切胶纯化同位素标记核酸探针的方法
【专利摘要】本发明公开了一种切胶纯化同位素标记核酸探针的方法。该方法包括如下步骤：制备与目标同位素标记核酸探针相对应的核酸片段；电泳分离该核酸片段；使用常规染色法定位该核酸片段在电泳胶上的位置；使用相同的条件，电泳分离目标同位素标记核酸探针；切割已预先明确位置上的胶块；回收所述胶块中的探针。采用本发明切胶纯化同位素标记核酸探针的方法，可以减少操作同位素的步骤，进而缩短操作同位素的时间。
【专利说明】
切胶纯化同位素标记核酸探针的方法
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，具体地说涉及一种切胶纯化同位素标记核酸探针的方法。
【背景技术】
[0002]核酸探针是带有标记物的已知序列的核酸片段。根据碱基互补配对原则，它可以和与其互补的或同源性很高的核酸序列杂交，形成双链，进而通过探针标记物的特性，反映被检测样品中特定序列的存在情况。每一个物种，包括各种病原菌，都具有独特的核酸序列，所以核酸探针在生物技术、疾病诊断等领域都用广泛的使用。
[0003]同位素标记核酸探针，因其标记物是同位素，具备灵敏度高、不改变核酸序列化学性质、可以检测Pg级目的片段的特性，而被广泛使用。为了提升单一性和纯度，在制备同位素标记核酸探针的过程中，有时需要对探针进行切胶纯化。
[0004]切胶纯化同位素标记核酸探针的一般流程如下:1、电泳分离目标同位素标记核酸探针;2、电泳结束后，用塑料薄膜包裹电泳胶;3、使用X光胶片曝光电泳胶;4、根据曝光的X光胶片结果，定位所述探针在电泳胶上的具体位置;5、切割该位置上的胶块;6、回收所述胶块中的同位素标记核酸探针。
[0005]同位素具有强烈的放射性，能诱导细胞癌变及造成人体其他方面的伤害。这种放射性对人体的伤害与操作同位素的时间成正比。与同位素接触的时间越长，伤害越大。上述切胶纯化同位素标记核酸探针一般流程的不足之处在于:与同位素接触的步骤多，操作同位素的时间长。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题是提供一种与同位素接触步骤少、操作同位素时间短的切胶纯化同位素标记核酸探针的方法。该方法通过预先确定电泳结束后同位素标记核酸探针在电泳胶上的具体位置，从而减少操作同位素所需的步骤。
[0007]为解决上述技术问题，本发明的切胶纯化同位素标记核酸探针的方法由以下步骤组成:
步骤一:制备与目标同位素标记核酸探针相对应的核酸片段；
步骤二:电泳分离所述核酸片段；
步骤三:使用常规染色法定位所述核酸片段在电泳胶上的位置；
步骤四:使用另一块与步骤二相同的电泳胶，采用与步骤二相同的条件，电泳分离目标同位素标记核酸探针；
步骤五:经过与步骤二相同的时长后，停止电泳，切割步骤四所述电泳胶上的由步骤三所确定的位置处的胶块；
步骤六:回收所述胶块中的同位素标记核酸探针。
[0008]目标同位素标记核酸探针可以是单链DNA、双链DNA、单链RNA或双链RNA中的任一种。
[0009]目标同位素标记核酸探针所使用的同位素可以是32P、3H或14C中的任一种。
[00?0] 步骤三所述的常规染色法可以是溴化乙锭染色法、Go IdView染色法、GeneFinder染色法、SYBR Green I染色法、GelRed染色法、GelGreen染色法或银染法中的任一种。
[0011]本方法电泳采用的介质可以是聚丙烯酰胺凝胶。
[0012]放射性同位素和与其对应的非放射性同位素相比，如32P和31P，具有相同的化学性质、分子量差别小，如32P的分子量是32、31P的分子量是31。所以，同位素标记的核酸探针和与其对应的无标记的核酸片段在同等条件下的电泳过程中，具备相同的迀移率。电泳相同的时长后，同位素标记核酸探针和与其对应的无标记的核酸片段在电泳胶上的迀移距离是相同的。所以，可以根据无标记的核酸片段电泳后在电泳胶上的位置，预先确定同位素标记核酸探针在相同条件、电泳相同时长的情况下，出现在电泳胶上的具体位置，从而减少操作同位素所需的步骤。这是本发明的基本原理。
[0013]本发明步骤一、二、三的作用，是使用无标记的核酸片段预先确定电泳结束后同位素标记核酸探针在电泳胶上的具体位置。步骤四所要求的“相同的电泳胶、相同的条件”和步骤五所要求的“相同的时长”，是确保同位素标记核酸探针和与其对应的无标记的核酸片段具备相同的迀移率和在电泳胶上的迀移距离。
[0014]本发明切胶纯化同位素标记核酸探针的方法，使用无标记的核酸片段，在无放射性的环境中，预先确定电泳结束后同位素标记核酸探针在电泳胶上的具体位置，从而省略【背景技术】部分所述切胶纯化同位素标记核酸探针一般流程中的步骤2、3、4。达到减少操作同位素步骤和缩短操作时间的有益效果。
【附图说明】
[0015]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0016]图1是本发明的切胶纯化同位素标记核酸探针方法的流程图。
【具体实施方式】
[0017]如下的实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验步骤或方法，通常按照常规实验条件，如Sambrook等编，《分子克隆:实验室手册》(New York:Cold Spring Harbor laboratory Press，2002)中所述的实验条件，或按照制造厂商所建议的实验条件。
[0018]本发明所指的“同位素”，如无特殊说明，一般是指具有放射性的同位素。
[0019]图1是本发明的切胶纯化同位素标记核酸探针方法的流程图。作为对比，右侧是切胶纯化同位素标记核酸探针的一般流程。虚线框表示该部分需要操作放射性同位素。
[0020]本发明的方法共六个步骤，分为两个阶段。第一个阶段由前三个步骤组成，目的是确定目标同位素标记核酸探针电泳结束后在电泳胶上的位置。第二个阶段由后三个步骤组成，目的是切割电泳结束后目标同位素标记核酸探针所在位置处的胶块，并进一步回收探针。第一个阶段不需要操作同位素;第二个阶段需要操作同位素。这两个阶段在不同的电泳胶上完成。
[0021]作为对比，切胶纯化同位素标记核酸探针的一般流程也有六个步骤组成，但是这六个步骤都需要操作同位素，且这六个步骤是在同一块电泳胶上完成的。
[0022]制备目标同位素标记核酸探针。
[0023]本发明的方法适用于有特定序列的同位素标记核酸探针，可以使用各种已知的方法进行制备。这些方法包括:缺口平移法、末端加尾法、末端标记法、逆转录掺入法、体外转录法、PCR法。上述各种制备同位素标记核酸探针的方法有大量的参考文献及相应的商业化产品可用，如《分子克隆:实验室手册》、Invitrogen公司相关产品、Amb1n公司相关产品等。核酸探针的序列可以是单链DNA、双链DNA、单链RNA或双链RNA，被标记的放射性同位素可以是 32P、3喊 14C。
[0024]需要说明是，本发明的目的是提供一种切胶纯化同位素标记核酸探针的方法，所以制备同位素标记核酸探针只是为本发明提供工作对象，而不是本发明的步骤之一。
[0025]制备与目标同位素标记核酸探针相对应的核酸片段(步骤一)。
[0026]所谓与目标同位素标记核酸探针相对应的核酸片段，是指该核酸片段与目标同位素标记核酸探针具备相同的碱基性质和碱基序列。如目标同位素标记核酸探针是双链DNA，则所制备的核酸片段也是双链DNA，且两者的碱基序列相同。如目标同位素标记核酸探针是单链RNA，则所制备的核酸片段也是单链RNA，且两者的碱基序列相同。
[0027]制备与目标同位素标记核酸探针具备相同序列的核酸片段，可以采用与制备目标同位素标记核酸探针相同的方法，也可以是其他的方法，只要满足所制备的核酸片段与目标同位素标记核酸探针具备相同的碱基性质和碱基序列。如使用PCR法制备目标同位素标记核酸探针，则同样可以使用PCR法制备对应的核酸片段，也可以使用人工合成的方法制备对应的核酸片段。
[0028]电泳分离所制备的核酸片段(步骤二)。
[0029]按照《分子克隆:实验室手册》或其他文献资料所记载的凝胶电泳法，电泳分离所制备的核酸片段。优化的电泳介质是聚丙烯酰胺凝胶。
[0030]使用常规染色法定位所述核酸片段电泳后在电泳胶上的位置(步骤三)。
[0031]所谓常规染色法是指不借助于标记物的特性就可以使DNA、RNA显现的方法，包括溴化乙锭染色法、GoldView染色法、GeneFinder染色法、SYBR Green I染色法、GelRed染色法、GelGreen染色法、银染法。所述染色法详细记载于《分子克隆:实验室手册》、公开文献资料和相关产品说明书之中。除上述的常规染色法之外，其他常规染色法也适用于本发明。
[0032]染色之后，通过凝胶成像系统成像。通过图像，可判断和测量所述核酸片段在凝胶中的具体位置。该位置就是后续目标同位素标记核酸探针电泳结束后的所在位置。此位置命名为T-site。该名称仅仅是所述位置在本说明书中的代号，可以使用任一名称命名该位置。
[0033]电泳分离目标同位素标记核酸探针(步骤四)。
[0034]使用另一块与步骤二相同的电泳胶，采用与步骤二相同的条件，电泳分离目标同位素标记核酸探针。所谓与步骤二相同的电泳胶是指，两块电泳胶具备相同的化学和物理特性，如凝胶性质、浓度、长度、宽度、厚度等。所谓相同的条件是指，除了被电泳的样品之夕卜，电泳过程中涉及的其他物品和参数都是相同的。相同的物品和参数包括:电泳胶、电泳液、电泳系统、施加的电压等。
[0035]因为目标同位素标记核酸探针和与其对应的核酸片段的性质相同，分子量差异极小，所以在相同的电泳条件下，迀移率也是相同的。
[0036]电泳结束后，切割已预先确定位置上的胶块(步骤五)。
[0037]经过与步骤二相同的时长后，停止电泳。因为目标同位素标记核酸探针和与其对应的核酸片段的迀移率是相同的，电泳持续的时长也是相同的，所以目标同位素标记核酸探针和与其对应的核酸片段在电泳胶上的迀移距离也是相同的。电泳结束后，目标同位素标记核酸探针位于上述标注的T-s i te位置。
[0038]切割T-site位置处的胶块。需要说明的是，被切割的胶块是从电泳同位素标记核酸探针所用的电泳胶而来(步骤四)，而不是从电泳核酸片段所用的电泳胶而来(步骤二)。
[0039]回收上述胶块中的探针(步骤六)。
[0040]使用《分子克隆:实验室手册》所描述的方法或商业化产品，如Amb1n公司产品、Progema公司产品，回收所述胶块中的同位素标记核酸探针。
[0041]在阅读了本发明的上述内容之后，本技术领域人员可以对本发明作各种修改或变动，如使用琼脂糖凝胶替代聚丙烯酰胺凝胶，使用其他同位素、其他的常规染色方法替代本发明的相应部分，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围内。
【主权项】
1.一种切胶纯化同位素标记核酸探针的方法，该方法包括如下步骤: 步骤一:制备与目标同位素标记核酸探针相对应的核酸片段； 步骤二:电泳分离所述核酸片段； 步骤三:使用常规染色法定位所述核酸片段在电泳胶上的位置； 步骤四:使用另一块与步骤二相同的电泳胶，采用与步骤二相同的条件，电泳分离目标同位素标记核酸探针； 步骤五:经过与步骤二相同的时长后，停止电泳，切割步骤四所述电泳胶上的由步骤三所确定的位置处的胶块； 步骤六:回收所述胶块中的同位素标记核酸探针。2.按照权利要求1所述的一种切胶纯化同位素标记核酸探针的方法，其特征在于:所述核酸探针为单链DNA、双链DNA、单链RNA或双链RNA中之一。3.按照权利要求1所述的一种切胶纯化同位素标记核酸探针的方法，其特征在于:所述同位素为32P、3H或14C中之一。4.按照权利要求1所述的一种切胶纯化同位素标记核酸探针的方法，其特征在于:所述常规染色法为溴化乙锭染色法、GoIdView染色法、GeneFinder染色法、SYBR Green I染色法、GelRed染色法、GelGreen染色法或银染法中之一。5.按照权利要求1所述的一种切胶纯化同位素标记核酸探针的方法，其特征在于:所述电泳采用的介质为聚丙烯酰胺凝胶。
【文档编号】C12N15/10GK106047863SQ201610433854
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月18日
【发明人】朱晨刚
【申请人】贵州师范学院, 朱晨刚