一种引物组、dna体外扩增方法、试剂盒及其应用

一种引物组、dna体外扩增方法、试剂盒及其应用
【专利摘要】本申请涉及分子生物学领域，特别是涉及一种引物组、DNA体外扩增方法、试剂盒及其应用，本发明实施例提供了特定的引物组，其扩增区域能够基本覆盖TYR基因的所有区域，使用该引物进行扩增能较为全面获取的TYR基因的核苷酸序列情况，明确突变位点。另外，该引物组适用于长片段扩增，在本发明提供的PCR条件下扩增出的条带单一，无非特异性条带。使用该引物组扩增获得的长片段，与现有的短片段相比，测序结果更为均匀，数据分析更为简单。
【专利说明】
-种引物组、DNA体外扩増方法、试剂盒及其应用
技术领域
[0001] 本发明设及分子生物学领域，尤其是设及一种引物组、DNA体外扩增方法、试剂盒 及其应用。
【背景技术】
[0002] 白化病(a化inism)是一类由黑色素的生物合成缺陷而引起的一种皮肤及附属器 官黑色素缺乏的常染色体隐性遗传病。白化病分为3型：眼皮肤白化病(皮肤和眼部都受累 及）、眼白化病(仅眼部受累及)和白化病相关综合征(存在全身性白化病的表现W及其他系 统异常）。在各类白化病中，超过90%为眼皮肤白化病，眼皮肤白化病在世界范围内的发病 率是1/20000,而中国人群的发病率略高，约为1/18000。
[0003] 根据设及基因的不同，眼皮肤白化病（oculocutaneous a化inism,0CA)主要分为4 种亚型，其中一种亚型由酪氨酸酶基因（tyrosinase,TYR)突变引起，TYR基因编码的酪氨酸 酶负责黑色素合成的前两步限速步骤。由于眼皮肤白化病各型患者临床表型往往重叠，仅 凭眼、皮肤和毛发的白化程度，很难准确区分各型非综合征眼皮肤白化病，因此，基因检测 成为眼皮肤白化病分型的唯一可靠方法。
[0004] 近年来快速发展的高通量二代测序技术(next-generation sequencing,NGS)是 在基于第一代测序技术的基础上被广泛应用于遗传病的诊断与携带者筛查。二代测序由模 板制备和序列检测过程W及数据分析过程两部分组成。其中，在技术上W边合成边测序为 核屯、，通过大规模平行测序的手段，同时对数W百万计的短DNA片段测序，获得海量的序列 信息，然后利用生物信息学工具进行分析。化化re Methods杂志在2014年点评了过去十年 对生物学研究影响最深的十大技术，二代测序居首位。二代测序的策略包括全基因组、外显 子组、目标区域、表达谱、甲基化、染色体免疫共沉淀测序等。其中，目标区域重测序是指针 对感兴趣的目标区域或基因，通过祀区域捕获或扩增的方法富集，然后进行大规模测序。与 全基因组、全外显子组测序方法相比，目标区域重测序能大规模、低成本筛查特定疾病的已 知致病位点，在临床诊断方面有着巨大的应用前景。

【发明内容】

[000引本申请主要解决的技术问题是提供一种引物组、DNA体外扩增方法、试剂盒、及其 应用，能够准确、灵敏地检测TYR基因突变。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明实施例采用的第一个技术方案是：提供一种的引物 组，与现有技术相比，其不同之处在于，该引物组包括用于在PCR中扩增TYR基因多个长片段 的检测引物对，该引物组包括选自下列引物对中的至少1对：
[0007] 序列如沈Q ID NO: 1和沈Q ID NO:2所示的引物对；
[000引序列如沈Q ID NO:3和沈Q ID NO:4所示的引物对；
[0009] 序列如沈Q ID NO:5和沈Q ID NO:6所示的引物对；
[0010] 序列如沈Q ID N0:7和沈Q ID N0:8所示的引物对；
[0011] 序列如沈Q ID NO:9和沈Q ID NO:10所示的引物对；
[0012] 序列如沈Q ID NO:11和沈Q ID NO:12所示的引物对；
[0013] 序列如沈Q ID NO:13和沈Q ID NO:14所示的引物对；
[0014] 序列如沈Q ID NO: 15和沈Q ID NO: 16所示的引物对；
[001引序列如沈Q ID NO: 17和沈Q ID NO: 18所示的引物对；
[0016] 序列如沈Q ID NO:19和沈Q ID NO:20所示的引物对；
[0017] 序列如沈Q ID NO:21和沈Q ID NO:22所示的引物对；
[001引序列如沈Q ID NO:23和沈Q ID NO:24所示的引物对；
[0019] 序列如沈Q ID N0:25和沈Q ID N0:26所示的引物对；
[0020] 序列如沈Q ID NO:27和沈Q ID NO:28所示的引物对；
[0021] 序列如沈Q ID NO:29和沈Q ID NO:30所示的引物对；
[0022] 序列如沈Q ID NO:31和沈Q ID NO:32所示的引物对。
[0023] 其中，引物组包括所述16对引物对。
[0024] 为解决上述技术问题，本发明实施例采用的第二个技术方案是:提供一种DNA体外 扩增方法，通过PCR反应扩增DNA片段，，与现有技术相比，其不同之处在于，使用上述的引物 组作为引物。
[00巧]其中，反应体系为20iU，包括长片段扩增酶0.抓;模板30ng;上游引物0.4iU ;下游 引物0.化1;
[00%] 所述聚合酶链式反应包括：
[0027] 扩增阶段:在94°C下预变性Imin; 98°C下变性10s;在65°C下退火30s，在68°C下延 伸lOmin;
[00%]对所述扩增阶段循环执行30次；
[0029] 循环执行30次后，在68°C下解育30min。
[0030] 为解决上述技术问题，本发明实施例采用的第=个技术方案是:提供一种试剂盒， 与现有技术相比，其不同之处在于，该试剂盒包括上述的引物组。
[0031 ]其中，该试剂盒还包括W下一种或多种试剂：
[0032] 用于从样品提取基因组DNA的试剂；
[0033] 利用所述引物组中的引物对进行PCR反应的试剂；
[0034] 用于处理PCR扩增产物W使扩增产物能够进行高通量测序的试剂；
[0035] W及
[0036] 用于对处理后的PCR扩增产物进行高通量测序的试剂。
[0037] 其中，所述高通量测序为Ion Torrent测序。
[0038] 其中，所述利用所述引物组中的引物对进行PCR反应的试剂采用上述的DNA体外扩 增方法。
[0039] 为解决上述技术问题，本发明实施例采用的第四个技术方案是：提供一种利用上 述的任一种引物组，或上述的任一种DNA体外扩增方法，或上述的任一种试剂盒在TYR基因 突变检测中的应用。
[0040] 为解决上述技术问题，本发明实施例采用的第五个技术方案是：提供一种利用上 述的任一种引物组，或上述的任一种DNA体外扩增方法，或上述的任一种试剂盒在黑色素合 成异常筛查中的应用。
[0041] 本发明的有益效果在于:本发明的引物组设及到TYR基因的大部分区域，包括外显 子和内含子，能较为全面获取患者的TYR基因的核巧酸序列情况，明确突变位点；且该引物 组针对长片段扩增，在合适条件下扩增出的条带单一，无非特异性条带，且由于扩增片段 长，与短片段扩增方法相比测序结果更为均匀，数据分析更为简单;本发明的试剂盒采用长 片段DNA扩增方法结合Ion Torrent测序技术的方式，具有高效、特异性强、灵敏度高、低成 本的优势。
【附图说明】
[0042] 为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使 用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于 本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可W根据运些附图获得其他 的附图。
[0043] 图1为本发明实施例1中家系成员TYR基因上的突变位点测序。
[0044] 图2为本发明实施例1中家系成员TYR基因上家系谱图。
【具体实施方式】
[0045] 为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，W下结合附图及实施例，对 本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用W解释本申请，并不 用于限定本申请。
[0046] 本发明实施例提供了一种引物组、DNA体外扩增方法、试剂盒及引物组、试剂盒和 DNA体外扩增方法在TYR基因突变检测W及黑色素合成异常筛查中的应用。本说明书中所述 "突变"可W是一个或多个碱基的插入、取代和/或缺失，或基因扩增突变。所述"扩增突变" 是指基因或基因的外显子或基因的外显子的区域的拷贝数选择性地增加的现象和过程， 属于基因拷贝数变异(Copy ruimber variations,CNV)的一种，扩增突变很有可能导致相应 蛋白表达的增加。
[0047] 本发明实施例的引物组分别用于扩增TYR基因的相应区域的长片段，然后将扩增 的目标片段进行基因型分析W确定基因突变情况，例如，将扩增后的目标片段进行高通量 二代测序，W获得扩增的目标片段的序列信息，并由此获得突变检测结果。其中，高通量二 代测序技术为现有技术，是在基于第一代测序技术的基础上被广泛应用于遗传病的诊断与 携带者的筛查，详细信息已在【背景技术】中予W介绍，运里就不再陈述。
[0048] 本发明实施例的引物组设及到TYR基因的大部分区域，包括外显子和内含子，其包 括选自表1所示引物对中的至少1对或全部16对引物:具体引物对对应的扩增区域具体如下 表1所示。
[0049] 表1检测引物对
[0化1 ]
[0052] 为设计特异性的引物，首先需要获取眼皮肤白化病致病基因 TYR的信息：通过 Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM， http://omim.org/)数据库获得眼皮肤白 化病致病基因信息，特别是获取TYR基因的位置信息和突变位点信息，见表2"0MIM数据库是 一种持续更新的关于人类基因和遗传素乱的数据库，主要着眼于可遗传的或遗传性的基因 疾病，包括文本信息和相关参考信息、序列纪录、图谱和相关其他数据库。
[0053] 表2眼皮肤白化病致病基因 TYR的位置信息 rnns4i
[005引其次，根据TYR基因设计特异性引物：
[0056] W基因组DNA为模板，根据UCSC Genome Bioinformatics数据库提供的标准序列 (GR化37/hgl9)，W及TYR序列位置，共设计16对长片段引物扩增致病基因 TYR的全长，包含 内含子和外显子，每对引物扩增约10化的片段长度，具体的引物序列及扩增目标区域如表1 所示。然后经高通量二代测序(NGS)筛选突变位点。
[0057] 再次，通过PCR技术对模板中的目标基因（即TYR基因）进行选择性扩增。其中，使用 上述的引物组作为PCR反应的引物。
[0058] 提取外周血基因组DNA作为模板。提取方法可W采用多种市售的试剂盒，比如 QIAGEN公司的DNA提取试剂盒，或者OMEGA的基因组DNA提取试剂盒。
[0059] 在本发明实施例中，PCR反应总体系为，包括长片段扩增酶0.抓;模板30ng;上 游引物0.化1;下游引物0.化IdPCR扩增条件为:在94°C下预变性lmin;98°C下变性10s;在65 。(:下退火30s，在68 °C下延伸lOmin，扩增循环执行30次;然后，在68 °C下解育30min。
[0060] 每对引物W上述PCR扩增条件进行PCR扩增，可W扩增出约10化长度的DNA片段，本 发明实施例所设计16对引物，共扩增16段约lOkb长度的DNA片段，详细序列见SEQ ID NO.33-SEQ ID NO.48,所有片段总长序列几乎包含了TYR基因的所有外显子和内含子序列。
[0061] 本发明实施例提供的试剂盒，包括上述的引物组，还包括W下一种或多种试剂： 用于从样品提取基因组DNA的试剂，例如DNA提取液、裂解酶、缓冲液等等;利用所述引物组 中的引物对进行PCR反应的试剂，例如DNA扩增酶;用于处理PCR扩增产物W使扩增产物能够 进行高通量测序的试剂，W及用于对处理后的PCR扩增产物进行高通量测序的试剂。
[0062] 本发明实施例所采用的高通量测序法为Ion Torrent测序法。优选使用Life Technologies公司的Ion PGM测序仪进行。Ion Torrent测序技术也被本领域技术人员称为 二代测序技术，其是基于DNA合成过程所产生的化学变化。DNA聚合酶W单链DNA为模板，按 碱基互补原理，合成互补的DNA链。DNA链每延伸一个碱基时，就会释放一个质子，导致局部 pH变化。Ion Torrent半导体测序忍片的每个微孔里的微球表面含有约100万个DNA分子拷 贝。测序时核巧酸分子连续流过忍片微孔。如果一个核巧酸与某个微孔中的DNA分子互补， 则该核巧酸被合成到DNA分子中，并且释放质子，该微孔中溶液的pH发生变化。离子传感器 检测到抑变化后，将该化学信息转变为数字电子信息。如果DNA链含有两个相同的碱基，贝U 记录电压信号是双倍的。如果碱基不匹配，则无质子释放，也就没有电压信号的变化。Ion Torrent测序技术属于直接检测DNA的合成，即，边合成边检测。另外，Ion Torrent测序技术 不需要CCD扫描、巧光激发等环节，几秒钟就可检测合成插入的碱基，大大缩短了运行时间， 从而提高了检测效率。
[0063] 试剂盒需要实现的功能，例如从外周血中提取基因组DNA等是本领域的常规技术， 并且市场上有很多成熟完善的商品化试剂可供选择。
[0064] 试剂盒包含的用于处理扩增产物W使得扩增产物能用于高通量测序技术中的试 剂。PCR扩增产物一般无法直接用于高通量测序，还需要进行处理，例如，末端修复，连接接 头和标签、纯化、修复缺口等。对于掌握高通量测序的普通技术人员而言，上述处理步骤和 所需要的试剂是容易理解的。本申请的实施例也提供了示例性的处理方法。
[0065] 试剂盒包含的用于对处理后的扩增产物进行高通量测序的试剂。高通量测序通常 是在微孔忍片上进行的。目前，商业化的忍片和反应试剂容易购得，例如可购自Life Technologies Inc.。
[0066] 具体地，样本基因组DNA的提取：取外周静脉血2ml，构祿酸钢抗凝。采用QIAamp DM Min化it(Qiagen)提取全血基因组DM，并放置-20°C保存。
[0067] PCR扩增，反应体系为，长片段扩增酶0.抓，DNA模板30ng和上下游引物（10山〇 各0.化1。反应条件:94°C预变性1111111;98°(：1〇3,65°(：退火3〇3,68°(：延伸1〇111111;30个循环后 68 °C解育30min。取扩增产物化1经0.8 %琼脂糖凝胶电泳鉴定。
[006引 Ion Torrent测序：PCR产物混合后，通过Ion 化ear Plus Reagent Kit化ife technologies)酶切片段化，并采用 Ion Plus Fragment Library Kit 化；Lfe technologies)和Ion Xpress Barcode Adapter l_16(Xife technology)连接标签接头 (Barcode Adapter),不同的家系成员使用不同的标签接头(Barcode Adapter)。连接完成 后通过E-gel电泳制备平均大小约25化P的文库模板，纯化处理后再用Ion Plus Fragment Library Kit化ife technologies)进行PCR扩增制备文库，制备好的DNA文库需要通过 如bit 2.0进行定量，然后稀释成相应的浓度再通过Ion化e Touch进行乳液PCR，并通过磁 珠颗粒在Ion OneTouch ES上对阳性模板进行富集，最后采用Ion PGM 200 Sequencing Kit(Life technologies)及Ion To;rrent318忍片在Ion Torrent PGM平台进行测序反应， 共125测序循环。
[0069] 测序结果分析:采用Ion Torrent Suite v3.0软件进行Ion Torrent数据提取及 序列比对和过滤。得到的突变位点经dbSNP数据库过滤后，检索肝豆状核变性数据库 化t1:p: //www. wi Isondi sease. med. ua化erta. ca/database . asp)，筛选可能的致病突变位 点。
[0070] 核屯、家系遗传分析和突变验证:二代测序发现并经数据库比对得到的后续突变位 点，在患者及其家系成员中相应位点进行Sanger测序分析，确定符合孟德尔隐性遗传规律 的位点为该先证运的致病基因突变位点。
[0071] 在本发明实施例中，设计了 16对引物，采用长片段DNA的PCR扩增方法对眼皮肤白 化病的致病基因 TYR进行富集，然后在Ion Torrent PGM/ion Proton二代测序平台进行全 基因重测序。应用该引物的试剂盒的扩增片段能够全面覆盖TYR基因的所有外显子、内含子 及其他区域，因而此试剂盒W及引物在的分子诊断中具有非常高的实际临床应用价值。
[0072] 实施例
[0073] 1、家系情况：
[0074] 先证者临床表现为皮肤、头发、和眼虹膜黑色素几乎完全缺失，眼球水平振颤、畏 光明显。父母双方家族中无其他患者，先证者父母均表型正常，非近亲婚配，且孕期无用药 史或不良环境接触史。本研究经深圳市人口和计划生育科学研究所医学伦理委员会批准， 所有基因诊断均取得患者家属的同意并签署知情同意书。
[00巧]2、检测方法：
[0076] (1)标本收集和DNA提取:取先证者及其父母的外周静脉血各2mL，构祿酸钢抗凝。 采用市面销售的DNA提取试剂盒(QIAamp DNA MiniKit，Qiagen公司产品）提取全血基因组 DNA，并放置-20°C保存。
[0077] (2)致病基因全长基因序列分析:筛查致病基因酪氨酸酶基因（tyrosinase,TYR) 的位置信息如表2所示。
[0078] W基因组DNA为模板，根据UCSC Genome Bioinformatics数据库提供的标准序列 (GR化37/hgl9)，共设计16对长片段引物扩增上述基因全长(包括全部内含子和外显子），每 对引物扩增约10化的片段长度。本发明实施例的PCR引物设计合理、高效、特异性强、灵敏度 高，通过该引物在合适条件下扩增出的条带单一，无非特异性条带，且由于扩增片段长，与 短片段扩增方法相比测序结果更为均匀，数据分析更为简单，具体的引物序列如表1所示。
[0079] (3)PCR扩增:反应体系为20化，长片段扩增酶0.抓，DM模板30ng和上下游引物（10 咖)各 0.化 L。反应条件:94°C 预变性 1111111;98°(：1〇3,65°(：退火3〇3,68°(：延伸1〇111111;30个循环 后68 °C解育30min。取扩增产物化L经0.8 %琼脂糖凝胶电泳鉴定。
[0080] 每对引物根据上述PCR扩增条件扩增出约10化长度的DNA片段，本发明实施例所设 计16对引物，共扩增16段约10化长度的DNA片段，详细序列见SEQ ID NO.33-SEQ ID NO.48。
[0081] (4)Ion Torrent测序：PCR产物混合后，通过Ion Siear Plus Reagent KitiXife technologies公司生产）酶切片段化，并采用Ion Plus Fragment Library Kit化ife technologies公司生产）和Ion Xpress Barcode Adapters l-16(Life technologies公司 生产)连接Barcode Adapter,不同的家系成员使用不同的Barcode Adapter。连接完成后通 过E-gel电泳制备平均大小约250bp的文库模板，纯化处理后再用Ion Plus Fragment Ubra巧Kit化ife technologies公司生产)进行PCR扩增制备文库。制备好的DM文库需要 通过Qubit 2.0进行定量，然后稀释成相应的浓度再通过Ion化eTouch进行乳液PCR，并通 过磁珠颗粒在Ion OneTouch ES上对阳性模板进行富集，最后采用Ion PGM 200 Sequencing Kit(Life technologies公司生产）及Ion Torrent 318忍片在Ion Torrent PGM平台进行测序反应，共125个测序循环。
[0082] (5)测序结果分析:采用Ion Torrent Suite v3.0软件进行Ion Torrent数据提取 及序列比对和过滤。得到的突变位点经化SNP数据库过滤后，检索HGMD、L0VD等数据库及查 询相关文献，并查询检索白化病数据库化ttp://www. i巧CS.0巧/a化inism/)筛选出可能的 突变位点。
[0083] (6)核屯、家系遗传分析和突变验证:二代测序发现并经数据库比对得到的候选突 变位点，在患者及其家系成员中相应位点进行Sanger测序分析，确定符合孟德尔隐性遗传 规律的位点为该先证者的致病基因突变位点。
[0084] 3、结果分析：
[0085] (1)基因测序质量：从表3可W看出，父亲、母亲和患者的样本测序读数分别为 663752、579868和416271，测序平均深度分别为363.8、319.2和241.7,平均读长分别是 184bp、185bp和189bp。
[00化]表3 Ion Torrent的测序质量
[0087]
[008引（2)基因测序诊断：先证者：先证者的TYR基因共检测到2种杂合突变，分别为 0.9291邮(：和(3.11996〉1'。父亲:父亲的1￥1?基因检测到1种杂合突变，(3.11996〉1'。母亲:母亲 的TYR基因检测到1种杂合突变，c.929insC，详见表4。
[0089] 表4家系成员中的白化病基因突变情况
[0090]
[0091] *突变位点参考人类基因组GR化37/hgl9版本;a等位基因父亲来源，b等位基因母亲 来源;致病基因用粗体显示。
[0092] (3)Sange;r验证结果：如图1所示，先证者为0CA I型患者，致病基因为TYR基因，致 病突变为C. 929insC和C. 1199G〉T构成双重杂合子突变，其中C. 1199G〉T突变遗传来自父亲， c.929insC遗传来自母亲。W上结果符合孟德尔常染色体隐性遗传规律，如图2所示。建议该 家庭在二胎妊娠过程中做产前基因诊断，W避免再出生于先证者类似病情的患儿。
[0093] 上述案例说明，高通量二代测序发现并经数据库比对得到的后续突变位点，在患 者及其家系成员中相应位点进行Sanger测序分析，确定符合孟德尔隐性遗传规律的位点为 该先证者的致病基因突变位点。
[0094] 在本发明实施例中，首先，采用长片段DNA扩增方法结合二代测序技术筛查眼皮肤 白化病TYR致病基因的突变。与传统方法相比，该测序方法覆盖了基因全部区域，包括TYR全 部外显子和内含子，能全面获取患者在致病基因 TYR中核巧酸序列情况，明确突变位点，为 检测基因突变提供了可靠的方法，具有很强的灵敏度和准确性，为眼皮肤白化病的临床诊 断提供分子生物学的诊断依据。
[0095] 其次，本发明实施例的PCR引物设计合理、高效、特异性强、灵敏度高，利用该引物 通过检测外周血提取DNA进行体外扩增，得到所需的PCR产物再进行测序，与全基因组测序、 外显子组测序方法相比，具有高效、低成本的优势。
[0096] 再次，本发明实施例设计的引物在合适条件下扩增出的条带单一，无非特异性条 带，且由于扩增片段长，与短片段扩增方法相比测序结果更为均匀，数据分析更为简单。
[0097] 第四，本发明实施例针对TYR基因全部外显子、内含子进行PCR扩增再测序，可W为 发现眼皮肤白化病在致病基因中的新突变科学研究提供技术手段。
[0098] 第五，本发明实施例还可W应用在其他与TYR突变相关的疾病（如皮肤恶性黑素 瘤、白癒风等)的检测或者筛查。
[0099] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对 于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可W做出其它不同形式的变化或 变动。运里无需也无法对所有的实施方式予W穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或 变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
【主权项】
1. 一种引物组，其特征在于，该引物组包括用于在PCR中扩增TYR基因多个长片段的检 测引物对，该引物组包括选自下列引物对中的至少1对： 序列如SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示的引物对； 序列如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示的引物对； 序列如SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示的引物对； 序列如SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示的引物对； 序列如SEQIDN0:9和SEQIDN0:10所示的引物对； 序列如SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12所示的引物对； 序列如SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14所示的引物对； 序列如SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16所示的引物对； 序列如SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18所示的引物对； 序列如SEQIDN0:19和SEQIDN0:20所示的引物对； 序列如SEQ ID N0:21和SEQ ID N0:22所示的引物对； 序列如SEQ ID N0:23和SEQ ID N0:24所示的引物对； 序列如SEQ ID N0:25和SEQ ID N0:26所示的引物对； 序列如SEQ ID N0:27和SEQ ID N0:28所示的引物对； 序列如SEQ ID N0:29和SEQ ID N0:30所示的引物对； 序列如SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32所示的引物对。2. 根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组包含所述16对引物对。3. -种DNA体外扩增方法，通过PCR反应扩增DNA片段，其特征在于，使用如权利要求1或 2所述的引物组作为PCR引物。4. 根据权利要求3所述的DNA体外扩增方法，其特征在于，所述PCR的反应体系为20μ1， 包括长片段扩增酶〇. 5U;模板30ng;上游引物0.4μ1;下游引物0.4μ1; 所述PCR的反应条件为： 扩增阶段：在94°C下预变性lmin;98°C下变性10s;在65°C下退火30s，在68°C下延伸 lOmin； 对所述扩增阶段循环执行30次； 循环执行30次后，在68°C下孵育30min。5. -种试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求1或2所述的引物组。6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括以下一种或多种试剂： 用于从样品提取基因组DNA的试剂； 利用所述引物组中的引物对进行PCR反应的试剂； 用于处理PCR扩增产物以使扩增产物能够进行高通量测序的试剂； 以及 用于对处理后的PCR扩增产物进行高通量测序的试剂。7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述高通量测序为Ion Torrent测序。8. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述利用所述引物组中的引物对进行 PCR反应的试剂采用权利要求4所述的DNA体外扩增方法。9. 权利要求1至2任一项的引物组，或权利要求3至4任一项的DNA体外扩增方法，或权利 要求5至8任一项的试剂盒，在TYR基因突变检测中的应用。10.权利要求1至2任一项的引物组，或权利要求3至4任一项的DNA体外扩增方法，或权 利要求5至8任一项的试剂盒，在黑色素合成异常筛查中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK106047871SQ201610639373
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年8月5日 公开号201610639373.2, CN 106047871 A, CN 106047871A, CN 201610639373, CN-A-106047871, CN106047871 A, CN106047871A, CN201610639373, CN201610639373.2
【发明人】洪文旭, 段山, 汪保江, 林圣 , 谷学英, 邵豪
【申请人】深圳市人口和计划生育科学研究所