一种CotA漆酶及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种CotA漆酶及其应用。该CotA漆酶的DNA序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所提供的CotA漆酶操作成熟简便，得到的酶活较高，所制备的CotA漆酶具有广泛的pH和温度催化范围，在碱性、高温条件，高盐和高浓度有机溶剂下具有较好的稳定性，比真菌漆酶适用性更强。在介体物质乙酰丁香酮的参与下，该CotA漆酶能对不同化学结构的合成染料有效脱色，在碱性条件下仍保持了较好的脱色效果，因此本发明提供的CotA漆酶在工业染料废水的处理上具有较好的应用前景。
【专利说明】
-种Cot A漆酶及其应用
技术领域
[0001 ]本发明属于应用微生物方面，设及一种细菌漆酶的制备，具体设及CotA漆酶及其 应用。
【背景技术】
[0002] 漆酶(苯二酪氧化酶，EC 1.10.3.2)是多铜氧化家族的一员，可催化氧化多种酪类 和非酪类的底物，如苯酪、氯酪、二苯甲烧、苯并比、间苯二胺等。由于漆酶催化氧化的底物 范围十分广泛，被应用在许多行业中，其中包括食品加工厂、造纸厂、纺织厂、涂料厂、有机 化学厂。
[0003] 漆酶是典型的多铜氧化酶，它参与（1)单体的交联，（2)聚合物的降解，（3)芳香族 化合物的开环。催化氧化非酪类化合物时，漆酶需要体系中存在介体，介体是一种小分子， 在漆酶和底物之间扮演着"电子传递中间体"的角色，运些小分子在漆酶的氧化作用下，转 化为稳定的自由基。它们作为氧化还原介体，在漆酶介体体系中能氧化其他不是漆酶底物 的化合物。在有介体的时候，漆酶的催化性能扩展至很难被漆酶单独氧化的非酪类化合物 (如多环芳控，多氯联苯，有机憐农药）。并且天然介体的使用展现出了环境和经济友好的应 用前景。运些都提高了漆酶在工业上的应用范围。
[0004] 漆酶主要分布在植物、真菌和细菌中。其中真菌漆酶比细菌漆酶具有更好的氧化 还原能力，也有许多应用，但是真菌漆酶只在低溫或者酸性条件下起作用，并且生长缓慢， 糖基化难控制等缺点限制了真菌漆酶的应用。相对于真菌漆酶而言细菌漆酶具有热稳定性 好，pH稳定，耐有机溶剂耐盐等特性，并且细菌体系比真菌更容易操作。造纸废水和染料废 水等污染物的pH基本呈碱性，并且含有一些有机溶剂、高浓度盐等，需要酶能在此恶劣环境 中仍保持活性，而细菌漆酶等运些特性刚好符合运些要求，因此细菌是一种具有工业应用 的潜力候选者。
[0005] CotA蛋白是芽抱杆菌属的具漆酶活性一种蛋白。但是CotA蛋白在野生菌中表达量 小且不易分离纯化得到。通过重组DNA技术实现CotA的异源表达W获得大量的酶制剂能有 效避免上述缺陷，实现CotA蛋白的大量工业生产。
[0006] 随着分子生物学的发展，许多漆酶基因已经被克隆和表达，研究漆酶基因表达调 控机制有助于阐明不同基因在发育进程中所起的作用。通常在大肠杆菌和酵母中表达细菌 漆酶，但是真菌表达生长周期慢，操作没有大肠杆菌方便，表达量也没有大肠杆菌系统高。 目前应用最广泛、技术最成熟的表达系统就是大肠表达系统，但是大肠杆菌表达系统容易 产生包涵体。
【发明内容】
[0007] 发明目的:针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种CotA漆酶，来源 于枯草芽抱杆菌(Baci 1 lus subti 1 iS) C化3。本发明的另一目的是提供一CotA漆酶的应用。 [000引技术方案:为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
[0009] CotA漆酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.l所示。
[0010] 编码所述CotA漆酶的基因，其DM序列如SEQ ID NO.2所示。
[0011] 表达所述CotA漆酶的质粒或工程菌。
[0012] 含有所述CotA漆酶的基因的载体。
[0013] 所述的CotA漆酶:在抑3-9发挥作用，在30°C时催化底物ABTS的最适抑值为5.0;在 20-100°C发挥功能，在抑7.0WABTS为底物时最适反应溫度为80°C;WABTS为底物时在体 积分数高达50%的有机溶剂中保持较高活性，分别为甲醇102% W上，乙醇88% W上，丙酬 112% W上，二甲基亚讽94% W上。
[0014] 所述的CotA漆酶在燃料脱色中的应用。
[0015] 所述的应用，所述染料包括活性蓝19,活性黑5,說蓝姻脂红，孔雀石绿。
[0016] 有益效果:与现有技术相比，本发明的CotA漆酶具有如下优点：
[0017] 1)可在抑值3-9.0范围内发挥作用，催化不同底物的最适抑值有所不同：WABTS为 底物时，在pH4.2时酶活最高。本发明的重组漆酶在碱性条件下有很好的稳定性，在抑9.0的 条件下3(TC保溫10小时活性损失不大，运一特点是绝大多数真菌漆酶所不具备的，由于造 纸工业很多采用碱法制浆，使造纸废水碱性较高，该CotA漆酶可W在碱性下稳定的发挥作 用。
[0018] 2)本发明的仿*4漆酶的酶促反应溫度范围较广，其最适溫度为80°(：，在20-80°(：间 可保持较高的活性，运说明废水溫度在波动范围较大时，漆酶仍能稳定工作。运种重组漆酶 在高溫下较好的稳定性在工业上具有很大的实际应用价值。在50°C和60°C时漆酶热稳定性 较好，50°C处理1 Oh后的漆酶酶活达到
[0019] 125.60%，而60。(：的漆酶仍有74.64%，80。(：重组酶的酶活在1化后还剩18.38%。
[0020] 3)本发明的CotA漆酶对金属离子具有一定的耐受性，除了 Cu2+w外，重组酶在所有 测试金属离子中相对稳定。Ca2+和r对漆酶没有明显的影响。Zn2+和Cu2+分别抑制了漆酶活 性61 %和14%。本发明的CotA漆酶对抑制剂的耐受性也比较好，111^的1^-。7316；[]16抑制了 73 %的酶活，ImM的SDS促进了漆酶的酶活，0.5mol/L的化C1对所述重组漆酶的活性有一定 的促进作用，在1111〇1/1的船(：1存在时可保持原始活性的77.84%。
[0021] 4)本发明的CotA漆酶在高浓度的有机溶剂存在下，仍可保持较高的活性。在体积 分数高达50 %的有机溶剂中可保持较高活性，分别为甲醇（102.75 % )，乙醇(88.85 % )，丙 酬（112.55 % )，二甲基亚讽(94.28 % )。有机溶剂的使用可提高某些化合物在水中的溶解 性，有利于漆酶催化降解难溶于水的有机污染物。通常情况下，使用有机溶剂会导致漆酶活 性的降低。本发明CotA漆酶对高浓度的有机溶剂表现出较好的耐受性，可在催化降解难溶 性有机污染物中发挥较大的作用。
[0022] 5)本发明CotA漆酶对不同化学结构的工业合成染料具有较好的脱色作用。在介体 乙酷下香酬的参与下，在抑6.2时对RB 19、RB 5、說蓝姻脂红、孔雀石绿化后的脱色率分别 为62.85 %、93.48 %、96.83 %和95.85 %，說红和结晶紫几乎完全脱色。在抑9.0时对RBBR、 活性黑KN-B、說红和结晶紫化后的脱色率分别为91.88%、92.79%、91.99%和95.18%，说 明该重组漆酶在碱性环境下对各种染料仍保持了较高的脱色能力。
[0023] 6)本发明所提供的重组漆酶操作成熟简便，得到的酶活较高，所制备的CotA漆酶 具有广泛的抑和溫度催化范围，在碱性、高溫条件，高盐和高浓度有机溶剂下具有较好的稳 定性，比真菌漆酶适用性更强。在介体物质乙酷下香酬的参与下，该CotA漆酶能对不同化学 结构的合成染料有效脱色，在碱性条件下仍保持了较好的脱色效果，因此本发明提供的 CotA漆酶在工业染料废水的处理上具有较好的应用前景。
【附图说明】
[0024] 图1是WABTS为底物时pH对枯草芽抱杆菌cjp3的CotA漆酶活性的影响结果图；
[0025] 图2是WABTS为底物时pH对CotA漆酶稳定性的影响结果图；
[0026] 图3是不同溫度对CotA漆酶活性的影响结果图；
[0027] 图4是CotA漆酶在50-80°C时活性的稳定性结果图；
[0028] 图5是金属离子对CotA漆酶活性的影响结果图；
[0029] 图6是抑6.2时CotA漆酶对RB 19、RB 5、說蓝姻脂红、孔雀石绿的脱色结果图；
[0030] 图7是PH9.0时CotA漆酶对RB 19、RB 5、說蓝姻脂红、孔雀石绿的脱色结果图。
【具体实施方式】
[0031] W下的实施方式是为了更好地理解本发明。W下实施例中所用的试验材料，如无 特殊说明，均为可购买到的生化试剂。其中限制性内切酶和其他工具酶都为化KaRa公司产 品。W下实施方式中所说的酶液，均是按照重组漆酶的制备方法制备出的CotA漆酶。酶活测 定方法是指用分光光度计检测漆酶与底物反应后吸光度，计算漆酶活性。所述的底物为2， 2-连氮-二(3-乙基苯并嚷挫-6-横酸KABTS)。酶的活性定义为每分钟氧化1皿〇1底物为产 物所需的酶量为一个酶活力单位。反应体系:ABTS:反应体系含有Immol/L ABTS，60化重组 漆酶，及醋酸-醋酸钢缓冲液(0.1mol/L，抑4.5)，总体积0.9mL，30°C反应2min内在420皿处 测定吸光值的变化。
[0032] 实施例1CotA漆酶基因的克隆和表达纯化
[0033] 1. CotA漆酶基因的克隆
[0034] 取枯草芽抱杆菌cjp3纯菌落（CICC编号24168)挑至5m化B液体培养基中，37°C， 200rpm，培养过夜。采用CTAB/化Cl法提取上述菌株的基因组DNA，并经1 %琼脂糖凝胶电泳 检测。
[003引采用基因组DNA为模板，W上游引物CotA-F:5' - ATAAGAATGCGGCCGCATGACACTTGAAAAATTTG-3'(含Not I酶切位点）和下游引物CotA-R:5' - CCGCTCGAGTTATTTATGGGGATCAGTT-3^含化0 I酶切位点）扩增菌株cjp3的CotA漆酶基因。
[0036] PCR体系：d地2〇 2化L，10X化St 押U Buffer 10化，10臟〇 1/L dNTP mixture化 L，PCR stimulate 10化，lOOmmo 1/L上、下游引物各化L，DNA模板化L，2.抓/L化St P化酶1 化。
[0037] 扩增程序为:98°C3min 预变性，95^3〇3,55^3〇3,72^2111111，30个循环，72。(：1〇111111 延伸。扩增产物经1 %琼脂糖凝胶电泳检测。
[0038] 用上海生工胶回收试剂盒参照说明书回收目的片段。回收的目的片段的纯度用 1%琼脂糖凝胶电泳检测。
[0039] 2.连接与转化
[0040] 1)将含有双酶切位点的CotA基因片段及表达载体祀T-28a( + )分别进行双酶切，然 后分别纯化。2)连接体系：目的片段化L，酶切后的质粒化L，dd此02化，10XT4Buffer化L， T4连接酶化L，总体积10化，16 °C连接反应化。3)将E. CO 1 i D册a感受态细胞在冰中融化。将 10化连接反应液加入到100化感受态细胞DH5a中，轻轻吸打混匀，冰浴30min，42 °C保溫 2min，冰浴5min。4)加入500化LB液体培养基，200rpm，37°C培养比。5)取适量上述培养液均 匀涂在18/4111口作-6曰1/1口16平板上，37°(：培养过夜。通过蓝白斑筛选白色的阳性转化子，做 菌落PCR。
[0041 ] 3.漆酶基因的测序及序列分析
[0042] 将菌落PCR的阳性克隆送往上海生物工程测序，测序结果见序列表SEQ ID NO. 1。 所表达的蛋白如SEQ ID NO.2所示。
[0043] 4.重组表达菌株诱导条件优化产漆酶:将测序成功的重组表达载体转入大肠杆菌 化21中。在大肠杆菌中诱导表达，在0.6mM IPTG和0.25mM CuS化，200巧m，25 °C条件下诱导 lOh，超声破碎得到粗酶液最后经Ni-NTAagarose亲和层析纯化得到纯酶。
[0044] 实施例2重组漆酶的性质
[0045] 1. pH对Co tA漆酶活性的影响
[0046] pH对漆酶活性的影响采用通过0.1M巧樣酸-憐酸盐缓冲液(pH 3.0-7.0),0.11 his-HCl缓冲液(pH7.0-9.0)测定。分别用ABTS在0.1M巧樣酸-憐酸盐缓冲液(pH 3.0-7.0) 中测漆酶酶活的最优pH。通过在pH 3.0，7.0，9.0中30°C培养若干小时后剩余酶活的测定来 确定P取4细菌漆酶稳定性的影响。结果如图1所示，表明本发明提供的CotA漆酶催化范围广 泛，在抑3-9的范围内均可催化底物反应。WABTS为底物时测得的最适抑为5，图2表明Co tA 漆酶在pH9.0的环境中具有较好稳定性，1化后仍可保持较高的活性。
[0047] 2.溫度对Co tA漆酶活性和稳定性的影响
[0048] 溫度对漆酶活性的影响在最适抑下在20-100°C范围内测定。漆酶的热稳定性测定 在抑6.2的巧樣酸-憐酸盐缓冲液中在50-8(rC放置0-10h后测定剩余活性。图3表明，重组 漆酶的最适反应溫度为60°C，从图4可看出，重组漆酶即使在80°C高溫下保溫lOh仍可保留 约18.38 %左右的活性。
[0049] 3.金属离子对Co tA漆酶活性的影响
[0050] 在反应体系中分别加入常见的金属离子，使其终浓度为0.5mmol/L，在30°C保溫 30min，W不加金属离子的反应体系为空白，然后按常规方法W下香醒连氮为底物测酶活 性。结果如图5所示，该CotA漆酶对金属离子具有一定的耐受性，除了 Cu2+W外，重组酶在所 有测试金属离子中相对稳定。Ca2+和r对漆酶没有明显的影响。Zn2+和Cu2+分别抑制了漆酶 活性61%和14%。本发明的〔〇14漆酶对抑制剂的耐受性也比较好，11111的心。731日;[]1日抑制了 73 %的酶活，ImM的SDS促进了漆酶的酶活，0.5mol/L的化C1对所述重组漆酶的活性有一定 的促进作用，在1111〇1/1的船(：1存在时可保持原始活性的77.84%。
[0051 ] 4.抑制剂对Co tA漆酶活性的影响
[0052]将CotA漆酶与不同体积分数的几种常见的蛋白抑制剂包括505、心半脫氨酸、二硫 苏糖醇(DTT)、抓TA、氯化钢溶液混合，空白不加抑制剂，WABTS为底物测酶活性。所有测量 均重复=次取平均值，结果见表1。
[0化3] 表1抑制剂对重组酶活性的影响
[0化4]
[0化5]
[0056] 5.有机溶剂对Co tA漆酶活性的影响
[0057] 将CotA漆酶与不同浓度的几种常见的有机溶剂包括甲醇、乙醇、丙酬、乙腊和二甲 基亚讽混合，空白不加有机溶剂，WABTS为底物测酶活性。所有测量均重复=次取平均值。 结果见表2,该CotA漆酶在高浓度的有机溶剂存在下，仍可保持较高的活性。在体积分数高 达50%的有机溶剂中可保持较高活性，分别为甲醇（102.75%)，乙醇（88.85%)，丙酬 (112.55 % )，二甲基亚讽(94.28 % )。有机溶剂的使用可提高某些化合物在水中的溶解性， 有利于漆酶催化降解难溶于水的有机污染物。通常情况下，使用有机溶剂会导致漆酶活性 的降低。本发明CotA漆酶对高浓度的有机溶剂表现出较好的耐受性，可在催化降解难溶性 有机污染物中发挥较大的作用。
[0化引表2有机溶剂对重组酶的影响
[0化9] 12345
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[0061 ]实施例3重组漆酶对合成染料的脱色 3 1.脱色实验的反应体系及脱色率的计算 4 实验反应体系为6mL，在体系中依次加入pH 6.2巧樣酸-憐酸盐缓冲液(0.1mol/ L)、染料（种类及终浓度见表3)、重组漆酶（终浓度为27U/L)和乙酷下香酬（终浓度为 0.1 mmol/L)。同时W不加入重组漆酶的反应体系为空白对照。定时取样，10000巧m，离屯、 2min后测各染料最大吸收波长(见表3)下的吸光值。所有测量均重复S次取平均值。之后计 算染料脱色率。染料的脱色率计算公式为(A0-AVA0X 100%，其中A0为初始染料吸光值，A 为定期取样测的吸光值。 5 表3染料类型、终浓度及最大吸收波长 「rww；1
L0066」结果表明，重組漆酶显示出较强的脱
色染料的能力。在介体乙醜下香剛的参与和 P册.2的条件下，经过化脱色后reactive black 5、說蓝姻脂红、孔雀石绿染料的脱色率均 在90%W上（图6)。
[0067] 2.碱性条件下染料的脱色实验
[0068] 由于细菌漆酶的优势在于碱性条件下具有比真菌漆酶更高的催化活性，为了进一 步考察细菌漆酶在碱性环境中对染料的脱色能力，选用PH9.0的条件研究地重组漆酶对四 种合成染料的脱色。结果如图7所示，经过化后，RB19、RB5、說蓝姻脂红、孔雀石绿的脱色率 分别为97.30 %、94.59 %、99.55%和98.93 %，运一结果高于P册.2下各种染料的脱色率，表 明该重组漆酶在碱性环境下对各种染料仍保持了较高的脱色能力，在处理不同pH值的染料 废水时具有较好的工业应用价值。
【主权项】
1. CotA漆酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。2. 编码权利要求1所述CotA漆酶的基因，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示。3. 表达权利要求1所述Co tA漆酶的质粒或工程菌。4. 含有权利要求2所述CotA漆酶的基因的载体。5. 根据权利要求1所述的CotA漆酶，其特征在于:在pH3-9发挥作用，在30°C时催化底物 ABTS的最适pH值为5.0;在20-100°C发挥功能，在pH 7.0以ABTS为底物时最适反应温度为80 °C ;以ABTS为底物时在体积分数高达50%的有机溶剂中保持较高活性，分别为甲醇102%以 上，乙醇88%以上，丙酮112%以上，二甲基亚砜94%以上。6. 权利要求1所述的CotA漆酶在燃料脱色中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于:所述染料包括活性蓝19,活性黑5,靛蓝胭 脂红，孔雀石绿。
【文档编号】C12N15/53GK106047827SQ201610593937
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月25日 公开号201610593937.3, CN 106047827 A, CN 106047827A, CN 201610593937, CN-A-106047827, CN106047827 A, CN106047827A, CN201610593937, CN201610593937.3
【发明人】乔维川, 褚靖萍, 夏昊, 谢震宇
【申请人】南京林业大学