川芎α?淀粉酶/枯草杆菌蛋白酶抑制剂基因及表达产物的纯化方法
【专利摘要】本发明公开了一种川芎α?淀粉酶/枯草杆菌蛋白酶抑制剂基因SEQ ID NO.1及其编码的蛋白SEQ ID NO.2，以及表达产物的纯化方法。与水稻(Oryza sativa(L.)Genbank:P29421)α?淀粉酶/枯草杆菌蛋白酶抑制剂的相似性为31.60％。LASI重组蛋白不仅能够有效抑制小菜蛾的α?淀粉酶的活性，抑制率33％，还能够抑制枯草杆菌蛋白酶的活性，抑制率为56.28％。本发明揭示了川芎根茎中一段新的α?淀粉酶/枯草杆菌蛋白酶抑制剂基因序列，这为抗虫/抗菌植物基因工程提供了有效的候选基因。
【专利说明】
川芎α-淀粉酶/枯草杆菌蛋白酶抑制剂基因及表达产物的纯化方法
技术领域
[0001]本发明属于分子生物学和生物技术领域，涉及一条新的川芎α-淀粉酶/枯草杆菌蛋白酶抑制剂基因序列。
【背景技术】
[0002]α-淀粉酶/枯草杆菌蛋白酶(α-amylase/subtilisin inhibitor，ASI)是一种来源于植物的天然生物活性肽，能够抑制摄食鳞翅目昆虫肠道内α-淀粉酶的活性，阻碍鳞翅目昆虫对食物中淀粉及其他糖类化合物的消化吸收，影响鳞翅目昆虫的生长发育，从而起到抗虫作用。由于ASI的分子量较小，且活性明确，因此其是植物抗虫基因工程的候选基因。另外，ASI还能够抑制微生物来源的枯草杆菌蛋白酶的活性，被认为是植物抵抗有害微生物的重要功能基因。因此，获得新的ASI基因资源显得意义重大。
[0003]川考为伞形科藁本属植物川考(Ligusticum chuanx1ng Hort.)的根莖，是四川省的著名道地药材，收载于《神农本草经》，是降糖、降血脂中药复方及中成药的重要组分。本项目组首次从川芎根茎中克隆获得川芎α-淀粉酶/枯草杆菌蛋白酶(Ligusticumchuanx1nga-amylase/subti lisin inhibitor，LASI)基因的cDNA序列，构建含有该基因的大肠杆菌基因工程菌，通过IPTG诱导表达、N1-NTA His Bind层析柱纯化，已成功获得纯度为95 %的LASI重组蛋白。该LASI重组蛋白能够有效抑制小菜蛾的α-淀粉酶活性，抑制率可达33 %。并且LASI重组蛋白还能够抑制枯草杆菌蛋白酶的活性，抑制率为56.28 %。本项目的创新性研究成果已形成具有自主知识产权的LASI基因，这为利用抗虫/抗菌植物基因工程提供了有效的候选基因。
【发明内容】
[0004]鉴于现有研究技术的不足，本发明提供一条新的来源于川芎根茎的具有抗虫活性的α-淀粉酶/枯草杆菌蛋白酶抑制剂(LASI)基因序列，其具体的成果体现为:
[0005]—段川芎α-淀粉酶/枯草杆菌蛋白酶抑制剂LASI基因序列，其特征如序列表SEQID N0.1所示。
[0006]所述基因序列的LASI重组蛋白，其氨基酸如序列表SEQ ID N0.2所示。
[0007]本发明的另一个目的是提供含有LASI基因的大肠杆菌表达载体、LASI基因的表达及表达产物的纯化方法。采用以下的手段:利用SEQ ID N0.1构建原核重组载体获得LASI重组蛋白的方法，转化大肠杆菌形成基因工程菌，通过IPTG诱导表达、N1-NTA His Bind层析柱纯化，获得纯度为95%的LASI重组蛋白，所述LASI重组蛋白能够有效抑制小菜蛾的α-淀粉酶、及枯草杆菌蛋白酶的活性，包括以下步骤:
[0008]a)伞形科植物川芎根茎α-淀粉酶/枯草杆菌蛋白酶抑制剂LASI基因的获得；
[0009]b)LASI原核表达载体构建与表达纯化。
[0010]所述a)步骤包含如下具体工艺:[0011 ] I)提取川芎根茎总RNA，检测j 11芎总RNA质量；
[0012]2)cDNA 的合成；
[0013]3)用分别带有BamHI和EcoRI双酶切位点的引物从川芎cDNA中通过PCR扩增出川芎LASI基因序列。
[0014]所述b)步骤包含如下具体工艺:
[0015]I)将扩增出来的LASI基因序列和pET28-a载体分别用BamHI和EcoRI双酶切消化，获得两端带有粘性末端的片段，用T4DNA连接酶连接两个片段，获得连接好的重组质粒；
[0016]2)取ΙΟμΙ重组质粒转化E.coli Rosetta感受态细胞；将转化成功的重组E.coliRosetta基因工程菌涂布于含有(10mg/L)卡那霉素和氯霉素(25mg/L)的平板中筛选阳性克隆；
[0017]3)将初步筛选出来的重组菌株用菌落PCR和质粒双酶切鉴定后，经测序以确定阅读框的正确，得到预期的重组菌株；
[0018]4)发酵扩大重组菌株
[0019]⑴.LB发酵培养基:蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L;溶解后，高温高压灭菌；
[0020]⑵.发酵条件:37 °C，200rpm将重组菌株培养至0D600?0.6 ；加入IPTG，使其终浓度为 ImM，37 °C 培养 8-1 Oh。
[0021]与目前技术相比，本发明主要具有以下有益效果:本发明提供的LASI基因是从伞形科植物川芎根茎中提取的一条新序列。通过基因工程所获得的LASI重组蛋白不仅对小菜蛾的α-淀粉酶活性有抑制作用，并且对枯草杆菌蛋白酶也具有抑制活性，为抗虫/抗菌植物基因工程提供了候选基因。
【附图说明】
[0022]图1为实验技术流程图。
[0023]图2为重组质粒pET28a_LASI的质粒图谱。
【具体实施方式】
[0024]实施例1:伞形科植物川芎根茎α-淀粉酶/枯草杆菌蛋白酶抑制剂(LASI)基因的获得
[0025]利用OMEGA公司提供的植物RNA提取试剂盒提取川芎根茎总RNA，对提取的j11芎总RNA进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测其提取量和浓度。
[0026]cDNA的合成:以得到的川芎RNA为模板，01 igodT(18)为引物，按照M-MLV逆转录酶说明书逆转录得到cDNA。
[0027]设计两条引物，分别加入保护碱基和相应的限制酶切位点，引物序列B1:CGCGGATCCGATGCATCGCCTGATGCT(BamHI)；B2:CCGGAATTCTCAAACCTTCAAGAACATAACCA(EcoRI) ο
[0028]以反转录得到的cDNA为模板，BI和B2为两条引物进行PCR反应。反应体系如下:Prime Star Mix 25yl，cDNA 2μ1，Β1 1μ1，Β2 lyl，ddH20 21μ1 WCR反应参数为:94°C反应5111；[11，预变性;94°(^1111；[11，66°(^1111；[11，72°02111；[11进行扩增，循环35 次;72 °C 1min 复性;4 °C 反应停止。PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。胶回收600bp左右的扩增带并在其末端加PoIyA尾，将加PoIyA完成的片段连接到pMD19-T载体上，转化E.coli DH5a感受态细胞，将阳性克隆菌送公司测序以确定扩增序列的正确性。用Omega Plasmid Mini Kit I提取LAS1-PMD19-T重组质粒。
[0029]实施例2:LASI原核表达载体构建与表达纯化
[0030]将提取得到的LAS1-pMD19-T重组质粒用限制酶BamHl和EcoRI进行双酶切反应，反应时间4小时，反应温度37 °C，反应体系为BamHI 0.5yl，EcoRI 0.5μ1，10*Κ Buffer 2μ1，LAS1-pMD19-T载体9yl，ddH20 8μ1。反应结束后进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测分离酶切片段，用Gel Extract1n Kit回收600bp左右的清晰DNA条带，获得两端具有酶切粘性末端的LASI基因片段。
[0031]用OmegaPlasmid Mini Kit I提取保存在E.coli DH5a菌株中的pET28a质粒，通过限制酶BamHI和EcoRI进行双酶切反应获得两端为粘性末端的线性质粒，双酶切体系与前段中的一致。双酶切反应之后经琼脂糖凝胶电泳将酶切片段分开，用Gel Extract1n Kit回收长度正确的线性载体片段。
[0032]用T4DNA连接酶将上述带有BamHI和EcoRI酶切位点的LASI基因片段和线性pET28a质粒完成拼接，重新形成环状质粒，如图2所示。将其转化进入E.coli Rosetta感受态菌株。在含有卡那霉素(10mg/L)和氯霉素(25mg/L)的LB固体培养基(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L)上筛选获得阳性重组大肠杆菌，挑取单菌落送至擎科生物技术有限公司测序确定重组质粒拼接的正确性。
[0033]将阳性克隆重组菌在加入在含有卡那霉素(10mg/L)和氯霉素(25mg/L)的LB固体培养基中划线，37°C培养至有单菌落出现。挑取单菌落接种于50ml加入在含有卡那霉素(10mg/L)和氯霉素(25mg/L)的LB液体培养基中，200rmp摇床培养8-10h。将上述菌液按照1:20的比例扩大培养至OD6qq?0.6时，加1?了6(111^)，200印111，37°(:过夜培养(8-1011)，诱导大肠杆菌高效表达LASI重组蛋白。
[0034]取200ml表达的菌液于5000 Xg离心20分钟收集菌体，加入1ml PBS缓冲液(PH7.5)反复吹打沉淀使之重悬。超声波破碎菌体释放LASI蛋白(冰浴超声30min破碎细胞释放蛋白，超声程序为45%功率，超声6s，间歇3s。超声完成后裂解液用液氮冻融一次)。裂解液于13000 Xg离心1min将细胞碎片等杂质去除，保留上清液，4°C备用。取2ml N1-NTAHis Bind亲和树脂装柱，用1ml去离子水洗柱，后用结合液(20mM咪唑、1mM Tris-HClpH7.9、500mM NaCl)洗柱3_5次，每次Iml。取4ml上清液经0.45μπι孔径滤膜过滤后加入到N1-NTA His Bind层析柱上，使其靠重力自然留出。用结合液将层析柱中的杂蛋白洗下来，每次2ml，洗4次。之后用2ml咪唑浓度为200mM的洗脱液洗脱LASI重组蛋白。对含有LASI重组蛋白的洗脱液进行透析，透析液组成为0.05mM Tris-HCl (pH7.4)、10 %甘油，透析袋分子量为8000-14000。每12h换一次液，透析2天后，收集透析袋中的蛋白液，-20°C保存备用。
[0035]实施例3:LASI重组蛋白抑制小菜蛾的α-淀粉酶，及枯草杆菌蛋白酶的活性。
[0036]I )LASI对小菜蛾α-淀粉酶的抑制活性
[0037]⑴小菜蛾α-淀粉酶粗提液的制备
[0038]小菜蛾均购自河南白云生物农药公司。将小菜蛾幼虫(4-5龄)加入液氮研磨，加入
0.15Μ NaCl进行匀浆，后用lOOOOrpm，10分钟离心得上清即为小菜蛾α-淀粉酶粗提液。
[0039](2)LASI对小菜蛾α-淀粉酶活性的抑制作用
[0040]①25μ1小菜蛾α-淀粉酶粗提液(蛋白浓度以10mg/ml计算)与50μ1LASI重组蛋白(蛋白浓度以0.783mg/ml计算)混合均勾后，37°C处理1min;
[0041 ]②将①的混合液加入到1ml 0.15%可溶性淀粉溶液(内含0.15% (v/w)可溶性淀粉，50mM的醋酸钠缓冲液(pH5.0)，ImM CaCl2)中，37°C处理1min ；
[0042]③取200μ1反应液，加入750μ1反应终止液(内含0.05M HCl，180mg KI/ml，18mg12/ml)，终止反应;混合均匀后测定640nm波长下的吸光度；
[0043]④以不加入LASI的反应管对照。
[0044]2)LASI对枯草杆菌蛋白酶的抑制活性
[0045]⑴ΙΟμΙ枯草杆菌蛋白酶(lmg/ml，CAS编号9014-01-1)和ΙΟμΙ LASI重组蛋白(蛋白浓度为0.783mg/ml计算)在37°C混合、保温1min。将混合液加入到Iml牛血清白蛋白(Img/ml)溶液中，37 °C反应I Omin，使用BCA试剂盒测定剩余蛋白含量。
[0046]⑵以不加入LASI的反应管对照。
【主权项】
1.一段川芎α-淀粉酶/枯草杆菌蛋白酶抑制剂LASI基因序列，其特征如序列表SEQ IDN0.1所示。2.权利要求1所述基因序列的LASI重组蛋白，其氨基酸如序列表SEQID N0.2所示。3.利用SEQID N0.1构建原核重组载体获得LASI重组蛋白的方法，转化大肠杆菌形成基因工程菌，通过IPTG诱导表达、N1-NTA His Bind层析柱纯化，获得纯度为95%的LASI重组蛋白，所述LASI重组蛋白能够有效抑制小菜蛾的α-淀粉酶、及枯草杆菌蛋白酶的活性，包括以下步骤: a)伞形科植物j11芎根茎α-淀粉酶/枯草杆菌蛋白酶抑制剂LASI基因的获得； b)LASI原核表达载体构建与表达纯化。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，a)步骤包含如下具体工艺: 1)提取川芎根茎总RNA，检测j11芎总RNA质量； 2)cDNA的合成； 3)用分别带有BamHI和EcoRI双酶切位点的引物从川芎cDNA中通过PCR扩增出川芎LASI基因序列。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，b)步骤包含如下具体工艺: 1)将扩增出来的LASI基因序列和pET28-a载体分别用BamHI和EcoRI双酶切消化，获得两端带有粘性末端的片段，用T4DNA连接酶连接两个片段，获得连接好的重组质粒； 2)取ΙΟμΙ重组质粒转化E.coliRosetta感受态细胞；将转化成功的重组E.co IiRosetta基因工程菌涂布于含有(10mg/L)卡那霉素和氯霉素(25mg/L)的平板中筛选阳性克隆； 3)将初步筛选出来的重组菌株用菌落PCR和质粒双酶切鉴定后，经测序以确定阅读框的正确，得到预期的重组菌株； 4)发酵扩大重组菌株: ⑴.LB发酵培养基:蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L;溶解后，高温高压灭菌； ⑵.发酵条件:37 °C，200rpm将重组菌株培养至0D600?0.6;加入IPTG，使其终浓度为ImM，37 °C 培养 8-1 Oh。
【文档编号】C12N15/29GK106047892SQ201610552488
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年7月14日
【发明人】廖海, 周嘉裕, 俞继华, 李洋洋, 向缅, 朱建全
【申请人】西南交通大学