一种增菌培养基及其制备方法、增菌培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种增菌培养基，其包括母液和选择性添加在母液中用以抑制革兰氏阴性菌生长的选择性添加剂，母液由按重量份数计的氯化钠1.5～3.0份、蛋白胨1.0～3.0份、酵母浸粉0.2～0.8份、磷酸二氢钠0.5～1.5份、磷酸二氢钾0.1～0.5份、组合促进剂0.7～2.0份加入到100份的水中经加热溶解再冷却制得。该增菌培养基可对沙门氏菌、出血性大肠埃希氏菌O157、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌和单增李斯特氏菌同时进行增菌培养，为食品检验节约了工作量和提高了检验的效率。此外，本发明还公开了此增菌培养基的制备方法。
【专利说明】
-种増菌培养基及其制备方法、増菌培养方法
技术领域
[0001] 本发明设及微生物培养技术领域，具体而言，设及一种增菌培养基及其制备方法、 增菌培养方法。
【背景技术】
[0002] 目前，食品中的生物性污染问题无论是发达国家还是发展中国家都是关于食品安 全的最主要原因。目前针对食品中的致病菌的检测一般都是按照有关标准方法进行，而相 关标准方法的确立主要依赖于传统的分离鉴定方法。针对于每种致病菌均需要其特定的增 菌培养基进行增菌，选择性增菌等步骤;同一样品需要同时进行多种致病菌的检测，运样就 需要同时在多种特定的增菌培养基上进行样品的增菌处理，造成检测工作前期增菌过程繁 琐。
[0003] 传统的微生物培养的方法至今仍然是甄别微生物的权威方法。国标增菌方法需要 对样品进行3-4次增菌才能完成细菌的增菌过程，而复合增菌只需要一次增菌过程即可完 成细菌的增殖过程，相比较于国标增菌方法操作简便。现有的增菌培养基单次增菌只能增 菌1~巧巾致病菌，无法实现快速检测的目的，因此，为实现致病菌的快速增菌检测，有必要 对于传统培养基和方法进行改进。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种增菌培养基，此增菌培养基够用于对多种致病菌的同 时快速增菌培养，实现快速检测的目的。
[0005] 本发明的另一目的在于提供上述增菌培养基的制备方法，W得到增菌培养基，此 增菌培养基够用于对多种致病菌的同时快速增菌培养，实现快速检测的目的。
[0006] 本发明的再一目的在于提供一种增菌培养方法，该增菌培养方法能够同时对多种 致病菌进行增菌培养，实现快速检测的目的。
[0007] 本发明解决其技术问题是采用W下技术方案来实现的。
[000引一种增菌培养基，其包括母液，母液由按重量份数计的氯化钢1.5~3.0份、蛋白腺 1.0~3.0份、酵母浸粉0.2~0.8份、憐酸二氨钢0.5~1.5份、憐酸二氨钟0.1~0.5份、组合 促进剂0.7~2.0份加入到100份的水中经加热溶解再冷却制得，组合促进剂是葡萄糖和乳 糖中的一种或两种的组合，增菌培养基按重量份数计还包括在细菌接种至母液培养后添加 至母液中的W抑制革兰氏阴性菌生长的选择性添加剂0.001~0.003份。
[0009] -种增菌培养基的制备方法，其包括：按重量份计取氯化钢1.5~3.0份、蛋白腺 1.0~3.0份、酵母浸粉0.2~0.8份、憐酸二氨钢0.5~1.5份、憐酸二氨钟0.1~0.5份、组合 促进剂0.7~2.0份加入至100份水中，加热溶解、经灭菌后制得母液，组合促进剂是葡萄糖 和乳糖中的一种或两种的组合；
[0010] 按重量份计取抑制革兰氏阴性菌生长的选择性添加剂0.001~0.003份，用于在致 病菌接种至母液培养后添加至母液中。
[0011] -种增菌培养方法，先将致病菌接种至母液中培养，再往接种有致病菌的母液中 加入W抑制革兰氏阴性菌生长的选择性添加剂，母液将按重量份数计的氯化钢1.5~3.0 份、蛋白腺1.0~3.0份、酵母浸粉0.2~0.8份、憐酸二氨钢0.5~1.5份、憐酸二氨钟0.1~ 0.5份、组合促进剂0.7~2.0份加入到100份的水中经加热溶解再冷却制得，组合促进剂是 葡萄糖和乳糖中的一种或两种的组合，选择性添加剂按重量份数计为0.001~0.003份。
[0012] 本发明提供的增菌培养基及其制备方法、增菌培养方法的有益效果是:增菌培养 基的母液由按重量份数计的氯化钢1.5~3.0份、蛋白腺1.0~3.0份、酵母浸粉0.2~0.8份、 憐酸二氨钢0.5~1.5份、憐酸二氨钟0.1~0.5份、组合促进剂0.7~2.0份加入到100份的水 中经加热溶解再冷却制得，组合促进剂是葡萄糖和乳糖中的一种或两种的组合，该增菌培 养基含有适宜比例的蛋白腺和酵母浸粉，其营养成分丰富全面、为致病菌提供了适宜的生 长环境，其能够满足多种致病菌的生长;另外，该增菌培养基按重量份数计还包括在致病菌 接种至母液培养后添加至母液中的W抑制革兰氏阴性菌生长的选择性添加剂0.001~ 0.003份，选择性添加剂能抑制革兰氏阴性菌生长，有助于实现各种目标致病菌的平衡生 长，阻止非致病菌对营养的竞争。因此，本发明的增菌培养基能够实现对沙口氏菌、大肠埃 希氏菌0157、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌和单增李斯 特氏菌等多种致病菌进行同时增菌培养，增菌效率高，不用对每种致病菌进行单独增菌培 养，节约了食品检验的工作量。
【具体实施方式】
[0013] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中 的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建 议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可W通过市售购买获得的常规产 品。
[0014] 下面对本发明实施例的增菌培养基及其制备方法、增菌培养方法进行具体说明。
[0015] -种增菌培养基，其包括母液，母液由按重量份数计的氯化钢1.5~3.0份、蛋白腺 1.0~3.0份、酵母浸粉0.2~0.8份、憐酸二氨钢0.5~1.5份、憐酸二氨钟0.1~0.5份、组合 促进剂0.7~2.0份加入到100份的水中经加热溶解再冷却制得，组合促进剂是葡萄糖和乳 糖中的一种或两种的组合，增菌培养基按重量份数计还包括在细菌接种至母液培养3~4h 后添加至母液中的W抑制革兰氏阴性菌生长的选择性添加剂0.001~0.003份。需要说明的 是，组合促进剂若同时选用葡萄糖和乳糖，则葡萄糖与乳糖的重量比为1:1。
[0016] 其中，蛋白腺和酵母浸粉提供细菌生长和代谢产酶所需的碳源和氮源，为各致病 菌的生长提供全面、均衡的营养;较佳地，蛋白腺是膜蛋白腺和月示腺中的一种或两种的组 合。需要说明的是，蛋白腺若同时选用膜蛋白腺和月示腺，则膜蛋白腺与月示腺的重量比为 1:1。
[0017] 氯化钢提供一定的渗透压;憐酸氨二钢和憐酸二氨钟为培养体系提供缓冲，调节 细菌生长过程中培养基抑。氯化钢、憐酸氨二钢和憐酸二氨钟为各致病菌的生长提供适宜 的生长环境，适应于各种致病菌同时生长。另外，组合促进剂作为细菌的优先使用碳源，能 促进细菌生长和代谢产酶。
[0018] 较佳地，选择性添加剂是糞晚酬酸钢和叮晚黄素中的一种或两种的组合。糞晚酬 酸钢和叮晚黄素均可在一定程度上抑制革兰氏阴性菌生长，使需要增菌的目标致病菌能够 有充足的生长营养和空间，并使各致病菌的相互生长处于平衡状态，避免相互竞争。需要说 明的是，如果选择性添加剂是糞晚酬酸钢和叮晚黄素，则按糞晚酬酸钢与叮晚黄素的重量 比为1:1的比例组合形成选择性添加剂。
[0019] 较佳地，母液的pH为7.0~7.4。呈中性的母液为各致病菌的生长提供适宜的生长 环境，适应于各种致病菌同时生长。
[0020] 上述增菌培养基的制备方法，其包括：
[0021] 按重量份计取氯化钢1.5~3.0份、蛋白腺1.0~3.0份、酵母浸粉0.2~0.8份、憐酸 二氨钢0.5~1.5份、憐酸二氨钟0.1~0.5份、组合促进剂0.7~2.0份加入至100份水中，加 热揽拌溶解、经灭菌后制得母液，得到母液。组合促进剂是葡萄糖和乳糖中的一种或两种的 组合。
[0022] 其中，在加热揽拌溶解后，母液需经过冷却至室溫，然后调节母液的pH至7.0~ 7.4，W保证抑值的稳定性;接着，将母液于120°C~122°C下高压灭菌20~25min，冷却至室 溫，得到无菌的母液。
[002引然后，按重量份计取抑制革兰氏阴性菌生长的选择性添加剂0.001~0.003份，用 于在致病菌接种至所述母液培养后添加至所述母液中。选择性添加剂是糞晚酬酸钢和叮晚 黄素中的一种或两种的组合。
[0024] 优选地，先将选择性添加剂加入到水中，充分溶解，进行过滤除菌，得到选择性添 加剂溶液。使用时，直接将选择性添加剂溶液直接添加到母液即可。
[0025] 一种增菌培养方法，其包括：
[0026] 先将致病菌接种至上述母液中培养，具体地，直接将待测样本接种至母液中，进行 培养；
[0027] 再往接种有致病菌的母液中加入W抑制革兰氏阴性菌生长的上述选择性添加剂。 [00%]较佳地，选择性添加剂在致病菌接种至母液培养3-4h后添加至母液中。加入选择 性添加剂后，革兰氏阴性菌生长受到抑制，使得各致病菌的生长相互协调、平衡，其能够得 到快速地繁殖，进而实现单次快速对多种致病菌的增菌效果。不用再对各致病菌进行单独 地增菌培养，进而有助于提高检验工作的效率。
[0029] 综上，本发明的增菌培养基，依据食品中各致病菌的生长特性，种属差异并结合食 品中致病菌易受损需修复等特点，针对性地对增菌培养基的组分进行优化设计和搭配。使 得本发明的增菌培养基可有效地对沙口氏菌、大肠埃希氏菌0157、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄 球菌、志贺氏菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌和单增李斯特氏菌进行增菌培养。节约了检验时 间和工作量，为实现对食品的快速检测提供了基础。
[0030] W下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
[0031] 实施例1
[0032] 本实施例提供了增菌培养基的制备方法W及由该制备方法所制得的增菌培养基。
[0033] 增菌培养基的制备方法包括：
[0034] 按母液的配方取氯化钢1.5g、蛋白腺l.Og、酵母浸粉0.2g、憐酸二氨钢0.5g、憐酸 二氨钟o.lg、促进剂〇.7g加入到蒸馈水100ml中，加热揽拌至完全溶解。促进剂是葡萄糖。 [00巧]冷却至室溫后调节抑至7.2左右，于12TC高压灭菌20min，冷却至室溫，得到母液 100mlo
[0036] 取可抑制革兰氏阴性菌生长的选择性添加剂0.002g，加入到2ml蒸馈水中（蒸馈水 与选择性添加剂体积质量比为1000:1，在其他实施例中，该比例不作限定，其主要作用在于 提前溶解选择性添加剂，确保在使用时选择性添加剂能够快速分散到母液中，只要每100ml 母液添加有O.OOlg~0.003g选择性添加剂即可），充分溶解，得到选择性添加剂溶液，选择 性添加剂是糞晚酬酸钢。。
[0037] 对选择性添加剂溶液进行过滤除菌，滤膜为0.22um，得到无菌的含有选择性添加 剂的选择性添加剂溶液2ml。该选择性添加剂溶液可在致病菌接种至母液培养后再全部加 入到母液中。
[003引实施例2~7
[0039] 实施例2~7提供了增菌培养基的制备方法和由该制备方法得到的对应的增菌培 养基，实施例2~7提供的增菌培养基的制备方法与实施例1基本相同，不同的是母液和选择 性添加剂的成分，实施例2~7的母液核选择性添加剂的成分组成W及用量见表1。
[0040] 表1.本发明实施例2-7的母液和选择性添加剂的成分W及用量
[0041]
[0042] 注:表中各成分的用量单位为g，"-"代表未加入。
[0043] 实施例8
[0044] 本实施例对增菌培养方法进行说明，所用的培养基为上述实施例1所制得的增菌 培养基，W含有致病菌的活化菌液来进行说明。
[0045] 本实施例的增菌培养方法，包括：
[0046] 将各致病菌的活化菌液稀释十倍后，一并加入到实施例1提供的母液中，于35°C、 150rpm条件下培养。并对稀释十倍的活化菌液中的致病菌计数，作为增菌前的培养液中的 菌落总数。当然，在具体实际工作过程中，进行增菌时，也可W直接将待测样本(固体）lmg接 种到母液中，进行增菌。
[0047] 待培养至化，将实施例1提供的选择性添加剂全部加入至接种培养后的母液中，继 续培养12h。培养结束后，对培养液的致病菌类别和数量进行检测。检测的方法可参考如下： 将培养液按十倍比例进行梯度稀释，将稀释液用各种致病菌对应的显色培养基在35°C培养 12小时，采用平板计数方法进行计数，计算出整个培养液中增菌后的菌落总数，结果如表2 所示。
[0048] 表2.实施例1提供的增菌培养基对致病菌增菌培养的结果
[0049]
[0050] 由表2可W，采用本发明提供的增菌培养基进行培养后的致病菌的菌落总数已能 满足检测要求，且能够增菌培养的致病菌的类别较多，包括有沙口氏菌、出血性大肠埃希氏 菌0157、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌和单增李斯特氏 -tt： 园〇
[0051 ]此外，在实际的检测过程，如果增菌培养后，需要进一步的分子检测，可参考如下 方法进行:对待测样本进行增菌培养时，将待测样本分为相同质量的两份(例如每份待测样 本1~5mg)，分别接种至相同的母液A和母液B中（母液A和母液B的成分及用量与本发明任意 实施例提供的母液相同）。培养3~4h后，往母液A中添加选择性添加剂，母液B不加选择性添 加剂。培养结束后，分别提取母液A中的致病菌基因组DNA和母液B中的致病菌基因组DNA，将 两份基因组DNA混合，再用于后续的多重PCR等分子检测中，运样检测出的结果更准确和可 靠。
[0化2] 实施例9
[0053] 采用实施例2~7的增菌培养基进行增菌培养基，增菌培养方法和步骤同实施例8。 实施例2~7的增菌培养基增菌培养基的结果见表3。
[0054] 表3.实施例2~7提供的增菌培养基对致病菌增菌培养的结果
[0化5]
[0056] 由表3可W，采用本发明实施例2~7提供的增菌培养基进行培养后的致病菌的菌 落总数同意能满足检测要求。由此表明，采用本发明提供的增菌培养基能够同时对沙口氏 菌、出血性大肠埃希氏菌0157、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、霍乱弧菌、副溶血 性弧菌和单增李斯特氏菌进行增菌培养。
[0057] 综上，采用本发明提供的培养基可同时对沙口氏菌、大肠埃希氏菌0157、阪崎肠杆 菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌和单增李斯特氏菌等致病菌进行 复合增菌，避免各自增菌的繁琐程序提高了工作效率;增菌后的培养基可W直接做目标菌 的分离培养和生物鉴定实验，也可W直接用于PCR检测。
[005引 W上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技 术人员来说，本发明可W有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修 改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种增菌培养基，其特征在于，其包括母液，所述母液由按重量份数计的氯化钠1.5 ~3.0份、蛋白胨1.0~3.0份、酵母浸粉0.2~0.8份、磷酸二氢钠0.5~1.5份、磷酸二氢钾 0.1~0.5份、组合促进剂0.7~2.0份加入到100份的水中经加热溶解再冷却制得，所述组合 促进剂是葡萄糖和乳糖中的一种或两种的组合，所述增菌培养基按重量份数计还包括在细 菌接种至所述母液培养后添加至所述母液中的以抑制革兰氏阴性菌生长的选择性添加剂 0.001 ~0.003份。2. 根据权利要求1所述的增菌培养基，其特征在于，所述选择性添加剂是萘啶酮酸钠和 吖啶黄素中的一种或两种的组合。3. 根据权利要求2所述的增菌培养基，其特征在于，所述母液的pH为7.0~7.4。4. 根据权利要求1~3中任一项所述的增菌培养基，其特征在于，所述蛋白胨是胰蛋白 胨和月示胨中的一种或两种的组合。5. -种增菌培养基的制备方法，其特征在于，其包括： 按重量份计取氯化钠1.5~3.0份、蛋白胨1.0~3.0份、酵母浸粉0.2~0.8份、磷酸二氢 钠0.5~1.5份、磷酸二氢钾0.1~0.5份、组合促进剂0.7~2.0份加入至100份水中，加热溶 解、经灭菌后制得母液，所述组合促进剂是葡萄糖和乳糖中的一种或两种的组合； 按重量份计取抑制革兰氏阴性菌生长的选择性添加剂0.001~0.003份，在致病菌接种 至所述母液培养后，将所述选择性添加剂添加至所述母液中。6. 根据权利要求5所述的增菌培养基的制备方法，其特征在于，将所述氯化钠、所述蛋 白胨、所述酵母浸粉、所述磷酸二氢钠、所述磷酸二氢钾、所述组合促进剂加入至所述水中 后，经加热搅拌溶解，再经第一次冷却处理冷却至室温后调节pH至7.0~7.4。7. 根据权利要求6所述的增菌培养基的制备方法，其特征在于，调节pH至7.0~7.4之 后，于120 °C~122 °C下灭菌20~25min，再经第二次冷却处理冷却至室温。8. -种增菌培养方法，其特征在于，其包括:先将致病菌接种至母液中培养，再往接种 有所述致病菌的所述母液中加入以抑制革兰氏阴性菌生长的选择性添加剂，所述母液由按 重量份数计的氯化钠1.5~3.0份、蛋白胨1.0~3.0份、酵母浸粉0.2~0.8份、磷酸二氢钠 0.5~1.5份、磷酸二氢钾0.1~0.5份、组合促进剂0.7~2.0份加入到100份的水中经加热溶 解再冷却制得，所述组合促进剂是葡萄糖和乳糖中的一种或两种的组合，所述选择性添加 剂按重量份数计为〇. 001~〇. 003份。9. 根据权利要求8所述的增菌培养方法，其特征在于，所述选择性添加剂在所述致病菌 接种至所述母液培养3-4h后添加至所述母液中。10. 根据权利要求8所述的增菌培养方法，其特征在于，所述选择性添加剂是萘啶酮酸 钠和吖啶黄素中的一种或两种的组合。
【文档编号】C12N1/20GK106047781SQ201610705290
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月22日
【发明人】张红光, 刘菲, 彭丽萍, 于世强, 谢长江, 黄广平
【申请人】四川华汉三创生物科技有限公司