一种适用于高密度细胞培养体系的免疫细胞的无血清培养基的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种适用于高密度细胞培养体系的免疫细胞的无血清培养基，其包括基础培养基和添加组分，其中，所述基础培养基为RPMI 1640；所述添加组分及其浓度如下：人白蛋白，12?16g/L；转铁蛋白，20?25mg/L；人重组胰岛素，24?30mg/L；L?谷氨酰胺，8?10g/L；HEPES，5?7g/L；以及白介素?2，3×105?8×105IU/L。与现有技术相比，本发明的免疫细胞无血清培养基采用RPMI 1640作为基础培养基以及特定的添加组分的组合，能够使得免疫细胞快速、大量的增殖，且细胞存活率更高，特别适合免疫细胞的高密度细胞培养体系。
【专利说明】
-种适用于高密度细胞培养体系的免疫细胞的无血清培养基
技术领域
[0001] 本发明设及一种适用于高密度细胞培养体系的免疫细胞的无血清培养基，属于细 胞培养技术领域。
【背景技术】
[0002] 细胞免疫治疗是采集人体自身免疫细胞，经过体外培养，使其数量成千倍增多，祀 向性杀伤功能增强，然后再回输到人体来杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细 胞，打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫能力，兼顾治疗和保健的双重功效，例如常见的 细胞免疫治疗有细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)疗法、树突状细胞(DC)疗法、DC+CIK细胞疗 法、自然杀伤细胞(NK)疗法、DC-T细胞疗法等。
[0003] 上述细胞免疫治疗中比较重要的一个环节是"免疫细胞的体外培养"，而运个环节 中最重要的是用于免疫细胞培养的无血清培养基。虽然血清是动物细胞培养中最基本的添 加物，尤其是在原代培养或者细胞生长状况不良时，常常会先使用有血清的培养液进行培 养，待细胞生长旺盛W后，再换成无血清培养液;但由于动物血清中含有动物成分，且成分 复杂，应用与临床细胞治疗体系中，可能会导致一些潜在的风险，因此，无血清培养基被广 泛的应用于培养哺乳动物W制备单克隆抗体，病毒抗原和重组蛋白等。
[0004] 无血清培养基是指不需要添加血清就可W维持细胞在体外较长时间生长繁殖的 合成培养基，可W应用于培养免疫细胞，例如淋己细胞（例如，T淋己细胞、B细胞、NK细胞 等）、树突状细胞(也称DC细胞）、单核/巨隧细胞等。
[0005] 关于细胞培养体系，现有技术中除了常规的培养板、培养皿、培养瓶等二维的细胞 培养体系，现在已研发出=维培养体系，例如目前市售的高密度细胞培养桶，是一种既可W 适用于贴壁细胞，又可W适用于悬浮细胞的=维培养体系，可W快速地培养大量细胞，且可 W进行为期半年W上的长期细胞培养，不需要经常更换耗材，与传统的培养板、培养皿和培 养瓶相比，更方便、成本更低，因此受到本领域研发人员的广泛关注。
[0006] 然而，现有技术中的无血清培养基大多适用于中等规模的细胞培养体系，一般来 说无法适用于大规模的、高密度的细胞培养;另一方面，现有的无血清培养基仅适用于培养 板、培养皿、培养瓶等二维的细胞培养体系，无法适用于高密度细胞培养桶运样的=维培养 体系。
[0007] 现在亟待开发专用于高密度细胞培养体系的免疫细胞的无血清培养基。
【发明内容】
[000引鉴于相关技术的上述问题和/或其他问题，本发明一方面提供了一种适用于高密 度细胞培养体系的免疫细胞的无血清培养基，其包括基础培养基和添加组分，其中，所述基 础培养基为RPMI 1640 ;所述添加组分及其浓度如下：人白蛋白，12-16g/l;转铁蛋白，20- 25mg/l;人重组膜岛素，24-30mg/L;k谷氨酷胺，8-10g/l;肥?65，5-7g/L; W及白介素-2，3 X 105-8X 105IU/1;各添加组分的浓度W所述无血清培养基的总体积为基准。
[0009] 优选的，W所述无血清培养基的总体积为基准，所述RMPI 1640培养基的干粉量为 14.8-19.8g/Lo
[0010] 优选的，W所述无血清培养基的总体积为基准，所述RMPI 1640培养基的干粉量为 18g/L，所述人白蛋白的浓度为13g/L，所述转铁蛋白的浓度为22mg/L，所述人重组膜岛素的 浓度为27mg/L，W及所述k谷氨酷胺的浓度为9g/L。
[0011] 优选的，所述肥PES的浓度为6g/L。
[001^ 优选的，所述白介素-2的浓度为5X 105iU/L。
[0013] 优选的，所述添加组分还包括庆大霉素和链霉素，所述庆大霉素的浓度为IX 105- 4X105IU/L，所述链霉素的浓度为1 X 105-4X 105IU/L。
[0014] 优选的，所述添加组分还包括酪红钢，所述酪红钢的浓度为5-7mg/l;所述无血清 培养基的抑值为7.2~7.6。
[0015] 本发明另一方面提供了上述的无血清培养基在高密度细胞培养体系中的应用。
[0016] 优选的，所述高密度细胞培养体系为高密度细胞培养桶。
[0017] 优选的，所述免疫细胞为CIK细胞。
[001引本发明的适用于高密度细胞培养体系的免疫细胞的无血清培养基，采用RPMI 1640作为基础培养基W及特定的添加组分的组合，尤其是人白蛋白、转铁蛋白、人重组膜岛 素和心谷氨酷胺，四者同时满足特定的浓度范围时，能够使得免疫细胞快速、大量的增殖， 且细胞存活率更高，特别适合免疫细胞的高密度细胞培养体系。
【具体实施方式】
[0019] W下通过实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于运些具体实施方 式。
[0020] 在本发明的一个具体实施方案中，一种适用于高密度细胞培养体系的免疫细胞的 无血清培养基，其包括基础培养基和添加组分，其中，所述基础培养基为RPMI 1640;所述添 加组分及其浓度如下：人白蛋白，12-16g/l;转铁蛋白，20-25mg/l;人重组膜岛素，24-30mg/ 谷氨酷胺，8-10g/l;肥阳S，5-7g/L; W及白介素-2,3X 105-8X 105IU/L。
[0021] 本发明的发明人经过大量的研究试验发现，当免疫细胞的无血清培养基采用RPMI 1640作为基础培养基W及上述特定的添加组分的组合，尤其是人白蛋白、转铁蛋白、人重组 膜岛素和心谷氨酷胺，四者同时满足上述的浓度范围时，能够使得免疫细胞快速、大量的增 殖，且细胞存活率更高，特别适合免疫细胞的高密度细胞培养体系。
[0022] 在本发明的一个优选实施方案中，W所述无血清培养基的总体积为基准，所述 RMPI 1640培养基的干粉量为14.8-19.8g/L。
[0023] 在本发明的一个优选实施方案中，W所述无血清培养基的总体积为基准，所述 RMPI 1640培养基的干粉量为18g/L，人白蛋白的浓度为13g/L，转铁蛋白的浓度为22mg/L， 人重组膜岛素的浓度为27111旨/1，^及心谷氨酷胺的浓度为9g/L。当本发明的免疫细胞的无 血清培养基中，人白蛋白、转铁蛋白、人重组膜岛素和k谷氨酷胺同时采用上述特定的浓度 时，特别适合免疫细胞的高密度细胞培养体系，尤其是诸如高密度细胞培养桶之类的=维 培养体系，具有较好的增殖效果和细胞存活率。
[0024] 在本发明的一个优选实施方案中，无血清培养基中还可W添加抗生素，添加组分 还包括庆大霉素和链霉素，庆大霉素的浓度为1 X 105-4X 105IU/L，链霉素的浓度为1 X lO5- 4X105IU/L。运两种抗生素组合及其特定的浓度，特别适合免疫细胞的高密度细胞培养体 系，抗菌效果优异，细胞存活率高。
[0025] 在本发明的另一个优选实施方案中，所述添加组分还包括酪红钢，所述酪红钢的 浓度为5-7mg/L。酪红钢可W作为培养基中的酸碱指示剂，当采用5-7mg/L的浓度时，更优选 6mg/L的浓度时，对于免疫细胞的高密度细胞培养体系来说，酸碱指示非常灵敏。
[0026] 在本发明的再一个优选实施方案中，将该无血清培养基的pH值控制在7.2~7.6。
[0027] 在本发明的一个优选实施方案中，本发明的无血清培养基是专用于高密度细胞培 养桶的免疫细胞无血清培养基。
[0028] 在本分吗的一个优选实施方案中，本发明的无血清培养基是专用于CIK细胞的高 密度细胞培养体系的无血清培养基。
[0029] 实施例1
[0030] 实施例1的适用于高密度细胞培养体系的免疫细胞的无血清培养基的配制过程如 下：
[0031] 步骤1):在无菌条件下将合成的RPMI1640干粉在电子天平上称取180g后置于消毒 容器内，力的L纯化水稀释后揽拌均匀获得基础培养基；
[00创步骤2):将添加组分：130g人白蛋白、220mg转铁蛋白、270mg人重组膜岛素、90g k 谷氨酷胺、60g皿PES、2g庆大霉素(相当于2X105IU/L)和2g链霉素(相当于2X105IU/L)、5 X 106IU白介素-2 W及60mg酪红钢盐依次加入步骤1)获得的基础培养基中，充分混匀；
[0033] 步骤3):过滤灭菌，再调节pH值至7.4±0.2，最后加入纯化水将提及调节至lOL
[0034] 步骤4):培养基配制完成后，过滤灭菌，分装、封口，最后冷藏(-20°C环境)备用。 [003引实施例2
[0036] 实施例2的适用于高密度细胞培养体系的免疫细胞的无血清培养基的配制过程如 下：
[0037] 步骤1):在无菌条件下将合成的RPMI1640干粉在电子天平上称取180g后置于消毒 容器内，力的L纯化水稀释后揽拌均匀获得基础培养基；
[0038] 步骤2):将添加组分：126g人白蛋白、200mg转铁蛋白、260mg人重组膜岛素、88g k 谷氨酷胺、65g皿PES、2.2g庆大霉素（相当于2.2X105IU/L)和2.2g链霉素（相当于2.2X 105IU/1)、4X106IU白介素-2W及65mg酪红钢盐依次加入步骤1)获得的基础培养基中，充分 混匀；
[0039] 步骤3):过滤灭菌，再调节pH值至7.4±0.2，最后加入纯化水将提及调节至lOL
[0040] 步骤4):培养基配制完成后，过滤灭菌，分装、封口，最后冷藏(-20°C环境)备用。 [0041 ] 应用例1和应用例2
[0042] 人外周血单个核细胞分离
[0043] 人工采集外周血50-100ml，入两个50ml离屯、管中。首先在2000巧m转速下离屯、8分 钟，留下血细胞沉淀。用人淋己细胞分离液分离单个核细胞，按体积比1:1用生理盐水悬浮 血细胞。20(K)rpm转速下离屯、20分钟。离屯、好的样品从上至下依次为：生理盐水和少量血浆 层;单个核细胞层(核细胞层为少量白色层）、淋己分离液层W及粒细胞红细胞层。将单个核 细胞层吸出转移到1个50ml离屯、管中。
[0044] 向收集单个核细胞的离屯、管中添加生理盐水至45ml，旋紧盖子颠倒混匀，进行3次 梯度离屯、洗涂(依次为：180化pm转速离屯、8分钟、150化pm转速离屯、8分钟、120化pm转速离屯、 8分钟），离屯、溫度为20°C，最后收集细胞沉淀，获得CIK(切tokine-Induced Ki 1 ler，细胞因 子诱导的杀伤细胞)细胞，加入本发明实施例1的无血清培养基使得细胞浓度调整至1.2X 106 个/ml。
[0045] 应用例1:采用市售的FiberCell品牌C2025型号的高密度细胞培养桶（参见 門berCell细胞培养系统产品销售网页），W及本发明实施例1获得的无血清培养基进行CIK 细胞的培养。
[0046] 将5mlCIK细胞浓度为1.2 X 106个/ml的培养基用注射器载入上述的高密度细胞培 养桶中，再将25ml实施例1获得的无血清培养基加入到50ml储液瓶中（CIK细胞的接种密度 为2 X 105个/ml);具体地，储液瓶中的培养基通过硅胶管与细胞培养桶连接，在蠕动累的作 用下，持续循环流动，培养基通过细胞培养桶的中空纤维进行交换，给细胞培养桶内的细胞 不断的提供营养物质;将整个高密度细胞培养桶放入5%C02,37°C的培养箱中培养。
[0047] 应用例2:具体过程与应用例1相同，不同在于采用实施例2获得的无血清培养基进 行CIK细胞的培养。
[004引效果数据
[00例对比例1:采用市售的FiberCell品牌C2025型号的高密度细胞培养桶（参见 門berCell细胞培养系统产品销售网页），W及市售的友康品牌(NC0101)常规RPMI1640免疫 细胞无血清培养基，培养过程与应用例1相同，具体不再寶述。
[0050] 对比例A:采用市售的Corning品牌T75型号的细胞培养瓶，W及市售的友康品牌 (NC0101)常规RPMI1640免疫细胞无血清培养基;具体的，在T75培养瓶中加入10ml常规免疫 细胞无血清培养基，用移液器加入2mlCIK细胞浓度为1.2 X 106个/ml的常规无血清培养基 (CIK细胞的接种密度为2 X 105个/ml)进行悬浮培养，将培养瓶放入5 % C〇2，37 °C的培养箱中 培养14天，观察储液瓶中培养基颜色，当培养基颜色变黄时，需要更换培养基（一般在第5 天、第10天更换培养基）。
[0051] 分别检测应用例1、应用例2、对比例1和对比例A的细胞增殖速率W及细胞存活率。
[0052] 检测细胞增殖速率
[0化3] 应用例1和应用例2, W及对比例1和对比例A，均在培养1、3、6、10、12和14天后，分 别取样培养液，进行细胞浓度的检测，检测结果参见下表1。
[0054]表 1
[0化5]
[0056]检测细胞存活率
[0057]培养14天后，收集各组的培养液，进行流式检测。检测结果如下：
[005引应用例1的细胞存活率:96.5% ;应用例2的细胞存活率:94.4% ;对比例1的细胞存 活率:89.9% ;对比例A的细胞存活率:92.3%。
[0059] 将上述的结果进行对比可W看出，一方面，对比例1的细胞增殖速率W及细胞存活 率(细胞培养效果)的结果稍劣于对比例A的结果，运说明：常规的RMPI1640免疫细胞无血清 培养基更适合于诸如细胞瓶之类的传统小规模培养体系，不适合高密度细胞培养体系；另 一方面，本发明应用例1的细胞增殖速率和细胞存活率远高于对比例1的，运说明：本发明实 施例的免疫细胞无血清细胞培养基相比常规的RMPI1640免疫细胞培养基更适合于高密度 细胞培养体系。
[0060] 应当理解，虽然本说明书按照实施方式加 W描述，但并非每个实施方式仅包含一 个独立的技术方案，说明书的运种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说 明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可W经适当组合，形成本领域技术人员可 W理解的其他实施方式。
[0061] 上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说 明，它们并非用W限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式 或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种适用于高密度细胞培养体系的免疫细胞的无血清培养基，其包括基础培养基和 添加组分，其中， 所述基础培养基为RPMI 1640; 所述添加组分及其浓度如下： 人白蛋白，12-16g/L; 转铁蛋白，20-25mg/L; 人重组膜岛素，24_30mg/L; L-谷氨酰胺，8-10g/L; HEPES，5-7g/L;以及 白介素-2，3 X 105-8 X 105IU/L; 各添加组分的浓度以所述无血清培养基的总体积为基准。2. 如权利要求1所述的无血清培养基，其特征在于： 以所述无血清培养基的总体积为基准，所述RMPI 1640培养基的干粉量为14.8-19.8g/ L〇3. 如权利要求2所述的无血清培养基，其特征在于： 以所述无血清培养基的总体积为基准，所述RMPI 1640培养基的干粉量为18g/L，所述 人白蛋白的浓度为13g/L，所述转铁蛋白的浓度为22mg/L，所述人重组胰岛素的浓度为 27mg/L，以及所述L-谷氨酰胺的浓度为9g/L。4. 如权利要求2所述的无血清培养基，其特征在于： 所述HEPES的浓度为6g/L。5. 如权利要求2所述的无血清培养基，其特征在于： 所述白介素-2的浓度为5X105IU/L。6. 如权利要求1至5中任意一项所述的无血清培养基，其特征在于： 所述添加组分还包括庆大霉素和链霉素，所述庆大霉素的浓度为1 X 1〇5_4 X 105IU/L， 所述链霉素的浓度为1 X 1〇5-4 X 105IU/L。7. 如权利要求6所述的无血清培养基，其特征在于： 所述添加组分还包括酚红钠，所述酚红钠的浓度为5_7mg/L; 所述无血清培养基的pH值为7.2~7.6。8. 如权利要求1至7中任意一项所述的无血清培养基在免疫细胞的高密度细胞培养体 系中的应用。9. 如权利要求8所述应用，其特征在于：所述高密度细胞培养体系为高密度细胞培养 桶。10. 如权利要求8所述应用，其特征在于:所述免疫细胞为CIK细胞。
【文档编号】C12N5/078GK106047807SQ201610693939
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月19日
【发明人】颜学恒, 周艳
【申请人】上海逍鹏生物科技有限公司