄糖、麦芽糖、D-甘露糖、α-D-乳糖、D-半乳糖、山梨糖、L-果糖、D-果糖、蜜二糖、龙胆二糖、D-纤维二糖、棉子糖、木糖、菊糖、松三糖、D-核糖、海藻糖、甘露醇、L-阿糖醇、D-阿糖醇、山梨醇、木糖醇、己六醇、肌醇、半乳糖醇、山梨糖醇、侧金盏花醇、甲酸钠、丙酸钙、a-酮戊二酸、丙酮酸钠、羟基苯乙酸、苯甲酸钠、葡萄糖酸钠、柠檬酸钠、琥珀酸钠、水杨酸钠、乌头酸、苹果酸、γ-氨基丁酸、苦杏仁苷、肌苷、水杨苷、甘油、羟甲基纤维素、N-乙酰葡萄糖胺、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-白氨酸、甘氨酸、苏氨酸、赖氨酸、脯氨酸、色氨酸、缬氨酸、丝氨酸、精氨酸、胱氨酸、L-羟脯氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸为碳源的培养基上生长。5.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述菌株YTKl的16SrDNA序列如SEQ IDNO:1所示。6.权利要求1所述的耐高温解淀粉芽孢杆菌YTKl在烟叶烘烤中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用的具体方法为将OD6qq=I的YTKl菌株的菌悬液喷施于烘烤前的烟叶表面上。
【文档编号】C12R1/07GK106047747SQ201610330522
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月18日
【发明人】贺广生, 王勇, 张国华, 谭志远, 王行, 王军, 彭桂香
【申请人】中国烟草总公司广东省公司, 华南农业大学, 中国烟草总公司河南省公司, 广东省烟草南雄科学研究所