癌胚抗原特异性tcr基因修饰的t细胞及其抑癌用图
【专利摘要】一种癌胚抗原特异性TCR基因修饰的T细胞及其抑癌用途，包括转录因子T?bet、Eomes及CEA?TCR的慢病毒载体。本发明的癌胚抗原特异性TCR基因修饰的T细胞及其抑癌用途通过蹄选和克隆肿瘤特异性TCR基因,随后以之转染T细胞赋予其抗原特异性,从而获得基因工程化抗原特异性T细胞,最终将TCR基因转染T细胞回输患者体内,重建针对抗原阳性肿瘤的T细胞免疫反应。
【专利说明】
癌胚抗原特异性TCR基因修饰的T细胞及其抑癌用途
技术领域
[0001]本发明涉及基因修饰细胞及肿瘤治疗技术领域，尤其是一种癌胚抗原特异性TCR基因修饰的T细胞及其抑癌用途。
【背景技术】
[0002]过继细胞治疗(adoptive cell therapy，ACT)是生物治疗技术的一种，对自体免疫细胞(主要是T细胞)进行体外扩增，然后将其回输给肿瘤患者以达到治疗目的的方法，被认为是继手术、放、化疗后的第4种治疗方式，在临床治疗中受到广泛应用。过继细胞治疗广泛应用的主要是:淋巴因子活化的杀伤细胞(lymphokine activated“ller cell ,LAK)，与几一 2联合治疗晚期恶性肿瘤取得了一定疗效:肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltratinglymph0CyteS，TIL)，临床试验中治疗转移性黑色素瘤取得了较好的效果:细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cell，CIK)，目前国内开展较多的临床试验，对肝癌、肺癌等肿瘤取得了显著的效果。但是目前上述三种治疗方法均需活化T细胞，T细胞活化需要两种活化信号，即T细胞表面的TCR-CD3与MHC-1分子结合为活化的第一信号，决定“田胞对肿瘤细胞的杀伤活性”田胞表面的共刺激分子与相应配体结合为活化的第二信号，决定T细胞增殖。但肿瘤细胞、肿瘤微环境可下调MHC、配体分子，从而抑制T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。因此需要可对其进行基因改造。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的技术问题是:为了解决上述【背景技术】中存在的问题，提供一种改进的癌胚抗原特异性TCR基因修饰的T细胞及其抑癌用途，解决肿瘤细胞、肿瘤微环境可下调MHC、配体分子，从而抑制T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性的问题。
[0004]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:一种癌胚抗原特异性TCR基因修饰的T细胞，包括转录因子T-bet、E0meS及CEA-TCR的慢病毒载体，所述的CEA-TCR包含TCRa链及TCRi3链，所述的CEA-TCR TCRa链序列为第一序列，所述的CEA-TCR TCRi3链序列为第二序列，所述的转录因子T-bet的序列为第三序列，所述的转录因子Eomes的序列为第四序列。
[0005]癌胚抗原特异性TCR基因修饰的T细胞的抑癌用途，所述以稳定表达萤火虫荧光蛋白Iuciferase的CEA阳性结直肠细胞系W480，HT29作为靶细胞，以稳定表达荧光素酶的CEA阴性的肝癌细胞系HuH7作为对照，效应细胞为慢病毒载体Iv-EFla-TCR-WPRE感染的T细胞，将靶细胞按照密度IXlO5个/ml接种96孔板中，每孔10ul，按照1:1效靶比将效应细胞加入靶细胞，置于5%C02，37°C培养箱培养24h，利用荧光素酶检测系统试剂盒(E4550)检测孔板中剩余细胞内Luciferase含量，计算杀伤效率，结果表明，表达CEA-TCR的T淋巴细胞对CEA阳性肿瘤细胞具有杀伤作用，而对CEA阴性细胞无杀伤作用；以稳定表达萤火虫荧光蛋白Iuciferase的CEA阳性结直肠细胞系W480，HT29作为靶细胞，分别用慢病毒载体Iv-EFla-TCR-WPRE和lv-EFla-TCR(CEA)-T-bet-Eomes-WPRE感染的T细胞制得效应细胞，将靶细胞按照密度2.5X 15个/ml，5X105个/ml，1X 15个/ml的密度接种96孔板中，每孔10ul，按照10:1,5:1,2.5:1效靶比将效应细胞加入靶细胞，置于5 % CO2，37 V培养箱培养6h;利用荧光素酶检测系统试剂盒(E4550)检测孔板中剩余细胞内Luciferase含量，计算杀伤效率，结果表明，表达转录因子T-bet和Eomes及CEA TCR的T淋巴细胞较未表达转录因子T_bet和Eomes及CEA TCR的T淋巴细胞对CEA阳性肿瘤细胞具有更强杀伤作用。
[0006]本发明的有益效果是，本发明的癌胚抗原特异性TCR基因修饰的T细胞及其抑癌用途通过蹄选和克隆肿瘤特异性TCR基因，随后以之转染T细胞赋予其抗原特异性，从而获得基因工程化抗原特异性T细胞，最终将TCR基因转染T细胞回输患者体内，重建针对抗原阳性肿瘤的T细胞免疫反应。
【附图说明】
[0007]下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
[0008]图1是本发明中质粒Iv-EFIa-TCR(CEA) -WPRE设计示意图。
[0009]图2是本发明中质粒lv-EFla-TCR(CEA)-T-bet-Emoes-WPRE设计示意图。
[0010]图3是本发明中慢病毒载体Iv-EFla-TCR(CEA)-WPRE和Iv-EFla-TCR(CEA)-T-bet-Eomes-WPRE感染的T细胞制得效应细胞对靶细胞SW480的杀伤效果示意图。
[0011 ]图4是本发明中慢病毒载体IV-EFla-TCR(CEA)-WPRE和IV-EFla-TCR(CEA)-T-bet-Eomes-WPRE感染的T细胞制得效应细胞对靶细胞HT29的杀伤效果示意图。
【具体实施方式】
[0012]现在结合附图对本发明作进一步详细的说明。这些附图均为简化的示意图，仅以示意方式说明本发明的基本结构，因此其仅显示与本发明有关的构成。
[0013]图1、图2、图3和图4所示的癌胚抗原特异性TCR基因修饰的T细胞，包括转录因子T-bet、Eomes及CEA-TCR的慢病毒载体，所述的CEA-TCR包含TCRa链及TCRP链，所述的CEA-TCRTCRa链序列为第一序列，所述的CEA-TCR TCRi3链序列为第二序列，所述的转录因子T_bet的序列为第三序列，所述的转录因子Eomes的序列为第四序列。
[0014]第一序列:
[0015]
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[0016]第二序列:
[0017]
ccatcctgccctgaccctgccatgggcaccaggctcctcttctgggtggccttctgtctcctgggggcagatcacacaggagctggagtctcccagtcccccagtaacaaggtcacagagaagggaaaggatgtagagctcaggtgtgatccaatttcaggtcatactgccctttactggtaccgacagagcctggggcagggcctggagtttttaatttacttccaaggcaacagtgcaccagacaaatcagggctgcccagtgatcgcttctctgcagagaggactgggggatccgtctccactctgaccctacacgcggagtcggctgctccctCCCAGACATCTGTGTACTTCTGTGCCAGCAGTACCCCTCTAGTGGACACCGGGGAGCTGTTTTTTGGAGAAGGCTCTAGGCTGACCGTACTGGAGGACCtgaaaaacgtgttcccacccgaggtcgctgtgtttgagccatcagaagcagagatctcccacacccaaaaggccacactggtatgcctggccacaggcttctaccccgaccacgtggagctgagctggtgggtgaatgggaaggaggtgcacagtggggtcagcacagacccgcagcccctcaaggagcagcccgccctcaatgactccagatactgcctgagcagccgcctgagggtctcggccaccttctggcagaacccccgcaaccacttccgctgtcaagtccagttctacgggctctcggagaatgacgagtggacccaggatagggccaaacctgtcacccagatcgtcagcgccgaggcctggggtagagcagactgtggcttcacctccgagtcttaccagcaaggggtcctgtctgccaccatcctctatgagatcttgctagggaaggccaccttgtatgccgtgctggtcagtgccctcgtgcatggccatggtcaagagaaaggattccagaggctagctccaaaaccatcccaggtcattcttcatcctcacccaggattctcctgtacctgctcccaatctgtgttcctaaaagtgattctcactctgcttcatctcctacttacatgaatacttctctcttttttctgtttccctgaagattgagctcccaacccccaagtacgaaataggctaaaccaataaaaaaatggtgtgtt；
[0018]第三序列3:
[0019]
atgggcatcgtggagccgggttgcggagacatgctgacgggcaccgagccgatgccggggagcgacgagggccgggcgcctggcgccgacccgcagcaccgctacttctacccggagccgggcgcgcaggacgcggacgagcgtcgcgggggcggcagcctggggtctccctacccggggggcgccttggtgcccgccccgccgagccgcttccttggagcctacgcctacccgccgcgaccccaggcggccggcttccccggcgcgggcgagtccttcccgccgcccgcggacgccgagggctaccagccgggcgagggctacgccgccccggacccgcgcgccgggctctacccggggccgcgtgaggactacgcgctacccgcgggactggaggtgtcggggaaactgagggtcgcgctcaacaaccacctgttgtggtccaagtttaatcagcaccagacagagatgatcatcaccaagcagggacggcggatgttcccattcctgtcatttactgtggccgggctggagcccaccagccactacaggatgtttgtggacgtggtcttggtggaccagcaccactggcggtaccagagcggcaagtgggtgcagtgtggaaaggccgagggcagcatgccaggaaaccgcctgtacgtccacccggactcccccaacacaggagcgcactggatgcgccaggaagtttcatttgggaaactaaagctcacaaacaacaagggggcgtccaacaatgtgacccagatgattgtgctccagtccctccataagtaccagccccggctgcatatcgttgaggtgaacgacggagagccagaggcagcctgcaacgcttccaacacgcatatctttactttccaagaaacccagttcattgccgtgactgcctaccagaatgccgagattactcagctgaaaattgataataacccctttgccaaaggattccgggagaactttgagtccatgtacacatctgttgacaccagcatcccctccccgcctggacccaactgtcaattccttgggggagatcactactctcctctcctacccaaccagtatcctgttcccagccgcttctaccccgaccttcctggccaggcgaaggatgtggttccccaggcttactggctgggggccccccgggaccacagctatgaggctgagtttcgagcagtcagcatgaagcctgcattcttgccctctgcccctgggcccaccatgtcctactaccgaggccaggaggtcctggcacctggagctggctggcctgtggcaccccagtaccctcccaagatgggcccggccagctggttccgccctatgcggactctgcccatggaacccggccctggaggctcagagggacggggaccagaggaccagggtccccccttggtgtggactgagattgcccccatccggccggaatccagtgattcaggactgggcgaaggagactctaagaggaggcgcgtgtccccctatccttccagtggtgacagctcctcccctgctggggccccttctccttttgataaggaagctgaaggacagttttataactattttcccaactga；
[0020]第四序列:
[0021]
atgcagttaggggagcagctcttggtgagctcagtgaacctgcctggcgcgcacttctacccgctggagagtgcgcgaggcggcagcggcgggagcgctggccacctccccagcgcggccccctctcctcagaagttggacttagacaaagcgtccaagaagttttccggcagtctctcctgcgaggcggtgagcggggagcccgcagccgccagcgcaggggcccccgcggccatgcttagtgacaccgacgccggggacgcatttgccagcgctgcggcagtggccaagccggggcccccggacggccgcaagggctccccctgcggggaggaggagctgccctccgccgctgcagccgccgccgccgccgccgccgcggctgcggccactgcgcgctactccatggacagcctgagctccgagcggtactacctccagtcccccggtcctcaggggteggagctggctgcgccctgctcactcttcccgtaccaggcggcggctggggcgccccacggacctgtgtacccggctcctaacggggcgcgctacccctacggctccatgctgccccccggcggcttccccgcggctgtgtgcccacccgggagggcgcagttcggcccaggagccggtgcgggcagtggcgcgggcggtagcagcggcgggggcggcggcccgggcacctatcagtacagccagggggctccgctctacgggccgtaccctggagccgcagcggcgggatcttgcggaggactggggggcctgggggttccaggttctggcttccgtgcccacgtctacctgtgcaaccggcctctgtggctcaaattccaccgccaccaaactgagatgatcattacgaaacagggcaggcgcatgtttcctttcttgagcttcaacataaacggactcaatcccactgcccactacaatgtgttcgtagaggtggtgctggcggaccccaaccactggcgcttccaggggggcaaatgggtgacctgtggcaaagccgacaataacatgcagggcaacaaaatgtatgttcacccagagtctcctaatactggttcccactggatgagacaggagatttcattcgggaaattaaaactcaccaataacaaaggcgcaaataacaacaacacccagatgatagtcttacaatccttacacaaataccaaccccgactgcatattgttgaagttacagaggatggcgtggaggacttgaatgagccctcaaagacccagacttttaccttctcagaaacgcaattcattgcagtgactgcctaccaaaacaccgatattactcaactaaagattgatcataacccctttgcaaaaggcttcagagacaactatgattccatgtacaccgcttcagaaaatgacaggttaactccatctcccacggattctcctagatcccatcagattgtccctggaggtcggtacggcgttcaatccttcttcccggagccctttgtcaacactttacctcaagcccgctattataatggcgagagaaccgtgccacagaccaacggcctcctttcaccccaacagagcgaagaggtggccaaccctccccagcggtggcttgtcacgcctgtccagcaacctgggaccaacaaactagacatcagttcctatgaatctgaatatacttctagcacattgctcccatatggcattaaatccttgccccttcagacatcccatgccctggggtattacccagacccaacctttcctgcaatggcagggtggggaggtcgaggttcttaccagaggaagatggcagctggactaccatggacctccagaacaagccccactgtgttctctgaagatcagctctccaaggagaaagtgaaagaggaaattggctcttcttggatagagacacccccttccatcaaatctctagattccaatgattcaggagtatacaccagtgcttgtaagcgaaggcggctgtctcctagcaactccagtaatgaaaattcaccctccataaagtgtgaggacattaatgctgaagagtatagtaaagacacctcaaaaggcatgggagggtattatgctttttacacaactcccta0
[0022]癌胚抗原特异性TCR基因修饰的T细胞的抑癌用途，所述以稳定表达萤火虫荧光蛋白Iuciferase的CEA阳性结直肠细胞系W480，HT29作为靶细胞，以稳定表达荧光素酶的CEA阴性的肝癌细胞系HuH7作为对照，效应细胞为慢病毒载体Iv-EFla-TCR-WPRE感染的T细胞，将靶细胞按照密度IXlO5个/ml接种96孔板中，每孔10ul，按照1:1效靶比将效应细胞加入靶细胞，置于5%C02，37°C培养箱培养24h，利用荧光素酶检测系统试剂盒(E4550)检测孔板中剩余细胞内Luciferase含量，计算杀伤效率，结果表明，表达CEA-TCR的T淋巴细胞对CEA阳性肿瘤细胞具有杀伤作用，而对CEA阴性细胞无杀伤作用；以稳定表达萤火虫荧光蛋白Iuciferase的CEA阳性结直肠细胞系W480，HT29作为靶细胞，分别用慢病毒载体Iv-EFla-TCR-WPRE和lv-EFla-TCR(CEA)-T-bet-Eomes-WPRE感染的T细胞制得效应细胞，将靶细胞按照密度2.5X 15个/ml，5X105个/ml，1X 15个/ml的密度接种96孔板中，每孔10ul，按照10:1,5:1,2.5:1效靶比将效应细胞加入靶细胞，置于5 % CO2，37 V培养箱培养6h;利用荧光素酶检测系统试剂盒(E4550)检测孔板中剩余细胞内Luciferase含量，计算杀伤效率，结果表明，表达转录因子T-bet和Eomes及CEA TCR的T淋巴细胞较未表达转录因子T_bet和Eomes及CEA TCR的T淋巴细胞对CEA阳性肿瘤细胞具有更强杀伤作用。
[0023]本发明的有益效果是，本发明的癌胚抗原特异性TCR基因修饰的T细胞及其抑癌用途通过蹄选和克隆肿瘤特异性TCR基因，随后以之转染T细胞赋予其抗原特异性，从而获得基因工程化抗原特异性T细胞，最终将TCR基因转染T细胞回输患者体内，重建针对抗原阳性肿瘤的T细胞免疫反应。
[0024]随着TCR多样性及TCR识别抗原肽/MHC复合物机制等相关理论知识的不断丰富，结合分子生物学及基因工程技术的深入发展。肿瘤过继性细胞治疗逐渐明确了一条全新思路-TCR基因工程化T细胞(TCR gene engineered T cell)。即首先蹄选和克隆肿瘤特异性TCR基因，随后以之转染T细胞赋予其抗原特异性，从而获得基因工程化抗原特异性T细胞，最终将TCR基因转染T细胞回输患者体内，重建针对抗原阳性肿瘤的T细胞免疫反应。
[0025]癌胚抗原(careinoembryonic antigen，CEA)是一种糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族，相对分子质量为200kDa，最初由GO Id和Freedman报道，表达于上皮源性肿瘤中如结直肠癌，胃癌、肺癌、子宫内膜腺癌、卵巢癌，目前广泛应用于临床辅助诊断。
[0026]结肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，全世界每年大约新增一百万的结肠癌患者有五十万左右的结肠癌患者死亡，其发病率居恶性肿瘤第四位。自上世纪70年代以来，我国结肠癌发病率和死亡率有不断上升趋势。结肠癌的发生发展是因为一系列遗传性改变累积而成，包括癌基因、抑癌基因和DNA修复基因的改变。在散发性结肠癌中，这些基因的改变是必要的，主要可能是由一些外源性或者内源性的致癌物质引起的。相反，在一些肿瘤结合征比如家族性结直肠息肉结合征(FAP)和遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)中，这些基因的改变是遗传获得的。在家族性结直肠息肉综合症中，是由于APC基因的胚系突变造成腺瘤样息肉；而遗传非息肉病性结直肠癌则是由于DNA修复基因的突变造成遗传性改变加性累积从而增加癌症发生的风险。近年来出现了很多有可能用于结肠癌的标志物，这些标志物可以在血清、组织和粪便中检测到，从而对结肠癌的早期诊断和预后给予一定的指导作用[[4-G]。本综述系统地阐述了结肠癌的各种标志物以及其临床意义。
i0027] T-bet是由Szabo等人于2000年首先发现，属于T-box转录因子。鉴于该基因编码的蛋白上带有T-box DNA结合域，并且局限表达于T细胞，特别是Thl细胞，因此命名为T-bet。然而，随后的研究证实转录因子T-bet除在T细胞上表达外，还表达于NK细胞。小鼠动物模型实验显示，T-bet敲基因型⑶4+T细胞上IFN-γ的表达显著降低，并且无法分化成为Thl细胞。进一步研究发现T-bet敲基因NK细胞在IFN- γ表达和细胞毒性作用方面也同样具有缺陷。此外，敲除T-bet基因B细胞表达的IgG 2a显著减少，T-bet基因缺陷的小鼠也不会产生自身免疫型糖尿病。随后又有更多的研究发现并报道了T-bet在调控免疫应答及自身免疫病方面所发挥的重要作用，提示T-bet具有广泛的免疫调控作用。
[0028]Eomes是由Kimura等人于1999年首先发现并报道的，其基因可表达于活化后的⑶8+T细胞以及CD300a+CD4+T细胞，活化后的NK细胞。Pearce等人发现，Eomes可能对T-bet功能发挥起协同作用，并且在细胞免疫应答中发挥了关键性的调控作用。该转录因子还参与调控CD8+T细胞向效应T细胞和记忆T细胞分化。并且有报道显示Eomes在过继性免疫治疗肿瘤的过程中也发挥着相当重要的作用。
[0029]CD8+T细胞在抗病毒以及抗肿瘤免疫应答过程中发挥了关键性的作用，而T-bet和Eomes可以共同调控了细胞毒效应T细胞上革El基因的转录。过表达T_bet或者Eomes可以有效诱导⑶8+T细胞上IFN-γ，穿孔素和颗粒酶B的表达。相反，缺失T-bet或者Eomes的T细胞则下调IFN-γ，穿孔素和颗粒酶B的表达。同时敲除T-bet和Eomes基因，会导致小鼠缺乏⑶8+Τ细胞，并且与细胞毒T细胞相关的基因表达也存在缺陷。此外，IL-15受体⑶122的表达也依赖于T-bet和Eomes。以上研究结果提示我们T-bet和Eomes在调控细胞毒T细胞上的基因转录及调控由IL-15介导的T细胞稳态平衡方面发挥了协同作用，两者具有代偿性。此外，T-bet 的表达水平能决定 CD8+T细胞向 SLECs (short-lived effector cel Is)或MPECs (memoryprecursor effector cells)分化。在炎症环境中，T_bet高表达，可促进⑶8+T细胞最终分化为KLRGhi IL-7Rlci的SLECs细胞。而T-bet低表达则促进可长期存活的CD8+记忆T细胞的产生。有证据表明IL-12可以增强初始⑶8+T细胞中mTOR激酶的活性，而维持T-bet的表达及CD8+效应T细胞的产生依赖于mTOR激酶。rapamycin处理CD8+T细胞可以抑制mTOR激酶的活性，从而阻断T-bet的表达，促进Eomes的表达。⑶8+T细胞中Eomes表达水平升高可以促进记忆T细胞的产生。因此，通过控制mTOR激酶的活性可以调节T-bet和Eomes这两个转录因子之间的平衡，从而决定CD8+T细胞成为效应细胞还是记忆细胞。
[0030]实验方法及结果
[0031]1、构建表达CEA-TCR的慢病毒载体;构建表达转录因子T-bet和Eomes及CEA TCR的慢病毒载体；
[0032]2、慢病毒的包装
[0033]本实施例包装慢病毒采用磷酸钙法，具体步骤如下:用含10%(Wt)FBS的DMEM培养基培养293T细胞，至较佳状态;然后将293T细胞以IX 105/cm2的密度传至I个75cm2的培养瓶中培养22h，保证转染时细胞汇合度为70-80 % ;再用预热的含2 % (wt )FBS的DMEM培养基换液，培养2h，备用；将680ul ddH20，20ug慢病毒载体，20ug pMDLg/pRRE质粒、20ug pRSV-Rev和1ug pMD2.G质粒、10ul 2.5mM CaC12加入15ml离心管中，混合均匀，混匀后用移液器向混合液中逐滴加入2XHBS，同时用1ml移液器吹打混匀，混匀后室温静置15min，然后将混合液逐滴加入上述制备的细胞中，继续培养12-16h后，用含10%FBS(wt)的DMEM培养基更换培液，继续培养48h，72h后分别收集细胞上清并用于病毒纯化。
[0034]3、慢病毒的纯化
[0035]将病毒上清收集在50ml离心管中，3000r/min离心1min;然后用0.45um过滤膜过滤，滤液在3000r/min离心1min至新的50ml离心管;然后根据病毒上清量，分别加入质量分数为50 %的PEG6000和4M NaCl，再用医用盐水定容至35mL，使PEG6000终浓度为8.5%, NaCl终浓度为0.3M，定溶后于4°C冰箱静置90min，30min/次颠倒混匀;然后于4°C，5000r/min条件下离心30min，弃尽上清，用200ul含10 %FBS的DMEM培养基重悬病毒，1.5ml EP管分装，每管40ul，-80°C保存备用。
[0036]4、慢病毒感染T细胞及感染后细胞的扩增培养
[0037]I)人外周血单核细胞的分离
[0038]用加有抗凝剂的采血管采集外周血约60ml，分装于50ml离心管各30ml，加入7.5ml轻乙基淀粉稀释;室温自然沉降约30min，收集上层血楽；，将收集的上层血楽于1400rpm/min条件下离心15min ;然后用生理盐水重悬沉淀，约1:1加到淋巴细胞分离液上，梯度离心，400g/min，离心机降速DEC为5，离心15min;离心后，离心管由上至下分为:第一层:血楽层；第二层:环状乳白色淋巴细胞层;第三层:透明分离液层;第四层:红细胞层;取第二层白色淋巴细胞层，并用生理盐水洗涤2次，第一次400g/min，离心1min，第二次1100rpm/min，离心5min，生理盐水重悬细胞，加入含有10 %FBS的RPMI 1640完全培养基培养，得人外周血单核细胞。
[0039]5、慢病毒载体感染T淋巴细胞
[0040]用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基培养新制备的单个核细胞PBMC，第I天加入抗⑶3单克隆抗体活化;前3天进行慢病毒感染;加入20M0I的慢病毒载体I v-EFla-TCR(CEA)-WPRE，未感染的T淋巴细胞作为空白对照；24h后将培养基更换为含有500IU/ml重组人IL-2的RPMI 1640完全培养基，继续培养10-20天，然后观察T淋巴细胞生长情况。结果显示:细胞在感染Iv-EFla-TCR(CEA)-WPRE病毒后，能够形成典型的增殖克隆团，通过对细胞进行计数，细胞在19天的时间内增殖了近3000倍。
[0041]6、流式细胞术检测TCR(CEA)在T细胞中的表达
[0042]将培养至14天的已感染病毒的T细胞，300g/min，离心5min，弃尽上清以收集细胞；用含有I %胎牛血清的PBS溶液重悬细胞，并将细胞调整密度为IXlO6个/ml;将收集的细胞分装为6管，每管10ul，向每管细胞中加入20ul PE标记抗小鼠抗人⑶4单克隆抗体(BD公司PRA-T4克隆)，Percep标记小鼠抗人CD8单克隆抗体(BD公司SKl克隆)抗体、APC标记小鼠抗人CD56单克隆抗体(BD公司B159克隆)；2ul羊抗鼠Fab单克隆抗体(sigma公司)；4°C孵育30min，PBS溶液洗涤2次，上流式细胞仪进行检测，结果如图3所示。结果显示经过14天的培养，CEA-TCR-T细胞CD3阳性率为91.4% ,CD3CD4双阳性细胞比率为57.6%,CD3CD8双阳性细胞比率为38.4%。
[0043 ] 7、表达靶向CEA的嵌合抗原受体的T淋巴细胞抗肿瘤效果验证
[0044]以稳定表达萤火虫荧光蛋白Iuciferase的CEA阳性结直肠细胞系W480，HT29作为靶细胞，以稳定表达荧光素酶的CEA阴性的肝癌细胞系HuH7作为对照，效应细胞为慢病毒载体Iv-EFla-TCR(CEA)-WPRE感染的T细胞;将靶细胞按照密度IXlO5个/ml接种96孔板中，每孔10ul;按照1:1效靶比将效应细胞加入靶细胞，置于5%⑶2，37°C培养箱培养24h;利用荧光素酶检测系统试剂盒(E4550)检测孔板中剩余细胞内Luciferase含量，计算杀伤效率;结果如图3所示。结果表明，表达CEA-TCR的T淋巴细胞对CEA阳性肿瘤细胞具有杀伤作用，而对CEA阴性细胞无杀伤作用。
[0045]8、表达转录因子T-bet和Eomes及CEA TCR的T淋巴细胞抗肿瘤效果验证
[0046]以稳定表达萤火虫荧光蛋白Iuciferase的CEA阳性结直肠细胞系W480，HT29作为靶细胞，分别用慢病毒载体 Iv-EFla-TCR(CEA)-WPRE 和 lv-EFla-TCR(CEA)-T-bet-Eomes-WPRE感染的T细胞制得效应细胞;将靶细胞按照密度2.5X 15个/ml，5X105个/ml，1X 15个/ml的密度接种96孔板中，每孔10ul;按照10:1，5:1，2.5:1效靶比将效应细胞加入靶细胞，置于5%C02，37°C培养箱培养6h;利用荧光素酶检测系统试剂盒(E4550)检测孔板中剩余细胞内Lucif erase含量，计算杀伤效率;结果如图4所示。结果表明，表达转录因子T_bet和Eomes及CEA TCR的T淋巴细胞较未表达转录因子T_bet和Eomes及CEA TCR的T淋巴细胞对CEA阳性肿瘤细胞具有更强杀伤作用。
[0047]以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
【主权项】
1.一种癌胚抗原特异性TCR基因修饰的T细胞，包括转录因子T-bet、E0meS及CEA-TCR的慢病毒载体，其特征是:所述的CEA-TCR包含TCRa链及TCRMl，所述的CEA-TCRTCRa链序列为第一序列，所述的CEA-TCRTCRi3链序列为第二序列，所述的转录因子T-bet的序列为第三序列，所述的转录因子Eomes的序列为第四序列。2.癌胚抗原特异性TCR基因修饰的T细胞的抑癌用途，其特征是:所述以稳定表达萤火虫荧光蛋白Iuciferase的CEA阳性结直肠细胞系W480，HT29作为靶细胞，以稳定表达荧光素酶的CEA阴性的肝癌细胞系HuH7作为对照，效应细胞为慢病毒载体Iv-EFla-TCR-WPRE感染的T细胞，将靶细胞按照密度IXlO5个/ml接种96孔板中，每孔10ul，按照1:1效靶比将效应细胞加入靶细胞，置于5 % CO2,37 0C培养箱培养24h，利用荧光素酶检测系统试剂盒(E4550)检测孔板中剩余细胞内Lucif erase含量，计算杀伤效率，结果表明，表达CEA-TCR的T淋巴细胞对CEA阳性肿瘤细胞具有杀伤作用，而对CEA阴性细胞无杀伤作用；以稳定表达萤火虫荧光蛋白Iuciferase的CEA阳性结直肠细胞系W480，HT29作为靶细胞，分别用慢病毒载体Iv-EFla-TCR-WPRE 和 lv-EFla-TCR(CEA)-T-bet-Eomes-WPRE 感染的 T 细胞制得效应细胞，将靶细胞按照密度2.5X105个/ml，5X105个/ml，1XlO5个/ml的密度接种96孔板中，每孔10ul，按照10:1，5:1，2.5:1效靶比将效应细胞加入靶细胞，置于5%CO2 ,370C培养箱培养6h;利用荧光素酶检测系统试剂盒(E4550)检测孔板中剩余细胞内Luciferase含量，计算杀伤效率，结果表明，表达转录因子T-bet和Eomes及CEATCR的T淋巴细胞较未表达转录因子T-bet和Eomes及CEATCR的T淋巴细胞对CEA阳性肿瘤细胞具有更强杀伤作用。
【文档编号】A61P35/00GK106047818SQ201610639710
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月5日 公开号201610639710.8, CN 106047818 A, CN 106047818A, CN 201610639710, CN-A-106047818, CN106047818 A, CN106047818A, CN201610639710, CN201610639710.8
【发明人】雷菁, 唐小琴, 其他发明人请求不公开姓名
【申请人】武汉赛云博生物科技有限公司