一种靶向sall4基因的脱氧核酶分子及在乳腺癌基因治疗中的应用
【专利摘要】一种靶向SALL4基因的脱氧核酶分子及其在乳腺癌基因治疗中的应用，属于靶向基因技术领域。本发明的目的是根据编码人SALL4的mRNA序列(NM_020436.4)设计并构建脱氧核酶分子，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。本发明所设计的脱氧核酶分子是一种能够识别并切割靶基因序列的小核酸分子，不仅具有高的靶基因序列切割能力，同时具有反义寡核苷酸的化学稳定性，合成成本低。通过脱氧核酶分子对靶基因SALL mRNA序列的有效识别和高效切割，来抑制乳腺癌的增殖、迁移与浸润，最终构建一类通过抑制SALL4表达来实现乳腺癌基因治疗的小核酸类药物。
【专利说明】
-种卽向SALL4基因的脱氧核酶分子及在乳腺癌基因治疗中 的应用
技术领域
[0001] 本发明属于祀向基因技术领域，具体设及一种祀向SA化4基因的脱氧核酶分子及 其在乳腺癌基因治疗中的应用。
【背景技术】
[0002] 《全球癌症报告2014》显示，全球癌症病例将呈现迅猛增长态势，由2012年的1400 万人，逐年递增至2025年的1900万人，到2035年将达到2400万人。同时，我国肿瘤发病率多 年来持续上升，已成为一个必须高度重视的社会问题。2015年，中国癌症总发病429.16万 例，总死亡281.42万例。癌症的临床治疗方案目前主要包括化学疗法、放射疗法和手术治疗 等。然而，长期化学治疗极易产生肿瘤的多药耐药现象，放射疗法和手术疗法难W实现肿瘤 的彻底根治，同时W上策略中严重的毒副作用给患者了带来极大的痛苦。因此，构建一种高 效、安全的肿瘤治疗策略，对于解决运一人类顽疾具有重要的意义。
[0003] 与常规的治疗策略相比，基因治疗作为一种从根本上治疗疾病的新兴手段，成为 目前国际学术界研究的焦点，有望成为未来肿瘤临床治疗中的"新宠"。基因治疗，是指通过 基因转移技术将外源基因引入病变的祀细胞或者组织，通过目的基因的表达，纠正或补偿 缺陷基因，关闭或抑制异常表达的基因，恢复组织或器官的正常功能，从而达到治疗目的的 一种新型治疗方法。人类SA化4基因是果蛹属基因化osophila spalt的同源异形基因，位于 20号染色体的ql3.2。该基因共有4个外显子，有两种亚型，即SA化4A和SA化4B，其差异是由 于基因内部外显子2的不同剪接机制所导致的。通常，SA化4的表达只是在胚胎中，在成熟组 织中是沉默的。近年研究显示，在乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、肝癌、子宫内膜癌、神经胶质 瘤等诸多实体瘤中均检测到SALL4的过表达。由此可见，SALL4可能是一个关键的癌基因，在 肿瘤的发生和发展中起到重要的作用。因此，WSA化4基因为作用祀点，开发小分子化学物、 小干扰RNA等，降低该基因的表达水平，有望成为肿瘤临床治疗中的新型策略。
[0004] 脱氧核酶化eoxy;ribozyme,DNAzyme)是一类能够特异性地识别并切割祀基因 mRNA 的单链DNA片段，因而能够降低致病基因的表达水平，达到预防及治疗疾病的目的，同时不 会对细胞基因组产生任何副作用。目前，已经通过人工模拟的方法，合成了几十种脱氧核 酶，包括10-23型脱氧核酶、8-17型脱氧核酶、"手枪型"脱氧核酶等。其中，10-23型脱氧核酶 研究最为广泛，它是由一个活性中屯、和两个祀基因结合臂所组成，活性中屯、序列高度保守， 祀基因结合臂与祀基因 mRNA通过碱基互补特异性结合，进而活性中屯、可W切割mRNA，下调 祀基因的表达水平。与小干扰RNA相比，脱氧核酶具有更高的祀基因 mRNA切割效率，对肿瘤 生长的抑制效果更为有效，同时脱祀效率更低，副作用低，具有广阔的应用前景。同时，脱氧 核酶的化学本质为脱氧寡核巧酸，其还具有如下优势：（1)分子量小，性质相对稳定，对底物 的趋近性好；（2)催化效率及特异性高；（3)易于合成，价格低廉。总之，脱氧核酶由于其精准 的祀基因 mRNA序列识别及切割能力，已成为一类重要的肿瘤特异性抑制剂，有望成为未来 肿瘤基因治疗中的一类新型小核酸基因药物。
【发明内容】
[000引本发明的目的是根据编码人SALL4的mRNA序列(NM_020436.4)设计并构建脱氧核 酶分子，通过脱氧核酶分子对祀基因 SA化mRNA序列的有效识别和高效切割，来抑制乳腺癌 的增殖、迁移与浸润，最终构建一类通过抑制SA化4表达来实现乳腺癌基因治疗的小核酸类 药物。
[0006] 本发明中所采用的脱氧核酶分子为10-23型脱氧核酶，是一类能够特异性地识别 并切割祀基因 mRNA的单链DNA片段，具体序列包括：一个活性中屯、和两个祀基因结合臂组 成，活性中屯、序列高度保守（由15个脱氧核糖核巧酸组成，其序列为5 ' -GGCTAGCTACAACGA- 3'），祀基因结合臂（由9个脱氧核糖核巧酸组成）与祀基因 mRNA通过碱基互补特异性结合， 其切割位点为5'-lUY-3'（R不形成碱基配对，Y则必须与脱氧核酶形成碱基配对）。
[0007] 本发明的脱氧核酶分子的序列如下之一所示，其核巧酸序列分别如SEQ ID NO. 1、 沈Q ID NO.2、SEQ ID NO.3和沈Q ID NO.4所示：
[0008] 1.5 '-CCGCAGTTA GGCTAGCTACAACGA TTTGCCCTC-3 '
[0009] 2.5'-CTTTAGGTA GGCTAGCTACAACGA CACCACAGA-3'
[0010] 3.5'-CTTGGGGAA GGCTAGCTACAACGA TTATAGTTT-3'
[0011] 4.5'-CTGGAAGGA GGCTAGCTACAACGA TGTGGTTTC-3'
[0012] 本发明中脱氧核酶分子可W通过修饰来增加稳定性，组成脱氧核酶的憐酸醋基团 可W在天然憐酸二醋键部分的自由单键氧位置进行修饰，其中可W是氧、或是甲氧基、或是 硫。
[OOU]本发明所设及脱氧核酶能够通过对mRNA序列的识别切割，降低SALL4的表达水平， 通过诱导细胞发生调亡和周期阻滞来实现对乳腺癌增殖的抑制，同时能够降低乳腺癌细胞 的迁移浸润能力。
[0014]综上，本发明所设计的脱氧核酶分子是一种能够识别并切割祀基因序列的小核酸 分子，不仅具有高的祀基因序列切割能力，同时具有反义寡核巧酸的化学稳定性，合成成本 低。通过对祀基因 SA化4mRNA序列的高效切割，脱氧核酶能够实现对乳腺癌增殖、迁移与浸 润能力的抑制，有望成为一类有效的恶性肿瘤基因治疗药物。本发明的实施，将对解决恶性 肿瘤运一人类顽疾具有重要的意义，将产生重大的经济和社会效益。
【附图说明】
[001引图1祀基因 SALL4mRNA的二级结构模拟图；
[0016] 图2祀基因 SA化4mRNA潜在祀位点的二级结构模拟图；
[0017] 图3脱氧核酶对乳腺癌细胞系MCF7(A)、MDA-MB-231 (B)细胞增殖的抑制分析曲线；
[0018] 图4脱氧核酶对乳腺癌细胞系MCF7(A)、MDA-MB-231(B)集落形成能力的抑制作用 图；
[0019]图5脱氧核酶诱导乳腺癌细胞MCF7(A)、MDA-MB-231(B)调亡的检测图；
[0020] 图6脱氧核酶对乳腺癌细胞MCF7、MDA-MB-231细胞调亡相关蛋白表达水平的影响 图；
[0021] 图7脱氧核酶对乳腺癌细胞系MCF7(A)和MDA-MB-23UB)线粒体膜电位的影响图； 图中jc-1单体的出现(图中W箭头标示)表示细胞线粒体膜电位的下降。
[0022 ]图8脱氧核酶对乳腺癌细胞系MCF7 (A)和MDA-MB-231 (B)细胞周期的影响图；
[0023 ]图9脱氧核酶对乳腺癌细胞系MCF7 (A)和MDA-MB-231 (B)迁移能力的影响图；
[0024] 图10脱氧核酶对乳腺癌细胞系MCF7(A)和MDA-MB-231 (B)细胞浸润能力的影响图。
【具体实施方式】
[0025] 下面给出的实施例子是对本发明作进一步说明，W便于本专业技术人员更全面地 理解本发明。但所给出的实施例不能理解为对本发明保护范围的限制，因而该专业的技术 人员根据上述
【发明内容】
所做出的非本质的改进和调整也应属于本发明保护范围。
[00%] 实施例1
[0027] 根据人SA化4基因的mRNA序列，进行mRNA生理条件下的二级结构模拟，结果如图1; 根据脱氧核酶设计原则，选取相应的祀位点区域，设计四条脱氧核酶寡核巧酸序列，祀位点 选取位置如图2所示，每条脱氧核酶分子的两端各有3个核巧酸为硫代修饰，采用PAGE或 HPLC纯化，所设计的脱氧核酶序列如下：
[0028] 1.Dz-SA化4-12:5 '-CCGCAGTTA GGCTAGCTACAACGA TTTGCCCTC-3 '
[00 巧]2.Dz-SAli^4-62:5，-CTTTAGGTAGGCTAGCTACAACGACACCACAGA-3'
[0030] 3.Dz-SAli^4-143:5'-CTTGGGGAAGGCTAGCTACAACGATTATAGTTT-3'
[0031] 4.Dz-SAli^4-191:5'-CTGGAAGGAGGCTAGCTACAACGATGTGGTTTC-3'
[0032] 实施例2
[0033] 乳腺癌细胞MCF7、S阴性乳腺癌MDA-MB-231采用含有体积分数为10 %的胎牛血 清、lOOU/mL青霉素、lOOiig/mL链霉素的细胞培养液，在37°C，体积分数为5%的C〇2条件 下进行培养及传代。脱氧核酶的转染采用商业化的转染试剂GoldenTransfer?-D(GT-D)，W 2:l(v/wt)的比例将转染试剂与实施例1中的4种脱氧核酶分子混合，在37°C中解育20min， 加入至细胞培养体系中，W无血清培养体系转染4h，并在含有血清的培养基中继续培养 4她。乳腺癌细胞增殖抑制检测过程如下：W5 X 103细胞/孔的密度分别将MC巧、MDA-MB-231 细胞接种于96孔板中，每孔培养基20化L，预培养2地。将Golden化ansfer?-D/脱氧核酶复合 物稀释至1、2、3、化g/mL，加入至96孔板中，WDMEM细胞培养液(关于细胞存活率的测定分为 4种GoldenlYansferTM-D/脱氧核酶复合物（4条曲线）W及GoldenlYansferTM-Di； 1 条曲线）， 仅加入细胞培养液的组别视作100%存活，在图中化g/mL处体现，因此无曲线，共计5条曲 线）和Golden化ansfer?-D作为阴性对照。培养至4她后，每孔加入20化5mg/mL嚷挫蓝(MTT) 溶液至终浓度为0.5mg/mL，继续培养4h。地后小屯、吸弃上清，加入15化L二甲亚讽溶解生成 的紫色沉淀物，振荡5min后，在492nm下通过酶标仪检测吸光度。取各平行孔0D值的平均值， 依据下列公式计算细胞相对存活率：
[0034] Cell viability( % ) = (Asample-Ablank)/(Acontrol-Ablank) X 100%
[003引其中，Asampie为分别加入GoldenTransfer?-D/脱氧核酶复合物W及仅加入 GoldenlYansfer?-D后的吸光度值，Accmtroi为WDMEM细胞培养液正常培养细胞后的吸光度 值，Abiank为无培养细胞仅加入DMEM细胞培养液后的吸光度值
[0036]研究中对Golden化ansfer?-D/脱氧核酶复合物进行不同浓度的稀释，作用于肿瘤 细胞后4她检测，结果如图3所示。伴随脱氧核酶分子浓度的增加，脱氧核酶对两种乳腺癌细 胞的增殖抑制能力明显增加。其中，针对Loopl2设计的脱氧核酶分子化-SA化4-12作用效果 最为明显，同时该脱氧核酶对乳腺癌细胞MCF7的作用效果要明显优于S阴性乳腺癌MDA- MB-231。
[0037]实施例3
[003引 W2X 105细胞/孔的密度分别将MCF7、MDA-MB-231细胞接种于6孔板中，每孔培养 基2mL，预培养2地。将Dz-SA化4-12 W化g/mL的浓度无血清培养基转染4h，换成完全培养基 培养至4她。使用质量体积分数为0.25%的膜酶消化贴壁细胞，并用血清计数板对收取的细 胞计数。在新的六孔板中，每孔加入3000个经不同实验组处理后的细胞，每5天换液一次，培 养14天后，弃细胞培养上清，用体积分数为75 %的冰乙醇固定20min，预冷的抑7.2的憐酸缓 冲液(Phosphate buffer solution，PBS)清洗一次，随后加入质量体积分数为0.2%的结晶 紫/PBS溶液对细胞进行染色，4°C染色20min。随后，采用预冷的PBS清洗至没有浮色，倒置显 微镜下拍照。
[0039] 本发明中，我们通过集落形成的数量来评价脱氧核酶对细胞集落形成能力的影 响，结果如图4所示。与对照组相比，脱氧核酶化-SA化4-12转染后，细胞集落数量明显减少， 而转染无义脱氧核酶iDz实验组W及单独加入转染试剂GT-D组并无明显变化，可见本发明 所设计的脱氧核酶分子能够显著抑制乳腺癌细胞的集落形成能力。
[0040] 实施例4
[0041 ] W2X 105细胞/孔的密度分别将MCF7、MDA-MB-231细胞接种于6孔板中，每孔培养 基2mL，预培养2地。将DZ-SALL4-12分别W1、2、3、4iig/mL的浓度无血清培养基转染4h，换成 完全培养基培养至4她。根据Annexin V-門TC/PI细胞调亡检测试剂盒(上海贝博公司）的使 用说明书进行相关检测:使用质量体积分数为0.25 %的膜酶消化贴壁细胞，2000g离屯、5min 收集细胞，用预冷的PBS洗涂细胞两次；W50化染色体系对细胞进行染色，其中包括化L Annexin V-門TC和化L PI，混匀后于4°C避光条件下解育30min;WAnnexin V结合缓冲液将 体系稀释至40化L，通过流式细胞仪检测乳腺癌细胞调亡情况。
[0042] 从图5中我们可W清楚看到，脱氧核酶的转染对两种乳腺癌细胞都具有良好的调 亡诱导效果，同时对乳腺癌MC巧作用效果更为明显。在化g/mL情况下早期调亡比例即可达 到26.70%，同等浓度下，脱氧核酶诱导=阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞早期调亡为15.94%。
[0043] 实施例5
[0044] X 106细胞/孔的密度分别将MCF7、MDA-MB-231细胞接种于10cm培养皿中，每皿 培养基lOmL，预培养2地。^化g/mL的条件无血清培养基转染脱氧核酶化-SA化4-12地，换 成完全培养基培养至4她。用细胞刮刀将细胞收集并连同培养基上清收集至预冷的50mL离 屯、管中，12000巧m 4°C离屯、5min。将蛋白沉淀W预冷的PBS重悬，12000rpm 4°C离屯、Imin，弃 上清，向沉淀中加入3倍沉淀体积的细胞裂解液RIPA和100 X蛋白酶抑制剂PMSF，在冰上裂 解化，其中每15min摇动使沉淀均匀。随后W1200化pm 4°C离屯、15min，将上清转移至新的 1.5mL离屯、管管中。取10化样品，WBCA蛋白定量试剂盒(北京鼎国公司)标定蛋白浓度，剩余 的样品加入5XSDS上样缓冲液，100°C煮样15min，煮样后冷却至室溫后分装放入-20°C冰箱 保存。配制质量分数为12%的SDS-PAGE聚丙締酷胺凝胶并且80V预电泳5min，上样时，每孔 40]ig蛋白量加入样品，80V电压20min将蛋白样品压缩至浓缩胶/分离胶界面，更改电压至 120V，约化后电泳至凝胶下缘。W300mA恒流冰浴化将细胞全蛋白转至PVDF膜上。将膜取出 惊干后，将膜按不同分子量分割至合适大小，放入至质量体积分数为5%脱脂奶粉/0.1% Tween20/PBS溶液，在常溫下封闭PVDF膜化，去除膜的蛋白非特异结合。取出后W滤纸吸干， 放入抗体杂交袋中，抗体W质量分数为3%牛血清白蛋白（Bovine serum a化umin，BSA)/ PBS溶液稀释至适当比例（SA化4 1:1000; e-act in 1: 2000，抗体购自Abeam公司）加入杂交 袋中，在4 °C摇动解育过夜。0.1 % Tween20/PBS清洗立次，每次1 Omin W除去抗体的非特异性 结合，加入3%BSA/PBS溶液稀释相应的二抗（1:5000)。0.1%1^661120/?85清洗^次，每次 lOminW除去二抗的非特异性结合。最后用E化显色试剂盒(上海天能科技公司）曝光显影。
[0045] 从图6中我们可W看出，在乳腺癌细胞系MC巧和MDA-MB-231中，脱氧核酶的作用能 够显著降低SA化4蛋白的的表达水平，转染无义脱氧核酶iDz实验组W及单独加入转染试剂 GT-D组相关蛋白表达量基本保持不变。同时，脱氧核酶的作用能够降低细胞调亡相关蛋白 p;r〇-Caspase-3、p;r〇-Caspase-9，细胞迁移相关蛋白MMP9蛋白的表达水平。该结果证明，转 染的脱氧核酶化-SA化4-12可W降低SA化4的表达，下调的SA化4激活了 pro-化spase9，具有 活性的化spase9进而激活了 pro-化spase-3的活化，进而诱导细胞发生了调亡，即脱氧核酶 通过激活线粒体调亡途径来诱导细胞发生调亡的。
[0046] 实施例6
[0047] W2X 105细胞/孔的密度分别将MCF7、MDA-MB-231细胞接种于6孔板中，每孔培养 基2mL，预培养2地。W无血清培养基转染脱氧核酶化-SA化4-12地，换成完全培养基培养至 4她。按照JC-1线粒体膜电位检测试剂盒(上海碧云天生物技术公司）的使用说明书进行操 作：WPBS清洗细胞一次后，在培养板中加入ImL JC-1染色工作液，在37°C，体积分数为5% 的C〇2培养箱中对细胞进行染色，解育20min。用预热的解育缓冲液将细胞进行清洗;最终向 培养板中加入ImL PBS，在巧光显微镜进行拍照。W转染无活性的脱氧核糖iDz的细胞作为 阴性对照，W终浓度为化M的氧化憐酸化抑制剂CCCP预处理20min的细胞为阳性对照。
[0048] 从图7中我们可W看到，脱氧核酶作用后，细胞线粒体中JC-1单体明显增加，而转 染无义脱氧核酶iDz实验组W及单独加入转染试剂GT-D组并没有明显变化。该结果进一步 证明，本发明所设计的脱氧核酶分子通过激活细胞线粒体调亡途径来诱导乳腺癌细胞的调 亡。
[0049] 实施例7
[0050] W2X 105细胞/孔的密度分别将MCF7、MDA-MB-231细胞接种于6孔板中，每孔培养 基2血，预培养2地。W无血清培养基转染化-SA化4-12地，换成完全培养基培养至4她。按照 细胞周期检测试剂盒(上海贝博公司)说明书进行操作:使用质量体积分数为0.25%的膜酶 消化贴壁细胞，2000g离屯、5min，弃上清，细胞采用预冷的PBS洗涂两次，体积分数为75 %的 冰冻乙醇-20°C固定化，然后用冷PBS洗涂一次，并用10化L冷PBS重悬；在上述体系中加入 RNase A溶液20化，37°C水浴30min去除细胞中的RNA;加入300化PI染液，轻轻混匀后4°C避 光解育30min，通过流式细胞仪检测乳腺癌细胞的周期阻滞情况。
[0051] 图8所示，与对照组相比，脱氧核酶化-SALL4-12的转染能够使乳腺癌MCF7细胞系 G2期比率由14.7 %增加到21.8 %，使S阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞G2期阻滞由13.8 %增加 到22%，而转染无义脱氧核酶iDz实验组W及单独加入转染试剂GT-D组细胞G2期含量并无 明显变化。该结果表明，本发明所设计的脱氧核酶分子能够有效实现乳腺癌细胞系的G2期 周期阻滞，实现对肿瘤细胞生长的抑制。
[0化2] 实施例8
[0053] W3X 105细胞/孔的密度分别将MCF7、MDA-MB-231细胞接种于6孔板中，每孔培养 基2mL，预培养2地。待培养板中的细胞生长至培养板面积的90%时，用黄枪头沿直线方向划 出"伤口"，PBS清洗一次W去除细胞碎片。W无血清培养基转染脱氧核酶化-SA化4-12,4h后 换成完全培养基培养。每隔1化用倒置显微镜拍照，并测定单细胞层中"伤口"的间隔距离。
[0054] 从图9中我们可W观察到，与对照组相比，脱氧核酶化-SALL4-12的实验组乳腺癌 细胞的迁移速率显著降低，而转染无义脱氧核酶iDz实验组W及单独加入转染试剂GT-D组 迁移速率无明显变化。该结果表明，本发明所设计的脱氧核酶能够显著抑制乳腺癌细胞的 迁移能力。
[0化5] 实施例9
[0056] W2X 105细胞/孔的密度分别将MCF7、MDA-MB-231细胞接种于6孔板中，每孔培养 基2mL，预培养2地。W无血清培养基转染脱氧核酶化-SA化4-12地，换成完全培养基培养至 4她。使用质量体积分数为0.25%的膜酶消化贴壁细胞，W含有质量体积分数为1 %牛血清 白蛋白的无血清培养基重悬细胞并计数，向孔径为0.祉m的化answell小室的上室加入2 X 1〇4个细胞，在化answell下室中加入6(K)化含有体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基，在 培养箱中培养2地。培养至时间后，用体积分数为75%的冰乙醇4°C固定20min。用一次性的 医用棉签擦除上室中未穿过的细胞，穿过半透膜的细胞用质量分数为0.2%的结晶紫/PBS 溶液染色20min，PBS清洗S次后，W倒置显微镜拍照。
[0057] 从图10中我们可W清楚观察到，与对照组相比，脱氧核酶化-SA化4-12作用后实验 组下室的细胞数量明显减少，而转染无义脱氧核酶iDz实验组W及单独加入转染试剂GT-D 组细胞数量并无明显变化。该结果表明，本发明所设计的脱氧核酶对乳腺癌细胞的浸润能 力有显著的抑制作用。
【主权项】
1. 一种靶向SALL4基因的脱氧核酶分子，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1、 SEQIDN0.2、SEQIDN0.3SSEQIDN0.4K*。2. 权利要求1所述的一种靶向SALL4基因的脱氧核酶分子在乳腺癌基因治疗中的应用。
【文档编号】A61P35/00GK106047874SQ201610383360
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月2日
【发明人】李全顺, 兴振, 王旭, 杨洁冰, 杨艳, 施维
【申请人】吉林大学